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(mise à jour 6/07/2020)
Cet article couvre
qu’est Ce qu’un hémocytomètre
L’un hémocytomètre est une chambre de comptage appareil conçu à l’origine pour le comptage des cellules sanguines (le nom de « hemo” signifie le sang). L’hémocytomètre est comme une lame d’échantillon épaisse avec une grille gravée dessus., Lorsque la lamelle est placée sur l’hémocytomètre, la lamelle maintient l’échantillon à une hauteur spécifique (typiquement 0,1 mm).
la grille a également des dimensions spécifiques, par conséquent, le volume dans la chambre peut être calculé. Puisque vous pouvez compter le nombre de cellules dans la zone de grilles et le volume est connu, la concentration des cellules dans l’échantillon peut être déterminée facilement. Voici une illustration d’un hémocytomètre.,
Comment utiliser un hémocytomètre à compter les cellules
- la Préparation de l’échantillon
le Mélange de l’échantillon bien avant de prendre les échantillons. Éviter la formation de grumeaux.
- Faire des dilutions appropriées
La concentration de cellules ne doit pas être trop élevée ou trop faible. Si la concentration cellulaire est trop élevée, il est difficile de compter les cellules visuellement au microscope. Si la concentration cellulaire est trop faible, vous devez compter plus de carrés et peut-être plus de fois pour éviter les erreurs statistiques., Si la concentration cellulaire est trop élevée, essayez de faire 1:10, 1:100, 1:1000 dilutions en série (voir l’illustration ci-dessous).
- Introduction de la suspension cellulaire
placez la lamelle sur la surface de comptage. Introduire la suspension cellulaire (10 µL ou une goutte) à partir du bord de la lamelle à l’aide d’une pipette de transfert à pointe fine. La force capillaire fera glisser le liquide pour remplir la zone sous la lamelle. Suffisamment de liquide doit être introduit pour que la surface de comptage soit simplement recouverte.,
- comptage des cellules
à l’aide d’un microscope, concentrez-vous sur les lignes de la grille de la zone de comptage avec un objectif 5-10x. Comptez les cellules dans un ensemble de 16 carrés (zone carrée de 1×1 mm; la zone bleue). Vous devriez définir une règle de comptage.
par exemple, comptez les cellules sur les lignes supérieure et gauche d’un carré (marquées par la ligne verte), mais ne comptez pas les cellules sur les lignes inférieure et droite d’un carré (marquées par la ligne rouge). Déplacez l’hémocytomètre vers le prochain ensemble de 16 carrés d’angle et continuez à compter jusqu’à ce que les 4 ensembles de 16 carrés soient comptés., Prenez la photo ci-dessous à titre d’exemple, les nombres de cellules de 4 ensembles de 16 carrés sont respectivement 3, 5, 6, 4. Par conséquent, le nombre moyen de cellules de ce comptage est (3+5+6+4)/4 = 4.5
- calcul de la concentration cellulaire
pour calculer le nombre de cellules par mL: prenez le nombre moyen de cellules de chacun des ensembles de 16 carrés d’angle. Multipliez par 10 000. La valeur finale est le nombre de cellules/mL dans la suspension cellulaire d’origine s’il n’y a pas de dilution. Dans ce cas, le nombre moyen de cellules que vous avez calculé ci-dessus est de 4,5, puis multipliez par 10 000., Par conséquent, 4,5*10 000 = 45 000. La concentration est de 45 000 cellules / mL. S’il s’agit d’une dilution de 10 fois, vous devrez multiplier par 10; ramenez-le à 450 000 cellules/mL.
Vous pouvez également voir une vidéo de démonstration ici.
Comment utiliser un hémocytomètre pour déterminer la viabilité cellulaire
bleu Trypan est un colorant utilisé pour distinguer entre les vivants et les cellules mortes. C’est une tache vitale qui n’est pas absorbée par les cellules viables saines, mais tache les cellules avec une membrane cellulaire endommagée. Par conséquent, seules les cellules mortes peuvent être colorées en bleu et peuvent être vues au microscope., Cette méthode est appelée méthode d’exclusion des colorants.
Pour déterminer la viabilité des cellules, nous utilisons la même méthode que pour le comptage des cellules. La seule différence est que vous devez mélanger la suspension cellulaire avec du colorant bleu Trypan avant d’introduire la suspension cellulaire dans l’hémocytomètre. Nous allons commencer!
1. Faire des dilutions appropriées
comme ce que nous avons discuté ci-dessus, des dilutions appropriées rendront votre vie de comptage plus facile. Trop ou trop peu de cellules n’est pas bon pour compter.
