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(aggiornamento 6/07/2020)
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che Cosa è un emocitometro
L’emocitometro è una camera di conteggio dispositivo originariamente progettato per il conteggio delle cellule del sangue (il nome “emo” mezzo sangue). L’emocitometro è come un vetrino spesso con una griglia incisa su di esso., Quando il coprioggetto viene posizionato sull’emocitometro, il coprioggetto tiene il campione ad un’altezza specifica (tipicamente 0,1 mm).
La griglia ha anche dimensioni specifiche, quindi è possibile calcolare il volume nella camera. Poiché è possibile contare il numero di celle nell’area delle griglie e il volume è noto, la concentrazione di celle nel campione può essere determinata facilmente. Di seguito è riportata un’illustrazione di un emocitometro.,
Come usare un emocitometro per contare le cellule
- Preparare il campione
Mescolare bene il campione prima di prelevare i campioni. Evitare grumi.
- Effettuare diluizioni appropriate
La concentrazione delle cellule non deve essere troppo alta o troppo bassa. Se la concentrazione cellulare è troppo alta, è difficile contare le cellule visivamente al microscopio. Se la concentrazione cellulare è troppo bassa, è necessario contare più quadrati e forse più volte per evitare gli errori statistici., Se la concentrazione cellulare è troppo alta, prova a fare 1:10, 1:100, 1:1000 diluizioni seriali (vedere l’illustrazione sotto).
- Introduzione della sospensione della cella
Posizionare il coprioggetti sulla superficie di conteggio. Introdurre la sospensione cellulare (10 µL o una goccia) dal bordo del coprioggetto con una pipetta di trasferimento a punta fine. La forza capillare trascinerà il liquido per riempire l’area sotto il coprioggetto. Dovrebbe essere introdotto abbastanza liquido in modo che la superficie di conteggio sia appena coperta.,
- Conteggio delle celle
Utilizzando un microscopio, concentrarsi sulle linee della griglia dell’area di conteggio con un obiettivo 5-10x. Contare le celle in un set di 16 quadrati (area quadrata 1×1 mm; l’area blu). È necessario impostare una regola di conteggio.
Ad esempio, contare le celle sulle linee superiore e sinistra di un quadrato (contrassegnato dalla linea verde), ma non contare le celle sulle linee inferiore e destra di un quadrato (contrassegnato dalla linea rossa). Spostare l’emocitometro al successivo set di 16 quadrati d’angolo e continuare a contare fino a quando vengono contati tutti i 4 set di 16 quadrati., Prendi la foto qui sotto come esempio, i numeri di cella di 4 serie di 16 quadrati sono 3, 5, 6, 4, rispettivamente. Pertanto, il numero medio di celle di questo conteggio è (3+5+6+4)/4 = 4.5
- Calcolo della concentrazione di cellule
Per calcolare il numero di cellule per mL: prendere il conteggio medio delle cellule da ciascuno degli insiemi di 16 quadrati d’angolo. Moltiplicare per 10.000. Il valore finale è il numero di cellule / mL nella sospensione cellulare originale se non vi è diluizione. In questo caso, il numero di cella medio calcolato sopra è 4.5, quindi moltiplicare per 10.000., Pertanto, 4,5 * 10.000 = 45.000. La concentrazione è di 45.000 cellule / mL. Se si tratta di una diluizione di 10 volte, sarà necessario moltiplicare per 10; riportarlo a 450.000 celle/mL.
È anche possibile vedere un video demo qui.
Come usare un emocitometro per determinare la vitalità cellulare
Il Trypan blue è un colorante usato per distinguere tra cellule vive e morte. È una macchia vitale che non viene assorbita da cellule vitali sane, ma macchia le cellule con una membrana cellulare danneggiata. Pertanto, solo le cellule morte possono essere macchiate di blu e possono essere viste al microscopio., Questo metodo è indicato come il metodo di esclusione del colorante.
Per determinare la vitalità della cella, usiamo lo stesso metodo del conteggio delle celle. L’unica differenza è che è necessario mescolare la sospensione cellulare con Trypan blue dye prima di introdurre la sospensione cellulare nell’emocitometro. Cominciamo!
1. Fare diluizioni appropriate
Come quello che abbiamo discusso sopra, diluizioni appropriate renderà la vostra vita di conteggio più facile. Troppo o troppo poco di cellule non è buono per il conteggio.
