화학 시약 및 항체
벌 독 수집
독었를 사용하여 수집 노동자 또는 퀸즈에서 여러 가지 다른 집단의 Apid 다., 독 샘플 수집에서 꿀벌(Api 은 서양꿀벌)및 광 꼬리 땅벌(Bombus terrestris 닥스)에서 유래스 퍼스(오스트레일리아),Dublin(Ireland),런던(영국). 꿀벌 독은 설명 된대로 양봉장이나 농장에서 3 개의 다른 식민지 각각의 30 명의 근로자로부터 수집되었습니다. 꿀벌의 독주에서 수집되었는 양봉장에 의해 유지되는 센터를 통합벌 연구(CIBER),에 위치한 웨스턴 오스트레일리아 대학(우:-31.980151,115.817919)., 꿀벌의 독 아일랜드에서 수집 중 하나에서의 식민지에서는 양봉장에서 트리니티 칼리지 더블린(53.343933,-6.254635),및 다른 두 개의 식민지에서 농장 근처의 글라스네빈(53.383245,-6.276333).더 보기(53.384220,-6.375979). 영국의 꿀벌과 땅벌 독은 런던 왕립 홀로 웨이 대학교(51.425626,-0.562987)에서 수집되었습니다. 꿀벌이 독에서 수집되었 20 노동자에서 각각 2 상업적으로 구매한 식민지로,단일의 여왕벌에서 각자의 이러한 두 가지 식민지 사용에 대한 컬렉션의 여왕은 꿀벌의 독., 독립적 인 생물학적 마스터 믹스는 총 312 마리의 꿀벌의 독을 수집하여 서로 다른 식민지의 독을 분리하여 준비했습니다.
선 독은 수동 해부에 의해 수집되었다. 꿀벌들을 캡처의 입구 근처에는 하이브 위해 꿀벌,또는 직접에서는 대한민벌,그리고 마취과 이산화탄소 및 냉장에 얼음입니다. 스팅 장치는 각 개인으로부터 해부되었다;그 다음 독샘을 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣었다., 동맥들을 관통 텔 모 바늘(25G×5/8)과 원심 분리(13,000g,10 분,4℃),그리고 상등액을 수집,을 포함하는 독 액체 서스펜션이다. 단백질 농도의 각 마스터 혼합었을 정량화와 세제 호환성 단백질 분석실험(Bio-Rad),측정하는 흡광도에서 750nm 밀레니엄 과학 BioTek PowerWave XS2(Gen5 1.11 소프트웨어 버전 1.11.5). 그런 다음 각 마스터 믹스를 정렬하고 -80°C 에서 저장했습니다.,
세포 라인과 문화 조건
모든 세포 라인에서 구입 한국 Type Culture Collection(Manassas,VA,미국)를 제외하고,HEK293FT 세포에서 구입 한 Invitrogen(Thermo Fisher Scientific,빅토리아,호주),SUM149 및 SUM159 는에서 얻을 수 있었 Asterand 바이오과학과(Detroit,MI,미국), 고 T11 및 B.15 세포는 친절하게 제공하여 찰스 Perou 및 lyuba 이 Varticovski 에서 University of North Carolina at Chapel Hill 및 국가 기관의 건강,각각합니다. T11 과 B.15 는 매우 잘 특성화 된 세포 계통이다 37,38.,
세포를 37°c 및 5%CO2 에서 배양하고 1%항생제–항균제로 보충 하였다. HDFa(정상 일차 성인 인간 피부 섬유 아세포)세포를 DMEM 에서 10%태아 소 혈청(FBS)으로 배양 하였다. MCF10A 와 MCF-12A(인간의 유 불후의 명작 상피세포,nontransformed)에 유지 되었 DMEM/F-12 으로 보충(5%태아 말 혈청,20ng/mL 표피 성장 인자,10µg/μl 인슐린,100ng/mL 콜레라 독소,500ng/mL 하이드로코르티손). NIH/3t3(뮤린 배아 섬유 아세포)세포는 10%FBS 로 DMEM 에서 유지되었다., HEK293FT(인간 배아 신장 293 세포 안정적으로 표현 SV40large T antigen)교양에 DMEM10%FBS 보충(1%글루타민 및 