2., En mélangeant un volume égal de suspension cellulaire et celui de colorant bleu Trypan
la concentration de bleu Trypan est de 0,4% (p/p). La concentration de travail est de 0,2%; c’est la raison pour laquelle nous mélangeons un volume égal de suspension cellulaire avec un volume égal de 0,4% de trypan bleu. Rappelez-vous que votre concentration cellulaire est maintenant diluée 2 fois!
3. Introduction de la suspension cellulaire
placez la lamelle sur la surface de comptage. Introduire la suspension cellulaire (10 µL ou une goutte) à partir du bord de la lamelle à l’aide d’une pipette de transfert à pointe fine. Attendez 1 min pour permettre aux cellules de se déposer.
4., Comptage de la viabilité cellulaire
à l’aide d’un microscope, concentrez-vous sur les lignes de la grille de la zone de comptage avec un objectif 5-10x. Maintenant, vous pouvez voir que certaines cellules sont transparentes, brillantes, avec une forme ronde et lisse. Ce sont des cellules saines et vivantes. Vous pouvez également voir que certaines cellules sont bleues à l’intérieur, avec un contour vraiment rugueux dans leur forme. Ce sont des cellules mortes et malsaines. Une fois que vous êtes confiant de les distinguer, vous pouvez commencer à compter le nombre de cellules vivantes et de cellules mortes.
prenons un exemple de l’image ci-dessous.
Le nombre de cellules vivantes (cellules blanches) est (2, 5, 5, 3) dans 4 carrés bleu clair.,
Le nombre moyen de cellules vivantes est (2+5+5+3)/4 = 3.75.
Le nombre de cellules mortes (cellules bleues) est (1, 0, 1, 1) dans 4 carrés bleu clair.
Le nombre moyen de cellules mortes est (1+0+1+1)/4 = 0.75
par conséquent, la viabilité cellulaire est calculée comme suit:
: 3.75 / (3.75+0.75) = 0.83, ce qui est 83%.
applications de L’hémocytomètre
estimer la taille de la cellule
étant donné que la grille a une dimension spécifique, certaines lignes sont 0,25 mm Entre; sont 0.,05 mm entre les deux (voir l’image ci-dessous). Donc, vous pouvez facilement estimer la taille des cellules. Si vous souhaitez déterminer la taille de la cellule plus précisément, vous pouvez prendre une photo de l’image au microscope. Ensuite, utilisez des logiciels tels que image J, où vous pouvez dire au Logiciel « une longueur fixe est égale à 1 mm ». Il va convertir et calculer la taille de la cellule pour vous.
Effectuer une numération des globules
L’un hémocytomètre d’abord été conçu pour la numération sanguine., Notre sang se compose de globules rouges, de globules blancs et de plaquettes. Le nombre de cellules et la composition de chaque type de cellules peuvent indiquer à un médecin votre état de santé. Par exemple, un faible taux de globules rouges provoque des sensations de fatigue et de faiblesse (anémie). Une augmentation du nombre de globules Blancs peut indiquer une infection, une allergie, inflammation ou d’autres maladies. Par conséquent, un hémocytomètre est un outil très important dans le laboratoire de test médical en raison de sa capacité à compter le nombre de cellules et la composition de chaque type de cellule.,
effectuer le comptage des cellules pour la culture cellulaire
lorsque je cultive des cellules en laboratoire, je dois changer le milieu cellulaire tous les deux jours (cela dépend de la vitesse de croissance des cellules). Après que les cellules adhérentes se développent pour occuper 95% de la surface d’un plat, il est temps de « passer” les cellules vers un autre plat. Ce que nous faisons est de détacher les cellules, faire une suspension homogène, et de compter le nombre de cellules. Le nombre de cellules est très important pour la culture cellulaire. Les cellules peuvent ne pas se développer très bien ou mourir si vous avez trop peu de cellules dans un plat. Par conséquent, la capacité de compter le nombre de cellules est une compétence fondamentale pour la culture cellulaire.,
Où acheter un hémocytomètre
Amazon est un bon endroit pour commencer. Vous pouvez trouver une variété d’hémocytomètres avec différentes gammes de prix et qualités chez Amazon. Rs ‘Science propose également un” kit tout-en-un » qui comprend un hémocytomètre, une lamelle, un bleu de Trypan et un bleu de méthylène pour évaluer la viabilité cellulaire et les flacons d’échantillons, des pipettes de transfert à pointe fine, un livret de papier pour lentilles. Tout ce dont vous avez besoin pour commencer est dans un kit.
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