reagentes químicos e anticorpos
recolha de veneno de abelha
o veneno foi colhido utilizando Trabalhadores ou rainhas de várias populações diferentes de abelhas Apid., As amostras de veneno coletadas de abelhas européias (Apis mellifera) e abelheiras-de-cauda-bufa (Bombus terrestris audax) originaram-se de Perth (Austrália), Dublin (Irlanda) e Londres (Inglaterra). O veneno de abelha foi coletado de 30 trabalhadores de cada uma das três colônias diferentes de um apiário ou fazenda como descrito. O veneno de abelha da Austrália foi coletado de um apiário mantido pelo Centro de pesquisa integrativa de abelhas (CIBER), localizado na Universidade da Austrália Ocidental (UWA: -31.980151, 115.817919)., Abelha veneno da Irlanda foi coletado a partir de uma colônia em um apiário no Trinity College de Dublin (53.343933, -6.254635), e as outras duas colônias das fazendas perto de Glasnevin (53.383245, -6.276333) e Blanchardstown (53.384220, -6.375979). Honeybee e Bumblebee venom from England was collected at the Royal Holloway University of London (51.425626, -0.562987). O veneno de Bumblebee foi coletado de 20 trabalhadores de cada uma das duas colônias comercialmente compradas, com os bumblebees de uma única rainha de cada uma dessas duas colônias usadas para a coleta do veneno da Rainha bumblebee., Misturas independentes de mestres biológicos foram preparadas mantendo o veneno de diferentes colônias separadas, com o veneno de 312 abelhas coletadas no total.o veneno Glandular foi recolhido por dissecção manual. As abelhas foram capturadas perto da entrada da colmeia para abelhas, ou diretamente da colônia para abelhas, e anestesiadas com dióxido de carbono e refrigeradas no gelo. O aparelho de picada foi dissecado de cada indivíduo; em seguida, a glândula de veneno removido e colocado em solução salina de tampão fosfato (PBS)., As glândulas foram perfuradas com uma agulha Terumo (25 G × 5/8) e centrifugadas (13 000 g, 10 min, 4 °C), e o sobrenadante recolhido, contendo veneno em suspensão líquida. A concentração de proteínas de cada mistura principal foi quantificada com um teste de proteína compatível com detergente (Bio-Rad), medindo a absorvância a 750 nm com uma BioTek Science Powerwave XS2 (Software Gen 5 1.11, versão 1.11.5). Cada mistura principal foi então aliquotada e armazenada a -80 ° C.,
Célula linhas e condições de cultura
Todas as linhagens celulares foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA), exceto para HEK293FT células que foram comprados da Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Austrália), SUM149 e SUM159 que foram obtidos a partir de Asterand de Biociências (Detroit, MI, EUA), e T11 e B. 15 células que foram gentilmente cedidas por Charles Perou e Lyuba Varticovski da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill e Institutos Nacionais de Saúde, respectivamente. T11 and B. 15 are very well-characterized cell lines37, 38.,as células
foram incubadas a 37 ° C e 5% de CO2 e complementadas com 1% de antimicóticos antibióticos. As células HDFa (fibroblastos dérmicos humanos primários normais) foram cultivadas no DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS). Os MCF 10A e MCF-12A (células epiteliais imortalizadas de mamíferos humanos, não transformadas) foram mantidos em DMEM/F-12 com suplementos (5% de soro fetal de cavalo, 20 ng/mL de factor de crescimento epidérmico, 10 µg/µL de insulina, 100 ng/mL de toxina da cólera e 500 ng/mL de hidrocortisona). As células NIH / 3T3 (fibroblasto embrionário Murino) foram mantidas em DMEM com 10% de FBS., HEK293FT (rim embrionário humano 293 células que expressam estavelmente o grande antigénio T SV40) foi cultivado em DMEM com 10% de FBS e suplementos (1% de glutamina e 0, 4 mg/mL de Geneticina G418, Gibco). O MCF7 (cancro da mama no lúminal Humano A) foi mantido em MEM α Com 10% de FBS e suplementos (1% cada de piruvato de sódio, bicarbonato de sódio e aminoácidos não essenciais). O T-47D e o ZR-75-1 (ambos cancro da mama a no luminal humano) foram cultivados em IPR com 10% de FBS. MDA-MB-231 (cancro da mama em claudin humano) foi cultivado