0.4mg/mL G418Geneticin,Gibco). MCF7(human luminal a 유방암)은 10%FBS 와 보충제(피루 베이트 나트륨,중탄산 나트륨 및 중요하지 않은 아미노산의 각 1%)로 MEM α 에서 유지되었다. T-47D 및 ZR-75-1(인간 루미 날 a 유방암 모두)을 10%FBS 로 RPMI 에서 배양 하였다. MDA-MB-231(인간 클로딘-저 유방암)을 DMEM 에서 10%FBS 로 배양 하였다., SUM149(인간 기저 유사 유방암)를 F-12 에서 10%FBS 로 배양 하였다. SUM159(human claudin-low 유방암)를 F-12 에서 5%FBS 및 보충제(5μg/mL 인슐린 및 1μg/mL 하이드로 코르티손)로 배양 하였다. MDA-MB-453(인간 HER2 농축 유방암)을 DMEM 에서 10%FBS 로 배양 하였다. SKBR3(인간 HER2 농축 유방암)을 RPMI 에서 10%FBS 및 1%나트륨 피루 베이트로 배양 하였다. p53-T11(murine claudin-low 유방암)은 10%FBS 로 RPMI1640 배지에서 유지되었다. BRCA-B.15(murine basal-like 유방암)는 rpmi1640 배지에서 10%FBS 로 유지되었다.,
세포 생존 능력을 분석 실험
세포 생존 능력에 의해 결정되었는 발광 셀 생존 능력을 분석 결과에 따르면 공급업체의 프로토콜입니다. 세포에서 도금되는 96-well culture 플레이트 및 배양에 37°C5%CO2 24h. 에 대한 용량–반응 분석법,미디어 버렸다고 대체과 미디어에 포함된 농도의 벌 독 또는 펩티드 배양을 위해 24h., 에 대한 세포 생존 능력 60min,세포 치료를 했으로 IC50 꿀벌의 독 또는 melittin 각 셀에 대해 라인에 대한 짧은 시간 간격을 통해 1 시간,그리고 생존에 결정된 후 즉시 처리입니다. 생존력을 결정하기 위해 세포를 CellTiter-Glo(CTG)2.0 시약으로 10 분 동안 배양 하였다. 세포 생존력은 EnVision2102Multilabel Reader(PerkinElmer)를 사용하여 발광을 측정함으로써 정량화되었다. 실험은 생물학적 복제(n=3)에서 수행되었다.,
의 생산에 기본 단일 클론항체에 대한 melittin
항체 생산되었을 수행에 따른 프로토콜 승인에 의해 동물을 윤리위원회의 해리 퍼킨스 연구소의 의료 연구가 진행되고 있습니다. 암컷 A/J 마우스는 호주에서 수집 된 꿀벌 독으로 면역화되었다. 쥐 받은 복강내 주입의 12µg 의 독에서 완전한 프로 인트의 보조제(Difco),다음의 향상을 불완전한 프로 인트의 보조에 날 29 및 수용성 향상에 PBS7μg/에 마우스를 날 49. 생쥐는 60 일째에 피를 흘렸고,세라는 엘리사에 의해 시험되었다., 가장 좋은 반응자는 융합 4 일 전에 pbs 에서 7μg 의 꿀벌 독으로 증폭되었습니다. 비장 세포는 표준 procedures82 에 따라 Sp2/O 골수종 세포와 융합되었다. 항체 함유 상청액을 ELISA 에 의해 스크리닝 하였다. Hybridoma clone3B9 는 추가 연구를 위해 선택되었습니다. 항체는 Hybridoma 혈청 유리 배지(Gibco)에서 생물 반응기에서 hybridoma 세포를 성장시킴으로써 생산되었다. 항체는 단백질 G-세파 로스 크로마토 그래피에 의해 정제되었다. 정제 된 항체는 PBS(pH7.3)에서 투석되었다. 항체는 이제부터는 항-멜리 틴 항체(3b9)로 지칭되었다.,
효소결합 면역 분석법(ELISA)