2., Miscelazione uguale volume di sospensione cellulare e quello di Trypan blue dye
La concentrazione di Trypan blue è 0,4% (w/w). La concentrazione di lavoro è dello 0,2%; questo è il motivo per cui mescoliamo lo stesso volume di sospensione cellulare con un volume uguale di 0,4% Trypan blue. Ricorda che la tua concentrazione cellulare ora è diluita 2 volte!
3. Introdurre la sospensione cellulare
Posizionare il coprioggetto sulla superficie di conteggio. Introdurre la sospensione cellulare (10 µL o una goccia) dal bordo del coprioggetto con una pipetta di trasferimento a punta fine. Attendere 1 min permettendo alle cellule di stabilirsi.
4., Contando la vitalità cellulare
Utilizzando un microscopio, concentrarsi sulle linee della griglia dell’area di conteggio con un obiettivo 5-10x. Ora puoi vedere alcune cellule sono trasparenti, lucide, con forma rotonda e liscia. Queste sono cellule sane e vive. È anche possibile vedere alcune cellule sono blu all’interno, con un contorno davvero ruvida nella loro forma. Queste sono cellule malsane e morte. Dopo che sei sicuro di distinguerli, puoi iniziare a contare il numero di cellule vive e cellule morte.
Prendiamo un esempio della foto qui sotto.
I conteggi delle cellule vive (globuli bianchi) sono (2, 5, 5, 3) in 4 quadrati azzurri.,
I conteggi medi delle cellule vive sono (2+5+5+3)/4 = 3.75.
I conteggi delle cellule morte (cellule blu) sono (1, 0, 1, 1) in 4 quadrati blu chiaro.
Il conteggio medio delle cellule morte è (1+0+1+1)/4 = 0.75
Pertanto la vitalità cellulare è calcolata come:
: 3.75 / (3.75+0.75) = 0.83, che è 83%.
Emocitometro applicazioni
Stimare la dimensione della cella
Perché la griglia è una dimensione specifica, alcune linee sono 0,25 mm tra; alcune linee sono 0.,05 mm in mezzo (vedere l’immagine qui sotto). Pertanto, è possibile stimare facilmente la dimensione delle celle. Se si desidera determinare la dimensione della cella in modo più preciso, è possibile scattare una foto dell’immagine al microscopio. Quindi, utilizzare software come image J, dove è possibile dire al software”una lunghezza fissa è uguale a 1 mm”. Sarà convertire e calcolare la dimensione della cella per voi.
Eseguire un conteggio delle cellule del sangue
L’emocitometro inizialmente è stato progettato per il conteggio del sangue., Il nostro sangue è costituito da globuli rossi, globuli bianchi e piastrine. Il numero di cella e la composizione di ogni tipo di cella può dire a un dottore la Sua condizione di salute di corpo. Ad esempio, un basso numero di globuli rossi causa sentimenti di affaticamento e debolezza (anemia). Un aumento del numero di globuli bianchi può indicare infezione, allergia, infiammazione o altre malattie. Pertanto, un emocitometro è uno strumento molto importante nel laboratorio di test medico a causa della sua capacità di contare il numero di cellule e la composizione di ciascun tipo di cellula.,
Esegui il conteggio delle cellule per la coltura cellulare
Quando coltivo cellule in laboratorio, ho bisogno di cambiare il mezzo cellulare ogni paio di giorni (dipende da quanto velocemente crescono le cellule). Dopo che le cellule aderenti crescono fino ad occupare il 95% della superficie di un piatto, è il momento di “passare” le cellule ad un altro piatto. Quello che facciamo è staccare le cellule, creare una sospensione omogenea e contare il numero di cellule. Il numero di cellule è molto importante per la coltura cellulare. Le cellule potrebbero non crescere molto bene o morire se hai troppo poche cellule in un piatto. Quindi, la capacità di contare il numero di cellule è un’abilità fondamentale per la coltura cellulare.,
Dove acquistare un emocitometro
Amazon è un buon punto di partenza. Puoi trovare una varietà di emocitometri con diverse fasce di prezzo e qualità su Amazon. Rs ‘Science offre anche un” all in one kit” che viene fornito con un emocitometro, coprioggetti, blu di tripano e blu di metilene per valutare la vitalità cellulare e fiale del campione, pipette di trasferimento punta fine, lente libretto di carta. Tutte le cose di cui hai bisogno per iniziare sono in un unico kit.
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