Chemické reagencie a protilátky
Včelí jed kolekce
venom byly shromážděny pomocí pracovníků nebo královny z několika různých populací Apid včely., Vzorky jedu odebrané z evropských včel (Apis mellifera) a čmeláků buff-tailed (Bombus terrestris audax) pocházejí z Perthu (Austrálie), Dublinu (Irsko) a Londýna (Anglie). Včelí jed byl shromážděn od 30 pracovníků každé ze tří různých kolonií z včelína nebo farmy, jak je popsáno. Včela jed z Austrálie bylo odebráno včelín udržován Centra pro Integrativní Včelí Výzkum (CIBER), který se nachází na University of Western Australia (UWA: -31.980151, 115.817919)., Včela jed z Irska bylo odebráno z jedné kolonie na včelín na Trinity College Dublin (53.343933, -6.254635), a další dvě kolonie z farmy poblíž Glasnevinského (53.383245, -6.276333) a Blanchardstown (53.384220, -6.375979). Včela a čmelák jed z Anglie byly shromážděny na Royal Holloway University of London (51.425626, -0.562987). Čmelák jed bylo odebráno 20 pracovníků, z každého 2 komerčně zakoupené kolonie, s jeden-královny, čmeláci z každé z těchto dvou kolonií používá pro sběr královna čmelák jed., Nezávislé biologické hlavní směsi byly připraveny tím, že jed z různých kolonií byly odděleny, s jedem 312 včel shromážděných celkem.
žlázový jed byl shromážděn manuální disekcí. Včely byly zachyceny u vchodu do úlu pro včely, nebo přímo z kolonie pro čmeláky, a anestetizovány oxidem uhličitým a chlazeny na ledu. Sting aparát byl členitý z každého; pak jed žlázy odstraněny a umístěny ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS)., Žlázy byly propíchnutí Jehla Terumo (25 G × 5/8) a odstředí (13,000 g, 10 min, 4 °C), a odebraný supernatant, obsahující jed v kapalné suspenze. Protein koncentrace každé master mix byl kvantifikován s čisticím prostředkem Kompatibilní Protein Assay (Bio-Rad), měření absorbance při 750 nm s Milénium Vědy BioTek PowerWave XS2 (Gen 5 1.11 Software, Verze 1.11.5). Každý hlavní mix byl pak aliquoted a skladován při -80 °C.,
Buněčné linie a kultury podmínky
Všechny buněčné linie byly zakoupeny z American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), s výjimkou pro HEK293FT buňky, které byly zakoupeny od Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Austrálie), SUM149 a SUM159, které byly získány z Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA), a T11 a B. 15 buněk, které byly laskavě poskytl Karel Perou a Ljuba Varticovski z University of North Carolina v Chapel Hill a National Institutes of Health, respektive. T11 a B. 15 jsou velmi dobře charakterizované buněčné linie37, 38.,
buňky byly inkubovány při 37 °C a 5% CO2 a doplněny o 1% antibioticko–antimykotické. Hdfa (normální primární dospělý lidský dermální fibroblast) buňky byly kultivovány v DMEM s 10% fetálního bovinního séra (FBS). MCF 10A a MCF-12A (lidský prsní imortalizované epiteliální buňky, nontransformed) byly udržovány v DMEM/F-12 s doplňky (5% fetální koňské sérum, 20 ng/mL epidermálního růstového faktoru, 10 µg/µL inzulínu, 100 ng/mL cholera toxin, a 500 ng/mL hydrocortisone). NIH/3T3 (myší embryonální fibroblast) buňky byly udržovány v DMEM s 10% FBS., HEK293FT (lidských embryonálních ledvinových buněk 293 stabilně vyjadřující SV40 large T antigen) byly kultivovány v DMEM s 10% FBS a doplňky (1% glutamin a 0,4 mg/mL G418 Geneticin, Gibco). MCF7 (human luminal a breast cancer) byl udržován v MEM α s 10% FBS a doplňky (1% z každého pyruvátu sodného, hydrogenuhličitanu sodného a nepodstatných aminokyselin). T – 47D a ZR-75-1 (oba lidské luminální karcinom prsu) byly kultivovány v RPMI s 10% FBS. MDA-MB-231 (human claudin-low breast cancer) byl kultivován v DMEM s 10% FBS., SUM149 (lidský bazální karcinom prsu) byl kultivován v F-12 s 10% FBS. SUM159 (human claudin-low breast cancer) byl kultivován v F-12 s 5% FBS a doplňky (5 µg/mL inzulínu a 1 µg/mL hydrokortizonu). MDA-MB-453 (lidský HER2 obohacený karcinom prsu) byl kultivován v DMEM s 10% FBS. SKBR3 (human HER2-enriched breast cancer) byl kultivován v RPMI s 10% FBS a 1% pyruvátu sodného. p53-T11 (murine claudin-low breast cancer) byl udržován v rpmi 1640 médiu s 10% FBS. BRCA-B. 15 (myší bazální karcinom prsu) byl udržován v rpmi 1640 médiu s 10% FBS.,