Venoms 및 펩티드는 도금되었으로 명확한 곡선 기반의 96-well 플레이트에서 5µg/mL 에서는 탄산염 완충기와 incubated4°C 에서 24h. 액체 제거되었다,그리고 접시 세척하에서 세 번의 용액 0.05%TWEEN-20 일(“Tween-20,”Sigma-Aldrich)PBS. 기본 항체를 추가한 우물과 함께 1:2 희석에서 시작 10µg/mL 에 희석제(0.1%소 혈 청 알부민(BSA)PBS),그리고 배양을 위한 1h 상온에서. 1 차 항체를 제거하고,플레이트를 0 에서 3 회 세척 하였다.,05%트윈-20PBS 에서. 폴리 클로 날 염소 항 마우스 IgG γ 사슬 특이 적 2 차 항체를 우물(희석액에서 1:1000)에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양 하였다. 1 차 항체를 제거하고,플레이트를 pbs 에서 0.05%Tween-20 로 3 회 세척 하였다. 10%시트르산(ph4.2),2%ABTS 및 0.1%H2O2 를 함유하는 정제 물 용액 인 ELISA-developing 완충액을 우물에 첨가하고,플레이트를 실온에서 15 분 동안 어둠 속에서 배양 하였다., Wallac1420Manager 소프트웨어(PerkinElmer)가 장착 된 VICTOR Light plate reader 를 사용하여 405nm 에서 흡광도를 기록했습니다. 대조군은 ELISA 판상의 멜리 틴 펩타이드에 적용된 인간 IL-12 와 반응하는 마우스 단일 클론 IgG 항체(28/00 8C1-6)였다. 실험은 생물학적 복제(n=3)에서 수행되었다.
항-멜리 틴 항체 경쟁 실험
hdfa 및 SUM159 세포를 96-웰 배양 플레이트에서 도금하고 24 시간 동안 37°c 및 5%CO2 에서 배양 하였다., 의 농도를 증가시키는 반 melittin 항체 배양되었으로 IC50 농도의 꿀벌 독 또는 melittin 에 대한 각각의 세포 라인을 위해 1 시온에서,그리고 다음에 추가 세포 24h. 세포 생존 능력이 결정되었으로 설명에서”세포 생존 능력 assays”. 실험은 생물학적 복제(n=3)에서 수행되었다.
웨스턴 블롯
세포를 300,000 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 도금하고 24 시간 동안 37°c 및 5%CO2 에서 배양 하였다., 세포 배양 실험을 기술 된대로 수행 한 다음,본원에 설명 된대로 표준 웨스턴 블롯 프로토콜을 따랐다. 세포를 차가운 PBS 로 세척하고 차가운 단백질 용해 완충액(2%sodium dodecyl sulfate(SDS),125mmol/L Tris-HCl,pH6.8)으로 용해시켰다. 샘플을 10mA 에서 10s 동안 sonicated 하고,단백질 농도는 세제 호환 단백질 분석법(Bio-Rad)으로 정량화했다. 환원제 dithiothreitol(DTT)이 보충 된 로딩 버퍼(Laemmli Sample Buffer,Bio-Rad)와 동일한 양의 단백질을 혼합 하였다., 단백질 샘플에 의해 변성은 끓는 95℃에서 5 분,로드 미니 무쌍한 미리 틀에 넣어 만들어진 젤(Bio-Rad)및 복종하는 전기 이동법에서 100V,그리고 다음에 전송 PVDF 막(Bio-Rad)와 트랜스 오 터보 전송 시스템(Bio-Rad)7min. 막을 5%무 지방 우유로 TBST(20mM Tris-HCl,pH7.4,150mM NaCl 및 0.1%Tween-20)로 배양하여 비특이적 결합을 차단 하였다. 멤브레인을 3%BSA 및 0.02%나트륨 아 지드로 희석 된 1 차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양 하였다., 신호는 이미지 랩 소프트웨어(Bio-Rad,버전 6)를 실행하는 ChemiDoc MP 이미징 시스템(Bio-Rad)으로 Luminata Crescendo Western HRP 기판(Millipore)으로 감지되었습니다. 웨스턴 블롯은 동일한 실험에서 도출되어 병렬로 처리되었다. 웨스턴 블롯의 절단되지 않은 스캔은 보충 무화과에 제공됩니다. 10–15.
