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(atualização 6/07/2020)
Este artigo aborda
o Que é um hemocytometer
O hemocytometer é uma câmara de contagem de dispositivo projetado originalmente para a contagem de células do sangue (o nome “hemo” significa sangue). O hemocitómetro é como uma lâmina espessa com uma grelha gravada., Quando a cobertura é colocada no hemocitómetro, a cobertura manteve a amostra numa altura específica (normalmente 0,1 mm).
A grade também tem dimensões específicas, portanto, o volume na câmara pode ser calculado. Uma vez que você pode contar o número de células na área de grades e o volume é conhecido, a concentração de células na amostra pode ser determinada facilmente. Abaixo está uma ilustração de um hemocitómetro.,
Como usar um hemocytometer a contagem de células
- Preparar a amostra
Misturar o exemplo bem antes de tomar amostras. Evitar papeira.a concentração das células não deve ser demasiado elevada ou demasiado baixa. Se a concentração celular for muito elevada, é difícil contar as células visualmente sob o microscópio. Se a concentração celular é muito baixa, você precisa contar mais quadrados e talvez mais vezes para evitar os erros estatísticos., Se a concentração celular for muito alta, tente fazer 1:10, 1:100, 1:1000 diluições em série (ver a ilustração abaixo).
- Calculando a concentração celular
para calcular o número de células por mL: tome a contagem média de células de cada um dos conjuntos de 16 quadrados de canto. Multiplica por 10 mil. O valor final é o número de células/mL na suspensão da célula original se não houver diluição. Neste caso, o número médio de células que calculou acima é de 4, 5, multiplicando-se por 10, 000., Portanto, 4, 5 * 10, 000 = 45, 000. A concentração é de 45 000 células / mL. Se esta for uma diluição de 10 vezes, terá de multiplicar por 10; trazê-la de volta para 450 000 células/mL.
Você também pode ver um vídeo demo aqui.
introduzir suspensão celular
colocar a tampa sobre a superfície de contagem. Introduzir a suspensão da célula (10 µL ou uma gota) a partir do bordo do tubo de cobertura com uma pipeta de transferência de ponta fina. A força capilar irá arrastar o líquido para encher a área sob a cobertura. Deve ser introduzido líquido suficiente para que a superfície de contagem seja apenas coberta.,contagem das células
usando um microscópio, foco nas linhas da grelha da área de contagem com um objectivo de 5-10x. Contar as células num conjunto de 16 quadrados (1×1 mm de área quadrada; a área azul). Devias estabelecer uma regra de contagem.
Por exemplo, conte as células na linha superior e esquerda de um quadrado (marcado pela linha verde), mas não conte as células na linha inferior e os direitos de um quadrado (marcado pela linha vermelha). Mova o hemocitómetro para o próximo conjunto de 16 quadrados de canto e continue a contar até que todos os 4 conjuntos de 16 quadrados sejam contados., Veja a figura abaixo como um exemplo, os números das células de 4 conjuntos de 16 quadrados são 3, 5, 6, 4, respectivamente. Portanto, o número médio de células desta contagem é (3+5+6+4)/4 = 4.5
como utilizar um hemocitómetro para determinar a viabilidade celular
O Azul de Tripan é um corante utilizado para distinguir entre células vivas e células mortas. É uma mancha vital que não é absorvida por células viáveis saudáveis, mas mancha células com uma membrana celular danificada. Portanto, apenas células mortas podem ser manchadas como azuis e podem ser vistas sob o microscópio., Este método é referido como o método de exclusão do corante.
Para determinar a viabilidade celular, usamos o mesmo método, como a célula de contagem. A única diferença é que você precisa misturar a suspensão celular com corante azul de Trypan antes de introduzir a suspensão celular no hemocitómetro. Vamos começar!1. Fazendo diluições apropriadas como o que discutimos acima, diluições apropriadas tornarão sua vida de contagem mais fácil. Demasiado ou muito pouco de células não é bom para contar.