em DMEM com 10% de FBS., O SUM149 (cancro da mama basal humano) foi cultivado em F-12 com 10% de FBS. A SUM159 (cancro da mama em Claudina humana – baixo) foi cultivada em F-12 com 5% de FBS e suplementos (5 µg/mL de insulina e 1 µg/mL de hidrocortisona). MDA-MB-453 (cancro da mama enriquecido com HER2 humano) foi cultivado em DMEM com 10% de FBS. O SKBR3 (cancro da mama enriquecido em HER2 humano) foi cultivado em RPMI com 10% de FBS e 1% de piruvato de sódio. o p53-T11 (cancro da mama de Murine claudin-baixo) foi mantido no meio RPMI 1640 com 10% de FBS. A BRCA-B. 15 (cancro da mama Murino basal) foi mantida no meio RPMI 1640 com 10% de FBS.,os ensaios de viabilidade celular de
a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de viabilidade celular luminescente, de acordo com o protocolo do Fornecedor. As células foram revestidas em placas de cultura de 96 alvéolos e incubadas a 37 ° C e a 5% de CO2 durante 24 h. Nos ensaios de dose–resposta, o meio foi eliminado e substituído por meio contendo as concentrações indicadas de veneno de abelha ou peptídeo e cultivado durante 24 h., Para a viabilidade celular durante mais de 60 minutos, as células foram tratadas com a CI50 de veneno de abelha ou melittina para cada linha celular por curtos intervalos de tempo ao longo de 1 h, e a viabilidade determinada imediatamente após o tratamento. Para determinar a viabilidade, as células foram incubadas com reagente CTG (CellTiter-Glo) 2.0 durante 10 minutos. A viabilidade celular foi quantificada através da medição da luminescência através de um leitor Multilabel do EnVision 2102 (PerkinElmer). Experiências foram realizadas em replicados biológicos (n = 3).,a produção de anticorpos monoclonais primários contra melittin foi realizada de acordo com protocolos aprovados pelo Comité de ética Animal do Instituto de Pesquisa Médica Harry Perkins. Ratos fêmea A / J foram imunizados com veneno de abelha coletado na Austrália. Os ratos receberam injecções intraperitoneais de 12 µg de veneno no adjuvante completo de Freund (Difco), seguido de um aumento no adjuvante incompleto de Freund no dia 29 e de um aumento aquoso na PBS de 7 µg/rato no dia 49. Ratos foram sangrados no dia 60, e sera foi testado por ELISA., O melhor respondedor foi potenciado com 7 µg de veneno de abelha em PBS 4 dias antes da fusão. As células do baço foram fundidas com células do mieloma Sp2/O de acordo com os procedimentos padrão82. Os sobrenadantes contendo anticorpos foram rastreados por ELISA. O clone 3B9 do Hybridoma foi selecionado para estudo adicional. O anticorpo foi produzido pelo crescimento das células de hibridoma em biorreactores em meio LIVRE sérico de Hibridoma (Gibco). O anticorpo foi purificado por cromatografia de proteína G-Sefarose. O anticorpo purificado foi dialisado em PBS (pH 7, 3). O anticorpo passou a ser referido como o anticorpo anti-melitina (3B9).,o líquido foi removido e as placas lavadas três vezes numa solução de 0,05% TWEEN-20 (“Tween-20”, “Sigma-Aldrich”) em PBS. Os anticorpos primários foram adicionados aos alvéolos com diluições de 1: 2 a partir de 10 µg / mL em diluente (albumina sérica de 0,1% de bovino (BSA) em PBS) e incubados durante 1 h à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram removidos, e as placas lavadas três vezes em 0.,05% Tween-20 em PBS. O anticorpo secundário específico da cadeia γ da cabra policlonal Anti-rato IgG γ foi adicionado aos alvéolos (1:1000 em diluente) e incubado durante 1 h à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram removidos, e as placas lavadas três vezes em 0,05% Tween-20 em PBS. Adicionou-se aos alvéolos uma solução de água purificada contendo 10% de ácido cítrico (pH 4.2), 2% de ácido ABTS e 0,1% de H2O2, incubando as placas à temperatura ambiente durante 15 minutos., Absorvância foi gravada a 405 nm usando o VICTOR Light plate reader com Wallac 1420 Manager Software (PerkinElmer). O controlo foi o anticorpo monoclonal IgG do rato (28/00 8C1-6) que reage com IL-12 Humano, Aplicado ao péptido melitina na placa ELISA. Experiências foram realizadas em replicados biológicos (n = 3).