유세포계측
아폽토시스 및 괴사는 제조자의 프로토콜에 따라 아넥신 V-FITC 아폽토시스 검출 키트 I(BD Biosciences)를 사용하여 평가하였다. SUM159 세포를 24 시간 동안 6-웰 배양 플레이트에 도금 하였다., 그런 다음 배지를 폐기하고 꿀벌 독 또는 멜리 틴(IC50 농도)을 함유 한 배지로 대체하고 60 분 동안 배양 하였다. 세포 수집과 트립신 및 미디어 및 원심 분리(1000g,5 분,24°C)세척,냉 PBS,원심 분리(1000g,5 분,24°C),resuspended 에서 1×바인딩 버퍼입니다. 세포를 1×결합 완충액에서 1 백만 세포/mL 의 농도로 제조 하였다. 샘플을 15 분 동안 어둠 속에서 fitc 및 PI(각각 5μl)로 배양 하였다., 의 존재 live,dead,apoptotic,또는 괴 세포로 평가 되었 BD Accuri C6Cytometer(BD Biosciences,San Jose,USA)BD Accuri C6 소프트웨어 및 분석 FlowJo™(랜드,미국,Windows 버전 7). 실험은 생물학적 복제(n=3)에서 수행되었다. 게이팅 전략은 보충 도 1 에 제시되어있다. 16.
라이브 셀 현미경
SKBR3 세포를 유리 바닥 마이크로웰 접시(10×35mm,MatTek)에 도금하고 24 시간 동안 배양 하였다., Microwell 접시는 20 분 동안 NIKON Eclipse Ti 공 촛점 현미경 스테이지-탑 인큐베이션 챔버(37°c 및 5%CO2)에서 평형을 이루도록 남겨 두었다. 20×목적은 Kohler 정렬과 함께 사용되었으며,호주에서 수집 된 꿀벌 독의 IC50 으로 처리 한 후 10 분 전부터 1 시간까지 매분마다 이미지를 촬영했습니다., 저자 승 시설 및 과학적이고 기술적 지원 제공에 의해 국가 이미징 시설,국립 공동 연구 인프라 전략(NCRIS)기능뿐만 아니라,호주 현미경을&미량 연구 시설,서비스를 제공해 현미경에 대한,특성 분석 및 분석(CMCA),우 기능에 의해 자금 지원 대학교,주 및 연방 정부를 설립하였습니다.,
스캐닝 전자 현미경
유리 coverslips(12-mm 직경,Menzel,Thermo Fisher Scientific)었으로 코팅 poly-l-lysine hydrobromide(Sigma-Aldrich)20min 씻은 다음 두 번으로 정화된 물. SUM159 셀금에 유리제 미끄럼 밀도의 62,500 세포/라고서 배양 37°C5%CO2 24h. 세포에 두 번 씻으로 PBS 다음으로 처리한 차량이나 IC50 농도의 꿀벌 독 melittin1h., 세포를 PBS 로 두 번 세척 한 다음 pbs 에서 4%포름 알데히드로 25 분 동안 고정시킨 다음 PBS 로 다시 세 번 세척 하였다. 에서 준비한 현미경,샘플이 몰입에서 2.5%의 글고 했다 incubated4°C for2h. 샘플은 세척과 함께 이온을 제거한 물과 몰입에서 에탄올 농도의 증가(50%, 70%, 95%, 100%, 다음 100%절대 아니다”건조”에탄올). 각각의 침지 사이에,샘플을 특수 마이크로파(PELCO,BioWave34700 실험실 마이크로파 시스템)에서 탈수시켰다., 탈수 공정은 시료 내의 에탄올을 초 임계 CO2 로 대체하기 위해 임계점 건조 장치 E3000 으로 완료되었다. 처리 된 커버 슬립은 카본 탭이있는 SEM 마운트(ProSciTech)에 장착되었습니다. 샘플은 코팅으로 3-nm 플래티넘을 그들에게 전자적으로 전도성되기 전에 시각에서 스캐닝 전자 현미경(Zeiss1555VP-FESEM)에 CMCA,우. 이미지는 2.6-mm 작동 거리,30-μm 조리개 및 5kv 의 가속 전압에서 렌즈 내 검출기로 촬영되었습니다., 이미지는 이미지 분석 소프트웨어 FIJI(ImageJ)83 로 분석되었습니다.