testy životaschopnosti buněk
životaschopnost buněk byla stanovena testem životaschopnosti luminiscenčních buněk podle protokolu dodavatele. Buňky byly naneseny na 96-well kultivační destičky a inkubovány při 37 °C a 5% CO2 po dobu 24 h. Pro odpověď na dávku testy, média, byl zlikvidován a nahrazen média obsahující uvedené koncentrace včelí jed nebo peptidu a kultivovány po dobu 24 h., Pro životaschopnost buněk nad 60 min byly buňky ošetřeny IC50 včelího jedu nebo melittinu pro každou buněčnou linii v krátkých časových intervalech po dobu 1 hodiny a životaschopnost byla stanovena ihned po léčbě. Pro stanovení životaschopnosti byly buňky inkubovány s činidlem CellTiter-Glo (CTG) 2.0 po dobu 10 minut. Životaschopnost buněk byla kvantifikována měřením luminiscence pomocí Multilabelové Čtečky EnVision 2102 (PerkinElmer). Pokusy byly prováděny v biologických replikátech (n = 3).,
Výroba primární monoklonální protilátka proti melittin
produkce Protilátek byla provedena v souladu s protokoly schváleny Zvířat, Etické komise Harry Perkins Institute of Medical Research. Samice a / J myši byly imunizovány včelím jedem shromážděným v Austrálii. Myší obdržel intraperitoneální injekce 12 µg jedu v Kompletním Freundově Adjuvans (Difco), následuje podporu v Neúplné Freund ‚ s Adjuvantní na Den 29 a vodného podporu v PBS na 7 µg/myš v Den 49. Myši byly krváceny v den 60 a Sera byla testována ELISA., Nejlepší respondent byl zvýšen 7 µg včelího jedu v PBS 4 dny před fúzí. Buňky sleziny byly fúzovány s Sp2/o myelomovými buňkami podle standardních postupů82. Supernatanty obsahující protilátky byly testovány ELISA. Hybridoma clone 3B9 byl vybrán pro další studium. Protilátky byl produkován rostoucí hybridomu buněk v bioreaktorech v Hybridomu, Médium bez Séra (Gibco). Protilátka byla čištěna proteinovou G-Sepharosovou chromatografií. Vyčištěná protilátka byla dialyzována v PBS (pH 7,3). Protilátka byla od nynějška označována jako protilátka proti melittinu (3B9).,
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Jedy a peptidy byly pozlacené ven do jasné křivky založené na 96jamkové desky na 5 µg/mL v karbonátovém pufru a inkubovány při 4 °C po dobu 24 h. Tekutina byla odstraněna a destičky promyty třikrát v roztoku, 0,05% TWEEN-20 („Tween-20,“ Sigma-Aldrich) v PBS. Primární protilátky byly přidány do jamek s 1:2 ředění od 10 µg/mL, v ředicí roztok (0.1% bovinního sérového albuminu (BSA) v PBS) a inkubovat po dobu 1 h při pokojové teplotě. Primární protilátky byly odstraněny a desky se třikrát promyly v 0.,05% Tween – 20 v PBS. Do jamek byla přidána sekundární protilátka specifická pro polyclonální kozu proti myším IgG γ-chain (1:1000 v ředidle) a inkubována po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Primární protilátky byly odstraněny a desky se třikrát promyly v 0,05% Tween – 20 v PBS. ELISA-rozvoj pufru, roztok čištěné vody obsahující 10% kyselina citrónová (pH 4.2), 2% ABTS, a 0,1% H2O2 bylo přidáno do jamek, a destičky byly inkubovány ve tmě při pokojové teplotě po dobu 15 min., Absorbance byla zaznamenána při 405 nm pomocí čtečky VICTOR Light plate se softwarem Wallac 1420 Manager (PerkinElmer). Kontrolou byla myší monoklonální IgG protilátka (28/00 8C1-6), která reaguje s lidským IL-12, aplikovaná na peptid melittinu na destičce ELISA. Pokusy byly prováděny v biologických replikátech (n = 3).