2., Mistura de igual volume de suspensão celular e de Corante Azul de Trípano
a concentração de azul de Trípano é de 0, 4% (M/M). A concentração de trabalho é de 0,2%; essa é a razão pela qual misturamos volume igual de suspensão celular com volume igual de 0,4% de azul de Trypan. Lembre-se que a sua concentração celular agora é diluída 2 vezes!
3. Introduzir a suspensão celular colocar a tampa de cobertura sobre a superfície de contagem. Introduzir a suspensão da célula (10 µL ou uma gota) a partir do bordo do tubo de cobertura com uma pipeta de transferência de ponta fina. Aguarde 1 minuto para que as células se instalem.
4., Contando a viabilidade celular usando um microscópio, foco nas linhas de grade da área de contagem com um objetivo de 5-10x. Agora você pode ver algumas células são transparentes, brilhantes, com forma redonda e lisa. São células saudáveis e vivas. Você também pode ver algumas células são azuis no interior, com um contorno realmente áspero em sua forma. Estas células não são saudáveis e mortas. Depois que você está confiante para distingui-los, você pode começar a contar o número de células vivas e células mortas. tomemos um exemplo da imagem abaixo. as contagens de células vivas (glóbulos brancos) são (2, 5, 5, 3) em 4 quadrados azuis claros.,
As contagens médias de células vivas são (2+5+5+3)/4 = 3.75.
As contagens de células mortas (células azuis) são (1, 0, 1, 1) em 4 quadrados azuis claros.
A contagem média de células mortas é (1+0+1+1)/4 = 0.75ortanto, a viabilidade celular é calculada como:
: 3.75 / (3.75+0.75) = 0.83, o que é 83%.
Hemocytometer aplicações
Estimativa de tamanho de célula
Devido a grade tem uma dimensão específica, algumas linhas são de 0,25 mm entre”, algumas linhas são 0.,05 mm no meio (ver a imagem abaixo). Portanto, você pode facilmente estimar o tamanho das células. Se você quiser determinar o tamanho da célula mais precisamente, você pode tirar uma foto da imagem sob o microscópio. Em seguida, use softwares como a imagem J, onde você pode dizer ao software “um comprimento fixo é igual a 1 mm”. Ele irá converter e calcular o tamanho da célula para você.
Realizar uma contagem de glóbulos
O hemocytometer inicialmente foi projetado para a contagem de sangue., O nosso sangue consiste em glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas. O número de células e a composição de cada tipo de células podem informar um médico do seu estado de saúde corporal. Por exemplo, a baixa contagem de glóbulos vermelhos causa sensação de fadiga e fraqueza (anemia). Um aumento no número de glóbulos brancos pode indicar infecção, alergia, inflamação ou outras doenças. Portanto, um hemocitómetro é uma ferramenta muito importante no laboratório de testes médicos devido à sua capacidade de contar o número de células e a composição de cada tipo de célula.,
realizar a contagem de células para cultura de células
Quando eu crescer células no laboratório, eu preciso mudar o meio celular a cada dois dias (depende de quão rápido as células crescem). Depois que as células aderentes crescem para ocupar 95% da superfície de um prato, é hora de “passagem” células para outro prato. O que fazemos é separar as células, fazer uma suspensão homogénea, e contar o número de células. O número de células é muito importante para a cultura celular. As células podem não crescer muito bem ou morrer se você tiver muito poucas células em um prato. Assim, a capacidade de contar o número de células é uma habilidade fundamental para a cultura celular., Amazon é um bom lugar para começar. Você pode encontrar uma variedade de hemocitómetros com diferentes gamas de preços e qualidades na Amazon. A Rs’ Science também oferece um “all in one kit” que vem com um hemocitômetro, cobertura, Azul de Trypan e azul de metileno para avaliar a viabilidade celular e frascos de amostra, pipetas de transferência de ponta fina, livreto de papel de lente. Tudo o que precisas de começar está num kit.
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