면역
유리 coverslips(12-mm 직경,Menzel,Thermo Fisher Scientific)에 배치되었다고 24-well 플레이트와 코팅 poly-l-lysine(Sigma-Aldrich)20min 씻은 다음 두 번으로 정화된 물. SUM159 셀금에 유리 슬라이드과에서 배양 37°C5%CO2 24h. 세포 치료를 위한 약 30 분을 가진 차량 또는 IC50 꿀벌의 독 melittin,RGD1-melittin,그리고 해당하는 몰 농도로 melittin 에 대한 DEDE-melittin., 세포를 PBS 로 2 회 세척 한 다음 pbs 에서 4%파라 포름 알데히드로 25 분 동안 고정시킨 다음 PBS 로 3 회 다시 세척 하였다. 비특이적 항체 결합은 실온에서 1 시간 동안 PBS 에서 5%정상 염소 혈청(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 차단되었다. 단일 클론 항 멜리 틴 항체(5μg/mL)및 항-EGFR(Abcam)의 1:500 을 포함하여 1 차 항체를 세포에 첨가 하였다. 샘플을 밤새 4°C 에서 부드러운 락킹으로 배양 하였다., 세포들은 세척 세 번 PBS,다음 incubated1:500 의 Alexa Fluor488goat anti-mouse 보조체,1:500 의 Alexa Fluor594goat anti-rabbit 보조 항체 및 훼히스트(1:5000)PBS 에서 상온에서 1 시간. 샘플은 세척 세 번 PBS 과에 장착되는 유리 coverslips 와 SlowFade 다이아몬드 Antifade Mountant(Thermo Fisher Scientific). 공 초점 형광 Nikon Ti-E 반전 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미지화했습니다. 이미지는 20×공기 목표를 사용하여 촬영 하였다(NA0.,75)및 순차적 자극을 사용하여 파장의 405nm(Hoechst34580),488nm(Alexa Fluor488 보조체),그리고 561nm(Alexa Fluor594 보조체). 이미지는 NIS-C Elements 소프트웨어를 사용하여 수집되었으며 CMCA83 에서 FIJI(ImageJ)를 사용하여 처리되었습니다.
생물 발광 resonance energy transfer(브렛)
수용체–리간드의 상호 작용했으로 평가 브렛,를 사용하는 방법을 설명 하는 유사 previously84,85., 브렛을 포함한 비복사 에너지의 전달(쌍극자–쌍극자)사이에 두 개의 단백질 또는 분자의 관심을 표시하거나 기증자 루시페라아제 또는 수락자를 가진 fluorophore 후 기질 산화에 의해 루시페라아제 및 이후 배출량의 light54. FITC 태그는 melittin(FITC-melittin)및 DEDE-melittin(FITC–DEDE-melittin)의 N 말단에 접합되었다. SV40 대형 T 항원(HEK293FT)을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 24 시간 동안 550,000 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트 상에 도금 하였다., HEK293FT 세포를 FuGENE 을 사용하여 nanoluc-EGFR 용 cDNA 를 함유하는 플라스미드로 형질 전환시켰다. 잠시,플라스미드 cDNA 동안 배양을 위해 10 분을 상온에서의 혼합으로 transfection reagent 및 혈청-무료 DMEM 의 비율에서 10ng/μl NanoLuc-EGFR:4μl 의 FuGENE:100µL 의 SFM. 믹스에 추가 되었 HEK293FT 세포에서는 최종 농도의 10ng/μl NanoLuc-EGFR 당의 6-well 플레이트,그리고 세포 배양을 위해 24h. 세포로 세척 PBS 과 분리과 트립신,그런 다음에서 수집한 미디어 포함하는 5%송아지는 태아 혈청에서 페놀 빨간 무료 DMEM., 세포 도금되었에서 50,000 세포/글로 poly-l-lysine 코팅 96-well 화이트 플레이트 및 배양을 위해 24h. 에 대한 모두 포화 운동 브렛 분석,두 개의 필터를 사용되었을 동시에 측정하는 짧은 긴 파장 발광에 해당하는 배출 파장의 기부와 수락자를 가진 분자가 각각 있었다.
