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(actualización 6/07/2020)
qué es un hemocitómetro
el hemocitómetro es un dispositivo de cámara de conteo diseñado originalmente para contar células sanguíneas (el nombre «hemo» significa sangre). El hemocitómetro es como un portaobjetos grueso con una rejilla grabada en él., Cuando el cubreobjetos se coloca en el hemocitómetro, el cubreobjetos mantiene la muestra en una altura específica (normalmente 0,1 mm).
la cuadrícula también tiene dimensiones específicas, por lo tanto, se puede calcular el volumen en la cámara. Dado que se puede contar el número de células en el área de las rejillas y se conoce el volumen, la concentración de células en la muestra se puede determinar fácilmente. A continuación se muestra una ilustración de un hemocitómetro.,
Cómo utilizar un hemocitómetro para contar las células
- Preparación de la muestra
Mezclar la muestra antes de tomar las muestras. Evite los grumos.
- haciendo diluciones apropiadas
la concentración de células no debe ser demasiado alta o demasiado baja. Si la concentración celular es demasiado alta, es difícil contar las células visualmente bajo el microscopio. Si la concentración celular es demasiado baja, necesita contar más cuadrados y quizás más veces para evitar los errores estadísticos., Si la concentración celular es demasiado alta, trate de hacer 1:10, 1:100, 1:1000 diluciones en serie (ver la ilustración a continuación).
- introduciendo la suspensión celular
coloque el cubreobjetos sobre la superficie de conteo. Introduzca la suspensión celular (10 µL o una gota) desde el borde de la cubreobjetos con una pipeta de transferencia de punta fina. La fuerza capilar arrastrará el líquido para llenar el área debajo del cubreobjetos. Se debe introducir suficiente líquido para que la superficie de conteo esté Cubierta.,
- contando las células
usando un microscopio, enfóquese en las líneas de cuadrícula del área de conteo con un objetivo de 5-10x. Cuente las celdas en un conjunto de 16 cuadrados (área cuadrada de 1×1 mm; el área azul). Deberías establecer una regla de conteo.
Por ejemplo, cuente las celdas en las líneas superior e izquierda de un cuadrado (marcadas con la línea verde), pero no cuente las celdas en las líneas inferior y derecha de un cuadrado (marcadas con la línea roja). Mueva el hemocitómetro al siguiente conjunto de 16 cuadrados de esquina y continúe contando hasta que se cuenten los 4 conjuntos de 16 cuadrados., Tome la imagen a continuación como ejemplo, los números de celda de 4 conjuntos de 16 cuadrados son 3, 5, 6, 4, respectivamente. Por lo tanto, el número de celda promedio de este conteo es (3+5+6+4)/4 = 4.5
- calcular la concentración de células
para calcular el número de células por mL: Tome el recuento promedio de células de cada uno de los conjuntos de 16 cuadrados de esquina. Multiplicar por 10.000. El valor final es el número de células / mL en la suspensión celular original Si no hay dilución. En este caso, el número de celda promedio que calculó anteriormente es 4.5, luego multiplique por 10,000., Por lo tanto, 4.5*10,000 = 45,000. La concentración es de 45.000 células / mL. Si se trata de una dilución de 10 veces, tendrá que multiplicar por 10; volver a 450.000 células/mL.también puede ver un video de demostración aquí.
cómo usar un hemocitómetro para determinar la viabilidad celular
Trypan blue es un tinte utilizado para distinguir entre células vivas y muertas. Es una mancha vital que no es absorbida por células viables sanas, sino que tiñe células con una membrana celular dañada. Por lo tanto, solo las células muertas se pueden teñir de azul y se pueden ver bajo el microscopio., Este método se conoce como el método de exclusión de tinte.
para determinar la viabilidad celular, utilizamos el mismo método que el conteo celular. La única diferencia es que es necesario mezclar la suspensión celular con el tinte azul Tripano antes de introducir la suspensión celular en el hemocitómetro. ¡Empecemos!
1. Hacer diluciones apropiadas
Al igual que lo que discutimos anteriormente, las diluciones apropiadas harán que su vida de conteo sea más fácil. Demasiado o muy poco de células no es bueno para contar.