ensaios de competição de anticorpos anti-melitina
HDFa e células SUM159 foram prateadas em placas de cultura de 96 poços e incubadas a 37 °C e 5% de CO2 durante 24 h., As concentrações crescentes do anticorpo anti-melitina foram incubadas com as concentrações de CI50 de veneno de abelha ou melitina para cada linha celular durante 1 h à temperatura ambiente, e depois adicionadas às células durante 24 h. A viabilidade celular foi determinada conforme descrito em “testes de viabilidade celular”. Experiências foram realizadas em replicados biológicos (n = 3).as células de
Western blot
foram revestidas de placas de 6 alvéolos a uma densidade de 300 000 células/alvéolo e incubadas a 37 °C e a 5% de CO2 durante 24 h., Experiências de cultura de células foram conduzidas como descrito,e então o protocolo padrão Western blot foi seguido como descrito aqui. As células foram lavadas com PBS a frio e lisadas com tampão de lise de proteína fria (2% sulfato de dodecilo sódico (SDS), 125 mmol/L de Tris-HCl, pH 6.8). As amostras foram sonicadas durante 10 s a 10 mA e as concentrações de proteínas quantificadas com o ensaio de proteína compatível com detergente (Bio-Rad). Quantidades iguais de proteínas foram misturadas com tampão de carga (Tampão de amostra de Laemmli, Bio-Rad) complementadas com o agente redutor ditiotreitol (DTT)., As amostras de proteínas foram desnaturadas por ebulição a 95 ° C durante 5 minutos, carregadas em géis pré-PROTEANOS (Bio-Rad) e submetidas a electroforese a 100 V, e depois transferidas para membranas PVDF (Bio-Rad) com o sistema de transferência Turbo Trans-Blot (Bio-Rad) durante 7 minutos. As membranas foram incubadas com TBST (Tris-HCl de 20 mM, pH 7,4, 150 mM NaCl e 0,1% Tween-20) com 5% de leite magro para bloquear a ligação não específica. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários diluídos em 3% de ASC e 0, 02% de azida de sódio., O sinal foi detectado com o substrato de HRP Ocidental Luminata Crescendo (Millipore) com o ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) executando software de laboratório de imagem (Bio-Rad, versão 6). Blots ocidentais foram derivados do mesmo experimento e processados em paralelo. Varreduras não cortadas das blots ocidentais são fornecidas em figos suplementares. 10–15.a apoptose e a necrose foram avaliadas utilizando o Kit I De Detecção de apoptose V-FITC (Biosciências BD), Anexoin V-FITC, de acordo com o protocolo do fabricante. As células SUM159 foram banhadas em placas de cultura de 6 poços por 24 h., O meio foi então descartado e substituído por meio contendo veneno de abelha ou melittina (concentrações de IC50) e cultivado durante 60 minutos. As células foram recolhidas com tripsina e meio e centrifugadas (1000g, 5 min, 24 °C), lavadas com PBS a frio, centrifugadas (1000g, 5 min, 24 °C) e ressuspendidas em tampão de ligação de 1×. As células foram preparadas para uma concentração de 1 milhão de células/mL em 1× tampão de ligação. As amostras foram incubadas com FITC e PI (5 µL de cada) no escuro durante 15 minutos., A presença de células vivas, mortas, apoptóticas ou necróticas foi avaliada com o Citômetro BD Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, EUA) com o software BD Accuri C6, e analisado com o FlowJo™ (Ashland, EUA, Windows Version 7). Experiências foram realizadas em replicados biológicos (n = 3). As estratégias de gate são apresentadas em Figo suplementar. 16.