실시간 ligand 연결 속도론 실험,미디어에서 제거된 세포는 다음 incubated50µL/well 의 NanoLuc 기판 furimazine 최종 농도의 10µM 에 희석 Hank 의 균형 잡힌 소금물(HBSS)., 그런 다음 세포를 CLARIOstar plate reader(Bmg Labtech,Australia)에서 5 분 동안 평형화하여 기저 판독 값을 기록했습니다. Ligands(TAMRA-EGF,FITC-melittin 및 FITC–DEDE-melittin)다음에 추가 범위의 올바른 최종 농도,NanoBRET 북이 매 90s60min37°C. 에 포화 실험,미디어에서 제거되었 세포 및 농도 범위의 탐-EGF,FITC-melittin 및 FITC–DEDE-melittin 에 추가 존재 유무의 경쟁 농도(1μm) 의 레이블이 없는 EGF 및 배양 37°C60min 습니다., Furimazine 을 10μm 의 최종 농도로 첨가 하였다. 녹음은 LUMIstar Omega(Bmg Labtech,Australia)를 사용하여 이루어졌습니다. 데이터는 단파장 방출(공여체)에 대한 장파장 방출(수용체)의 비율로부터 도출 된”원시 브렛 비”로서 제시된다. 실험은 생물학적 복제(n=3)에서 수행되었다.
의 분석 결합 약물 효과
꿀벌 독 또는 melittin 와 결합 되었 docetaxel 및 관리 농도에서 표시한 일정하지 않은 비율에서 T11 세포 24h., 세포 생존력은 이전에 언급 한 바와 같이 CellTiter-Glo 를 사용하여 평가되었다. 의 결합된 효과 꿀벌 독 또는 melittin 와 docetaxel 평가에 의해 중량에 효과가 방법을 사용하여 CompuSyn 소프트웨어(ComboSyn). 이 방법을 결정하 CI 의 효과에 따라 조합을 사이에 두 개의 에이전트(디 CI<1 은 시너지,CI>1 대립,그리고 CI=1 는 첨가제)56. 실험은 생물학적 복제(n=3)에서 수행되었다.,
동물 모델 및 치료
이러한 동물 실험에 따라 실행되는 프로토콜 승인에 의해 동물을 윤리위원회의 우. 을 시뮬레이션하기 위해 고급형 모델의 claudin-낮은 유방암,2.5×105T11 세포를 중지에서 혈청-무료 미디어 BD 마트리겔 매트릭스는 고농도(BD Bioscience)에서 1:1 비율로 총량의 100µL 고 피하 주사로의 측면 5-week-old BALB/cJ 여성(동물원센터,워싱턴,호주)을 이용하여 26-G 니다., 이 T11 세포 사용되었 lentivirally 와 불리고 ZsGreen-루시페라아제를 구축하고 정렬 세 번을 달성하기 위해 농축수의 99%이상 루시페라아제 긍정적인 세포입니다. Melittin 은 Milli-Q 물+5%덱 스트로스에 현탁되었다. Docetaxel(분)일시 중단에 25%의 트윈 80(Sigma-Aldrich),75%의 혼합물의 15.25:84.75(v/v)솔루션의 절대적인 에탄올 및 순화한 물과 보관 -20°C 즉시하기 전에 트리트먼트,docetaxel 신선하게 희석에 밀리-Q 물+5%의 포도당에서 필요한 최종니다., T11 종양 발생 3 일 후(~50mm3),마우스를 4 군(n=12 마우스/군)으로 무작위 추출 하였다. 트리트먼트 주사 intratumorally 에 일 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 게시 접종의 T11 셀,차량,melittin(5mg/kg),docetaxel(7mg/kg)또는 조합의 melittin(5mg/kg)docetaxel(7mg/kg). 동물을 2 일마다 종양 크기에 대해 모니터링하였고,변형 된 타원체 공식(부피=width2×length/2)에 의해 계산 된 부피. 종양이 800mm3 에 도달했을 때 동물을 인간적으로 희생시켰다.,