Anti-melittin protilátek, soutěže, experimenty
HDFa a SUM159 buňky byly naneseny na 96-well kultivační destičky a inkubovány při 37 °C a 5% CO2 po dobu 24 h., Zvyšující se koncentrace anti-melittin protilátkou byly inkubovány s IC50 koncentrace honeybee venom nebo melittin pro každé buněčné linie po dobu 1 h při pokojové teplotě, a pak se přidá do buňky na 24 h. Životaschopnost buněk byla stanovena, jak je popsáno v „životaschopnosti Buněk testy“. Pokusy byly prováděny v biologických replikátech (n = 3).
Western blot
Buňky byly naočkuje na 6-desky při hustotě 300 000 buněk/no a inkubovány při 37 °C a 5% CO2 po dobu 24 h., Experimenty s buněčnou kulturou byly provedeny tak, jak je popsáno, a poté byl dodržen standardní protokol Western blot, jak je zde popsáno. Buňky byly promyty studenou PBS a roztrhli se studenou bílkovin lyzačního pufru (2% dodecylsulfát sodný (SDS), 125 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8). Vzorky byly sonikovány po dobu 10 s při 10 mA a koncentrace bílkovin kvantifikovány proteinovým testem kompatibilním s detergentem (Bio-Rad). Stejné množství proteinů bylo smícháno s nakládacím pufrem (Laemmli Sample pufr, Bio-Rad) doplněným redukčním činidlem dithiothreitol (DTT)., Proteinové vzorky byly denaturovány varem o teplotě 95 °C po dobu 5 min, načten do Mini-PROTEAN prefabrikovaných gelů (Bio-Rad) a podrobeny elektroforéze při 100 v, a poté přeneseny na PVDF membrány (Bio-Rad) s Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) po dobu 7 min. Membrány byly inkubovány s TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) s 5% odtučněného mléka blokovat nespecifické vazby. Membrány byly inkubovány přes noc při 4 °C s primární protilátky ředěné v 3% BSA a 0,02% azid sodný., Signál byl detekován pomocí substrátu Luminata Crescendo Western HRP (Millipore) se zobrazovacím systémem ChemiDoc MP (Bio-Rad) se systémem Image Lab Software (Bio-Rad, verze 6). Západní skvrny byly odvozeny ze stejného experimentu a zpracovány paralelně. Nezakryté skeny západních blotů jsou uvedeny v doplňkových fících. 10–15.
průtoková cytometrie
apoptóza a nekróza byly hodnoceny pomocí Annexin v-FITC apoptóza Detection Kit I (Bd Biosciences) podle protokolu výrobce. Buňky SUM159 byly pokoveny v kultivačních deskách 6 pro 24 h., Média byla pak vyřazeny a nahrazeny média obsahující honeybee venom nebo melittin (IC50 koncentrace) a kultivovány po dobu 60 min. Buňky byly shromážděny s trypsinem a média, a centrifugovány (1000 g, 5 min, 24 °C), promyje se studenou PBS, centrifugovány (1000 g, 5 min, 24 °C) a resuspendovány v 1× binding buffer. Buňky byly připraveny na koncentraci 1 milion buněk / mL v 1× vazebném pufru. Vzorky byly inkubovány s FITC a PI (5 µL každého) ve tmě po dobu 15 minut., Přítomnost živých, mrtvých, apoptotických či nekrotických buněk byla hodnocena s BD Accuri C6 Cytometrem (BD Biosciences, San Jose, USA) s BD Accuri C6 softwaru a analyzována FlowJo™ (Ashland, spojené státy, Verze pro Windows 7). Pokusy byly prováděny v biologických replikátech (n = 3). Gating strategie jsou uvedeny v doplňkovém Obr. 16.