microscopia em células vivas
as células SKBR3 foram revestidas numa placa de microwell de fundo de vidro (10 × 35 mm, MatTek) e incubadas durante 24 horas., A placa de microwell foi deixada para equilibrar em um microscópio confocal eclipse de NIKON Ti câmara de incubação estágio-top (37 ° C e 5% de CO2) durante 20 minutos. O objetivo de 20× foi usado com o alinhamento Kohler, e as imagens foram tiradas a cada minuto de 10 minutos antes de 1 h após o tratamento com a CI50 de veneno de abelha coletado na Austrália., Os autores reconhecem as instalações e o apoio técnico e científico, oferecido pelo serviço Nacional de Imagiologia Facilidade, uma Colaboração Nacional de Infraestrutura de Pesquisa de Estratégia (NCRIS) capacidade, bem como o Australiano Microscopia & Microanálise centro de Pesquisa, tanto no Centro de Microscopia, Caracterização e Análise (CMCA), UWA, uma instituição financiada pela Universidade, Estado e Governos da Commonwealth.,
microscopia electrónica de varrimento
Tampas De Vidro (12 mm de diâmetro, Menzel, termo Fisher Scientific) foram revestidas com bromidrato de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) durante 20 minutos e depois lavadas duas vezes com água purificada. SUM159 células foram banhados sobre as lâminas de vidro em uma densidade de 62,500 células/poço e incubadas a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h. As células foram lavadas duas vezes com PBS e, em seguida, tratados com veículo ou o IC50 concentrações de veneno de abelha e melitina por 1 h., As células foram lavadas duas vezes com PBS, depois fixadas com 4% de formaldeído em PBS durante 25 minutos, e depois lavadas novamente três vezes com PBS. Em preparação para microscopia, as amostras foram imersas em 2,5% de glutaraldeído e foram incubadas a 4 ° C durante 2 h. As amostras foram lavadas com água desionizada e imersas em concentrações crescentes de etanol (50%, 70%, 95%, 100%, e então 100% absoluta etanol “seco”). Entre cada imersão, as amostras foram desidratadas em um microondas especializado (PELCO, BioWave 34700 Laboratory Microwave System)., O processo de desidratação foi concluído com um aparelho de secagem de ponto crítico E3000 para substituir o etanol na amostra por CO2 supercrítico. As tampas processadas foram montadas em montagens SEM (ProSciTech) com abas de carbono. As amostras foram revestidas com platina de 3 nm para torná-las eletronicamente condutoras antes de serem visualizadas no microscópio eletrônico de varredura (Zeiss 1555 VP-FESEM) em CMCA, UWA. Imagens foram tiradas com o detector de lentes a uma distância de trabalho de 2,6-mm, Abertura de 30 µm e uma tensão de aceleração de 5 kV., As imagens foram analisadas com o software de análise de imagens FIJI (ImageJ)83.
imunofluorescência
Tampas De Vidro (12 mm de diâmetro, Menzel, termo Fisher Scientific) foram colocadas em placas de 24 poços e revestidas com poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) durante 20 minutos e depois lavadas duas vezes com água purificada. As células foram tratadas durante 30 minutos com o veículo, ou a CI50 de veneno de abelha, melitina, RGD1-melitina, e a concentração molar equivalente como melitina para a DEDE-melitina., As células foram lavadas duas vezes com PBS, depois fixadas com 4% de paraformaldeído em PBS durante 25 minutos, e depois lavadas novamente três vezes com PBS. A ligação de anticorpos não específicos foi bloqueada utilizando 5% de soro normal de cabra (termo Fisher científico) em PBS durante 1 h à temperatura ambiente. Foram adicionados às células anticorpos primários, incluindo o anticorpo monoclonal anti-melittina (5 µg/mL) e 1:500 de anti-EGFR (Abcam). As amostras foram incubadas com agitação suave a 4 °C durante a noite., As células foram lavadas três vezes com PBS e, em