종양의 면역 조직 화학적 분석
종양 조직을 4%파라 포름 알데히드에 고정시키고,PBS 에서 3 회 세척하고,70%에탄올에 남겨 두었다. 종양을 파라핀에 묻히고 5-μm 섹션을 준비했습니다. 에 대한 hematoxylin/에오신 얼룩,슬라이드이었다 dewaxed,수화를 사용하여 감소하는 솔루션 은행의 에탄올,스테인드와 함께 길 hematoxylin,탈수를 사용하여 70%의 에탄올,스테인드와 함께 에오신,추가 탈수를 사용이 100%에탄올,삭제를 사용하여 툴루엔,에 장착되어 coverslips 를 사용하여 Acrymount IHC 미디어 설치(StatLab)., 종양 세포 세포 사멸은 TUNEL assay(In Situ Cell Death Detection Kit,Roche)에 의해 조직 섹션에서 결정되었다.
생물 발광 이미징
정확하게 추적 변화에서의 in vivo 종양의 성장이 치료와 함께,우리가 수행물 발광 분석을 사용하여 캘리퍼스 IVIS 루미나 II 미징 시스템에서 CMCA,우. 분석은 종양 발생 후 2 일마다 수행되었습니다. 마우스를 4%이소 플루 란에서 마취되기 전에 PBS 에 용해 된 150mg/kg 의 최종 농도로 200μl 의 D-루시 페린(Cayman Chemical)으로 복강 내 주사 하였다., 면 마취,마우스 내부에 위치 prewarmed 챔버의 생물 발광을 영상과 이미지 7-12 분 후,주입에는 2%isoflurane 때까지,생물 발광 신호 강도에 도달했다 꾸준한 상태입니다.
통계 분석
모든 데이터는 적어도 삼중에서 수행 된 다중 실험으로부터 유도되었다. 통계 분석은 GraphPad Prism v8(GraphPad Software Inc.)으로 수행되었습니다.(),Office Excel365(Microsoft)및 SPSS Predictive Analytics 소프트웨어(IBM,버전 26)., 에 대한 세포 생존 능력 분석,데이터는 표준화 평균 발광의 차량 상태로 간주되었다 100%생존 능력과 IC50s 에서 파생 GraphPad Prism. P-HER2(Tyr1248)및 p-EGFR(Tyr1068)을 검출하기 위해 처리 된 T11 종양에서 면역 조직 화학을 위해 비히클을 100%로 정상화 하였다., 적절한 경우로 기소에서 주요 텍스트,통계적 의미는 결정을 사용하여 홀 두루 테스트,짝이 없는 한 방법으로 ANOVA 와 터키의 제공 사후 테스트를 수정을 위한 여러 비교,양방향 분산 분석으로 반복되는 조치는 다음에 Sidak 또는 터키의 다중 비교를 테스트하거나,일반적 선형 모형(GLM). 에 대한 모든 테스트,차이점을 중요하게 간주에는 p<0.05(*),p<0.01(**)및 p<0.001(***).,
보고 요약
에 대한 자세한 정보는 연구 디자인에 자연의 연구 보고 요약 연결되어 이 문서입니다.피>
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