2., Mezclando el mismo volumen de suspensión celular y el del tinte azul de Tripano
la concentración de azul de Tripano es 0.4% (p / p). La concentración de trabajo es de 0.2%; es por eso que mezclamos igual volumen de suspensión celular con un volumen igual de 0.4% Trypan blue. Recuerde que su concentración celular ahora se diluye 2 veces!
3. Introducción de cell suspension
coloque el cubreobjetos sobre la superficie de conteo. Introduzca la suspensión celular (10 µL o una gota) desde el borde de la cubreobjetos con una pipeta de transferencia de punta fina. Espere 1 minuto permitiendo que las células se asienten.
4., Contando la viabilidad celular
usando un microscopio, enfóquese en las líneas de cuadrícula del área de conteo con un objetivo de 5-10x. Ahora se puede ver que algunas células son transparentes, brillantes, con forma redonda y lisa. Estas son células sanas y vivas. También se puede ver que algunas células son azules en su interior, con un contorno muy áspero en su forma. Estas son células enfermas y muertas. Después de que esté seguro de distinguirlos, puede comenzar a contar el número de células vivas y células muertas. tomemos un ejemplo de la imagen de abajo. los recuentos de células vivas (células blancas) son (2, 5, 5, 3) en 4 cuadrados azules claros.,
los conteos medios de células vivas son (2+5+5+3)/4 = 3.75. los recuentos de células muertas (células azules) son (1, 0, 1, 1) en 4 cuadrados azules claros.el recuento promedio de células muertas es (1+0+1+1)/4 = 0.75
Por lo tanto, la viabilidad celular se calcula como:
: 3.75 / (3.75+0.75) = 0.83, que es el 83%.
aplicaciones de hemocitómetro
estimar el tamaño de la celda
debido a que la cuadrícula tiene una dimensión específica, algunas líneas las líneas son 0.,05 mm en el medio (ver la imagen de abajo). Por lo tanto, puede estimar fácilmente el tamaño de las celdas. Si desea determinar el tamaño de la celda con mayor precisión, puede tomar una foto de la imagen bajo el microscopio. Luego, use softwares como image J, donde puede decirle al software «una longitud fija es igual a 1 mm». Convertirá y calculará el tamaño de la celda por usted.
Realizar un conteo de células sanguíneas
El hemocitómetro inicialmente fue diseñado para el conteo de la sangre., Nuestra sangre se compone de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. El número de células y la composición de cada tipo de células pueden decirle a un médico su condición de salud corporal. Por ejemplo, el bajo recuento de glóbulos rojos causa sensación de fatiga y debilidad (anemia). Un aumento en el número de glóbulos blancos puede indicar infección, alergia, inflamación u otras enfermedades. Por lo tanto, un hemocitómetro es una herramienta muy importante en el laboratorio de pruebas médicas debido a su capacidad para contar el número de células y la composición de cada tipo de célula.,
realizar un recuento celular para el cultivo celular
Cuando cultivo células en el laboratorio, necesito cambiar el medio celular cada dos días (depende de la velocidad de crecimiento de las células). Después de que las células adherentes crecen hasta ocupar el 95% de la superficie de un plato, es hora de «pasar» las células a otro plato. Lo que hacemos es separar las células, hacer una suspensión homogénea, y contar el número de células. El número de células es muy importante para el cultivo celular. Las células pueden no crecer muy bien o morir si usted tiene muy pocas células en un plato. Por lo tanto, la capacidad de contar el número de células es una habilidad fundamental para el cultivo celular.,
dónde comprar un hemocitómetro
Amazon es un buen lugar para comenzar. Puede encontrar una variedad de hemocitómetros con diferentes rangos de precios y calidades en Amazon. Rs ‘Science también ofrece un» kit todo en uno » que viene con un hemocitómetro, cubreobjetos, Azul Tripano y azul de metileno para evaluar la viabilidad celular y viales de muestra, pipetas de transferencia de punta fina, folleto de papel de lente. Todo lo que necesitas para empezar está en un solo kit.
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