seguida, incubadas com 1:500 do Alexa Fluor 488 de cabra anti-mouse anticorpo secundário, 1:500 do Alexa Fluor 594 de cabra anti-coelho anticorpo secundário, e Hoechst (1:5000) em PBS a temperatura ambiente por 1 h. As amostras foram lavadas três vezes com PBS e montado em lamelas de vidro com SlowFade Diamante Antifade composto para montagem (Thermo Fisher Scientific). As lâminas foram fotografadas utilizando o microscópio invertido da Nikon Ti-E com fluorescência confocal. As imagens foram tiradas usando um objetivo de 20× ar (na 0.,75), e excitação sequencial usando comprimentos de onda de 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (Alexa Fluor 488 anticorpo secundário), e 561 nm (Alexa Fluor 594 anticorpo secundário). Imagens foram coletadas usando o Software de elementos NIS-C e processadas usando FIJI (ImageJ) no CMCA83.as interacções com o receptor–ligando foram avaliadas com o BRET, utilizando um método semelhante ao descrito anteriormente em 84, 85., BRET envolve a transferência não-radiativa de energia (dipolo–dipolo) entre duas proteínas ou moléculas de interesse rotuladas com uma luciferase doador ou um fluoróforo aceitador após oxidação do substrato pela luciferase e subsequente emissão de light54. As etiquetas FITC foram conjugadas com o n terminus de melittin (FITC-melittin) e DEDE-melittin (FITC–DEDE-melittin). HEK293 células estavelmente expressando o SV40 grande antígeno T (HEK293FT) foram banhadas em placas de 6 poços a uma densidade de 550.000 células/poço por 24 h., As células HEK293FT foram transfectadas com plasmídeos contendo cDNA para NanoLuc-EGFR usando FuGENE. Brevemente, incubou-se cDNA plasmídeo durante 10 minutos à temperatura ambiente com uma mistura de reagente de transfecção e DMEM isento de soro a uma razão de 10 ng/µL de NanoLuc-EGFR: 4 µL de Fugeno: 100 µL de SFM. A mistura foi adicionada ao HEK293FT células em uma concentração final de 10 ng/µL NanoLuc-EGFR por bem de o 6-bem prato, e as células incubadas por 24 h. As células foram lavadas com PBS e distante com tripsina, em seguida, recolhidas em meio contendo 5% de soro fetal de bezerro em vermelho de fenol livre de meio DMEM., As células foram banhados em 50.000 células/poço em poli-l-lisina-revestidos de 96 poços branco e placas incubadas por 24 h. Para tanto saturação e cinética BRET ensaios, dois filtros foram utilizados para medir simultaneamente a curto e longo comprimento de onda de luminescência correspondente a comprimentos de onda de emissão do doador e aceitador moléculas, respectivamente.
Para o tempo real de ligante associação de cinética de experiências, a mídia foi removida das células, que foram, então, incubadas com 50 µL/poço do NanoLuc substrato furimazine para uma concentração final de 10 µM, diluídas em Hank Balanced Salt Solution (HBSS)., As células foram então equilibradas no leitor de placas CLARIOstar (BMG Labtech, Austrália) por 5 minutos para registrar leituras basais. Ligandos (TAMRA-FEG, FITC-melitina, e FITC–DEDE-melitina) em seguida foram adicionados a um intervalo de corrigir as concentrações finais, e NanoBRET gravações tomadas a cada 90 s para 60 min a 37 °C. Para a saturação de experiências, a mídia foi removida das células, e uma gama de concentrações de TAMRA-FEG, FITC-melitina, e FITC–DEDE-melitina adicionado na presença ou ausência de um concorrente concentração (1 µM) de qualquer FEG e incubadas a 37 °C por 60 min no escuro., A furimazina foi adicionada numa concentração final de 10 µM. Gravações foram feitas usando o LUMIstar Omega (BMG Labtech, Austrália). Os dados são apresentados como a” razão BRET bruta”, derivada da razão da emissão de comprimento de onda longo (aceitador) sobre a emissão de comprimento de onda curto (dador). Experiências foram realizadas em replicados biológicos (n = 3).