Živé buňky mikroskopem
SKBR3 buňky byly pozlacené do sklenice-dno microwell misky (10 × 35 mm, MatTek) a inkubovány po dobu 24 h., Mikrovlna byla ponechána k rovnováze v inkubační komoře NIKON Eclipse Ti confocal microscope stage-top (37 ° C a 5% CO2) po dobu 20 minut. 20× cíle byl použit s Kohler zarovnání, a snímky byly pořízeny každou minutu z 10 min 1 h po ošetření s IC50 honeybee venom shromážděné v Austrálii., Autoři na vědomí, zařízení a vědeckou a technickou pomoc, které nabízí Národní Zobrazovací Zařízení, Národní Spolupráce Výzkumné Infrastruktury Strategie (NCRIS) schopnosti, stejně jako Australský Mikroskopie & Microanalysis Výzkumné Zařízení, a to jak v Centru pro Mikroskopii, Charakterizace a Analýzy (CMCA), UWA, zařízení financované Univerzity, Stát a Commonwealth Vlády.,
Skenování elektronové mikroskopie
Sklo coverslips (12-mm průměr, Menzel, Thermo Fisher Scientific) byly potaženy poly-l-lysin hydrobromid (Sigma-Aldrich) po dobu 20 min a potom se promyje dvakrát čištěná voda. SUM159 buňky byly naočkuje na sklíčka při hustotě 62 500 buněk/no a inkubovány při 37 °C a 5% CO2 po dobu 24 h. Buňky byly promyty dvakrát PBS a pak se zpracuje s vozidlem nebo IC50 koncentrace včelího jedu a melittin za 1 h., Buňky byly dvakrát promyty PBS, poté fixovány 4% formaldehydem v PBS po dobu 25 minut a poté se znovu třikrát promyly PBS. V rámci přípravy pro mikroskopii vzorky byly ponořeny do 2,5% glutaraldehyd a byly inkubovány při 4 °C po dobu 2 h. Vzorky byly promyty deionizovanou vodou a ponořen ve zvyšující se koncentrace ethanolu (50%, 70%, 95%, 100%, a pak 100% absolutní „suché“ ethanol). Mezi každým ponořením byly vzorky dehydratovány ve specializované mikrovlnné troubě (PELCO, Biowave 34700 laboratorní mikrovlnný systém)., Dehydratace proces byl dokončen s Kritický Bod Sušení, Přístroje E3000 nahradit ethanolu ve vzorku s superkritické CO2. Zpracované kryty byly namontovány na držáky SEM (ProSciTech) s uhlíkovými jazýčky. Vzorky byly potaženy platinou 3 nm, aby byly elektronicky vodivé, než byly vizualizovány pod skenovacím elektronovým mikroskopem (Zeiss 1555 VP-FESEM) na CMCA, UWA. Snímky byly pořízeny s detektorem v objektivu v pracovní vzdálenosti 2,6 mm, clonou 30 µm a urychlovacím napětím 5 kV., Snímky byly analyzovány pomocí softwaru pro analýzu obrazu Fidži (ImageJ)83.
Imunofluorescence
Sklo coverslips (12-mm průměr, Menzel, Thermo Fisher Scientific) byly umístěny do 24-no desek a potažené poly-l-lysinem (Sigma-Aldrich) po dobu 20 min a potom se promyje dvakrát čištěná voda. SUM159 buňky byly naočkuje na sklíčka a inkubovány při 37 °C a 5% CO2 po dobu 24 h. Buňky byly ošetřeny po dobu 30 min s vozidlem, nebo IC50 honeybee venom, melittin, RGD1-melittin, a v případě ekvivalentní molární koncentrace jako melittin pro DEDE-melittin., Buňky byly dvakrát promyty PBS, poté fixovány 4% paraformaldehydem v PBS po dobu 25 minut a poté se třikrát promyly PBS. Nespecifická vazba na protilátky byla blokována za použití 5% normálního kozího séra (Thermo Fisher Scientific) v PBS po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Do buněk byly přidány primární protilátky, včetně monoklonální Anti-melittinové protilátky (5 µg/mL) a 1:500 anti-EGFR (Abcam). Vzorky byly inkubovány s jemným houpáním při 4 ° C přes noc., Buňky byly třikrát promyty PBS a poté inkubovány s 1:500 Alexa Fluor 488 goat anti-myší sekundární protilátka, 1:500 Alexa Fluor 594 kozí anti-králičí sekundární protilátky, a Hoechst (1:5000) v PBS při pokojové teplotě po dobu 1 h. Vzorky byly třikrát promyty PBS a montáž na sklo coverslips s SlowFade Diamond Antifade Krycí (Thermo Fisher Scientific). Snímky byly zobrazeny pomocí obráceného mikroskopu confocal fluorescence Nikon ti-E. Snímky byly pořízeny pomocí cíle 20× air (NA 0.,75), a sekvenční buzení pomocí vlnové délky 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (Alexa Fluor 488 sekundární protilátka) a 561 nm (Alexa Fluor 594 sekundární protilátky). Obrázky byly shromážděny pomocí softwaru NIS-C Elements a zpracovány pomocí Fidži (ImageJ) na CMCA83.