A análise dos efeitos combinados do fármaco
o veneno ou melitina da abelha foi combinado com o docetaxel e administrado nas concentrações indicadas num rácio não existente nas células T11 durante 24 horas., A viabilidade celular foi avaliada utilizando o CellTiter-Glo, como mencionado anteriormente. O efeito combinado do veneno de abelha ou melittina com docetaxel foi avaliado pelo método de efeito de dose mediano utilizando o Software CompuSyn (ComboSyn). Este método determina um CI com base no efeito de uma combinação entre dois agentes (onde CI < 1 é sinérgico, CI > 1 é antagônico, e CI = 1 é aditivo)56. Experiências foram realizadas em replicados biológicos (n = 3).,estas experiências com animais foram realizadas em conformidade com protocolos aprovados pelo Comité de ética Animal da UWA. Para simular um modelo avançado de câncer de mama claudin-baixo, 2,5 × 105 células T11 foram suspensas em meios livres de soro e alta concentração da matriz de Matrigel BD (Biociência BD) em uma razão de 1:1 para um volume total de 100 µL e injectadas por via subcutânea nos flancos de fêmeas BALB/cJ de 5 semanas de idade (Animal Resources Centre, WA, Austrália) usando uma agulha de 26-G., As células T11 utilizadas foram transduzidas lentiviralmente com a construção ZsGreen-luciferase e triadas três vezes para obter um enriquecimento superior a 99% das células luciferase-positivas. A melitina foi suspensa em água Milli-Q + 5% de dextrose. O Docetaxel (em pó) foi suspenso em 25% de TWEEN 80 (Sigma-Aldrich), e 75% de uma mistura de 15.25:84.75 (v/v) solução de etanol absoluto e água purificada e mantido a -20 °C. Imediatamente antes do tratamento, o docetaxel foi fresco, diluído em Milli-Q de água + dextrose a 5% na concentração final., Três dias após a geração de tumores T11 (~50 mm3), ratos foram aleatorizados em 4 grupos (n = 12 ratos/grupo). Os tratamentos foram injetados intratumorally em dias 3, 5, 7, 9, 11, 13, e 15 de pós inoculação de T11 células, com o veículo, melitina (5 mg/kg), docetaxel (7 mg/kg), ou uma combinação de melitina (5 mg/kg) e docetaxel (7 mg/kg). Os animais eram monitorados para o tamanho do tumor a cada 2 dias, e os volumes calculados pela fórmula elipsoide modificada (volume = width2 × comprimento/2). Os animais foram sacrificados humanamente quando os tumores atingiram 800 mm3.,
a análise imunohistoquímica dos tumores
os tecidos tumorais foram fixados em 4% de paraformaldeído, lavados três vezes em PBS e deixados em 70% de etanol. Tumores foram incorporados em parafina, e seções de 5 µm foram preparadas. Para a coloração da hematoxilina / eosina, as lâminas foram desparafinadas, hidratadas com uma solução decrescente de etanol, manchadas com hematoxilina de Gill, desidratadas com etanol a 70%, manchadas com eosina, desidratadas com etanol a 100%, limpas com tolueno e montadas em tampas com suportes de montagem Acrimount IHC (StatLab)., A apoptose das células tumorais foi determinada nas secções dos tecidos por ensaio de TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche).
imagem bioluminescência
para acompanhar com precisão as alterações no crescimento tumoral in vivo com os tratamentos, realizámos a análise de bioluminescência utilizando o sistema de imagem Caliper IVIS Lumina II na CMCA, UWA. As análises foram realizadas a cada 2 dias após a geração de tumores. Os ratos foram injectados intraperitonealmente com 200 µL de D-luciferina (produto químico de Cayman) na concentração final de 150 mg/kg dissolvidos em PBS antes de serem anestesiados a 4% de isoflurano., Uma vez anestesiados, os ratos foram colocados dentro da Câmara pré-aquecida da imagem de bioluminescência e fotografados 7-12 minutos após a injecção, abaixo de 2% de isoflurano, até a intensidade do sinal de bioluminescência ter atingido um estado estacionário.
análise estatística
todos os dados foram derivados de experiências múltiplas realizadas pelo menos em triplicado. Análises estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism v8 (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft), e SPSS Predictive Analytics Software (IBM, versão 26)., Para os ensaios de viabilidade celular, os dados foram normalizados para a luminescência média da condição do veículo, que foi considerada 100% de viabilidade, com o IC50 derivado no prisma de GraphPad. For the immunohistochemistry in the treated T11 tumors to detect p-HER2 (Tyr1248) and p-EGFR (Tyr1068), vehicle was normalized to 100%., Quando apropriado, e como denunciado no texto principal, a significância estatística foi determinada usando não pareado bicaudal o teste t de Student, não pareado ANOVA one-way com Tukey HSD post hoc teste de correção para comparações múltiplas, two-way ANOVA com medidas repetidas seguido por Sidak ou de Tukey múltiplas-teste de comparação, ou um modelo linear generalizado (GLM). Para todos os testes, as diferenças foram consideradas significativas (p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), e p < 0.001 (***).,o resumo dos Relatórios de investigação sobre a natureza ligado a este artigo contém mais informações sobre a concepção da investigação.
Leave a Reply