bioluminiscenční rezonanční přenos energie (BRET)
interakce receptoru a ligandu byly hodnoceny s BRET pomocí metody podobné metodě popsané předchozí84, 85., BRET zahrnuje nonradiative přenos energie (dipól–dipól) mezi dvěma bílkoviny nebo molekuly zájmu označeny buď dárce luciferase nebo akceptor fluorophore po oxidaci substrátu tím, luciferase a následné emise light54. Značky FITC byly konjugovány s n terminusem melittinu (FITC-melittin) a DEDE-melittinu (FITC–DEDE-melittin). Hek293 buňky stabilně exprimující velký t antigen SV40 (HEK293FT) byly pokoveny na 6-dobře desky při hustotě 550.000 buněk/dobře pro 24 h., Hek293ft buňky byly transfekovány plazmidy obsahujícími cDNA pro NanoLuc-EGFR za použití Fugenu. Krátce plasmidu cDNA byla inkubována po dobu 10 min při teplotě místnosti se směs transfekci činidlem a bez séra DMEM v poměru 10 ng/µL NanoLuc-EGFR: 4 µL FuGENE: 100 µL SFM. Mix byla přidána do HEK293FT buňkám v konečné koncentraci 10 ng/µL NanoLuc-EGFR na no 6-deska, a buňky inkubovány po dobu 24 h. Buňky byly promyty PBS a samostatně stojící s trypsinem, pak shromažďovány v médiu obsahujícím 5% fetální telecí sérum v fenolové červeně-zdarma DMEM., Buňky byly naočkuje na 50 000 buněk/no do poly-l-lysin-coated 96-no bílé talíře a inkubovány po dobu 24 h. Pro oba nasycení a kinetické BRET testy, dva filtry byly použity současně měřit krátké a dlouhé vlnové délky luminiscence odpovídající emisní vlnové délky donor a akceptor molekuly, resp.
Pro real-time ligand sdružení kinetických experimentů, média byla odstraněna z buněk, které byly inkubovány s 50 µL/jamka pro NanoLuc substrátu furimazine do konečné koncentrace 10 µM zředěný v hankově Vyváženém solném Roztoku (HBSS)., Buňky byly potom vyrovnává v CLARIOstar plate reader (BMG Labtech, Austrálie) po dobu 5 min, aby záznam bazální hodnoty. Ligandů (TAMRA-EGF, FITC-melittin, a FITC–DEDE-melittin) pak byly přidány k řadě správné konečné koncentrace, a NanoBRET nahrávky pořízené každých 90 s po dobu 60 min při 37 °C. Pro nasycení experimenty, média byla odstraněna z buněk, a rozmezí koncentrací TAMRA-EGF, FITC-melittin, a FITC–DEDE-melittin přidán v přítomnosti nebo nepřítomnosti konkurenční koncentraci (1 µM) z neznačený EFG a inkubovány při 37 °C po dobu 60 min ve tmě., Furimazin byl přidán v konečné koncentraci 10 µM. Nahrávky byly vyrobeny pomocí LUMIstar Omega (BMG Labtech, Austrálie). Data jsou prezentována jako „surový poměr BRET“, odvozený z poměru emise s dlouhou vlnovou délkou (akceptor) nad emisemi s krátkou vlnovou délkou (dárce). Pokusy byly prováděny v biologických replikátech (n = 3).
Analýza kombinované účinky drog
Honeybee venom nebo melittin je v kombinaci s docetaxelem a podávat v uvedených koncentracích v nonconstant poměr v T11 buněk za 24 h., Životaschopnost buněk byla hodnocena pomocí CellTiter-Glo, jak bylo uvedeno výše. Kombinovaný účinek včelího jedu nebo melittinu s docetaxelem byl hodnocen metodou medián dávkového účinku pomocí softwaru CompuSyn (ComboSyn). Tato metoda určuje CI založené na účinku kombinace mezi dvěma agenty (kde CI < 1 je synergický, CI > 1 je antagonistický, a CI = 1 je aditivní), 56. Pokusy byly prováděny v biologických replikátech (n = 3).,
model a ošetření zvířat
tyto pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s protokoly schválenými komisí pro etiku zvířat UWA. Simulovat pokročilý model claudin-low prsu, 2.5 × 105 T11 buňky byly suspendovány v séru-volná média a BD Matrigel Matice Vysoká Koncentrace (BD Bioscience) v poměru 1:1 na celkový objem 100 µL a injikován subkutánně do boků 5-týden-staré BALB/cJ ženy (Živočišných Zdrojů Centrum, WA, Austrálie) pomocí 26-G jehly., Na T11 buňky byly použity lentivirally transduced s ZsGreen-luciferase postavit a řazeny tři krát, aby se dosáhlo obohacením lepší než 99% luciferase-pozitivní buňky. Melittin byl suspendován ve vodě Milli-Q + 5% dextrózy. Docetaxel (ve formě prášku) byl suspendován v 25% TWEEN 80 (Sigma-Aldrich), a 75% směsi 15.25:84.75 (v/v) roztoku absolutní ethanol a voda čištěná a uchovávána při -20 °C. Bezprostředně před zahájením léčby docetaxelem byl čerstvě zředěný v Milli-Q vody + 5% dextrózy na požadovanou konečnou koncentraci., Tři dny po vzniku nádorů T11 (~50 mm3) byly myši randomizovány do 4 skupin (n = 12 myší/skupiny). Ošetření bylo aplikováno intratumorally na dny 3, 5, 7, 9, 11, 13, a 15 po očkování T11 buněk, vozidla, melittin (5 mg/kg), docetaxel (7 mg/kg), nebo kombinace melittin (5 mg/kg) a docetaxel (7 mg/kg). Zvířata byla sledována na velikost nádoru každé 2 dny a objemy vypočítané modifikovaným elipsoidním vzorcem (objem = width2 × délka/2). Zvířata byla lidsky obětována, když nádory dosáhly 800 mm3.,
Imunohistochemická analýza nádorů
Nádorové tkáně byly fixovány v 4% paraformaldehydu, třikrát promyty v PBS a ponechány v 70% ethanolu. Nádory byly vloženy do parafínu a byly připraveny sekce 5 µm. Pro hematoxylin/eosin barvení, skluzavky byly odparafínované, hydratované pomocí klesající řešení banky ethanolu, potřísněné Gill hematoxylin, dehydrované pomocí 70% ethanolu, obarvené eosinem, další dehydratovaná pomocí 100% ethanolu, vymazat pomocí toluenu a montáž v coverslips pomocí Acrymount IHC montáž média (StatLab)., Apoptóza nádorových buněk byla stanovena v tkáňových částech tunelovým testem (In Situ cell death Detection Kit, Roche).
Bioluminiscence zobrazovací
přesně sledovat změny v in vivo růst nádoru léčby, provedli jsme bioluminiscence analýza pomocí Třmenu IVIS Lumina II zobrazovací systém CMCA, UWA. Analýzy byly prováděny každé 2 dny po vzniku nádorů. Byl myším injikován intraperitoneálně s 200 µL D-Luciferin (Cayman Chemical) v konečné koncentraci 150 mg/kg rozpuštěno v PBS před narkóze na 4% isofluranu., Jednou v narkóze, myši byly umístěny uvnitř předehřáté komory bioluminiscence imager a odrážel 7-12 min po injekci, pod 2% isofluranu, dokud bioluminiscence intenzity signálu bylo dosaženo ustáleného stavu.
Statistická analýza
všechna data byla odvozena z více experimentů prováděných alespoň ve trojím vyhotovení. Statistické analýzy byly provedeny pomocí GraphPad Prism V8 (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft) a software prediktivní analytiky SPSS (IBM, verze 26)., U testů životaschopnosti buněk byly údaje normalizovány na průměrnou luminiscenci stavu vozidla, která byla považována za 100% životaschopnost, přičemž IC50s byla odvozena v Graphpad Prism. Pro imunohistochemii v léčených T11 nádorech pro detekci p-HER2 (Tyr1248) a p-EGFR (Tyr1068) bylo vozidlo normalizováno na 100%., Kde je to vhodné a jak je obžalován v původním znění, statistická významnost byla určena pomocí nepárové dvoustranný studentův t-test, nepárový one-way ANOVA s Tukey HSD post hoc test korekce pro mnohonásobné porovnávání, two-way ANOVA s opakovaným opatření následuje Sidak nebo Tukey multiple-comparison test, nebo zobecněný lineární model (GLM). Pro všechny testy, rozdíly byly považovány za signifikantní při p < 0.05 (*), p < 0.01 ( * * ) a p < 0.001 (***).,
souhrn zpráv
Další informace o návrhu výzkumu jsou k dispozici v souhrnu zpráv o výzkumu přírody propojeném s tímto článkem.
Leave a Reply