chemische reagentia en antilichamen
Bijengifverzameling
het gif werd verzameld met behulp van arbeiders of koninginnen uit verschillende populaties van Apidenbijen., Gifmonsters verzameld van Europese honingbijen (Apis mellifera) en buff-tailed hommels (Bombus terrestris audax) afkomstig uit Perth (Australië), Dublin (Ierland), en Londen (Engeland). Honingbijengif werd verzameld bij 30 arbeiders van elk van drie verschillende kolonies van een bijenstal of boerderij zoals beschreven. Honingbijengif uit Australië werd verzameld uit een bijenstal die werd onderhouden door het Centre for Integrative Bee Research (CIBER), gevestigd aan de Universiteit van West-Australië (UWA: -31.980151, 115.817919)., Honingbijengif uit Ierland werd verzameld bij een kolonie bij Trinity College Dublin (53.343933, -6.254635), en de andere twee kolonies van boerderijen bij Glasnevin (53.383245, -6.276333) en Blanchardstown (53.384220, -6.375979). Honingbij en hommelgif uit Engeland werd verzameld aan de Royal Holloway University Of London (51.425626, -0.562987). Hommelvergif werd verzameld van 20 arbeiders uit elk van de 2 commercieel gekochte kolonies, waarbij de single-queen hommelvergif uit elk van deze twee kolonies werd gebruikt voor de verzameling van hommelvergif., Onafhankelijke biologische meestermixen werden bereid door het gif van verschillende kolonies gescheiden te houden, met het gif van 312 bijen verzameld in totaal.
glandulair gif werd verzameld door handmatige dissectie. Bijen werden gevangen bij de ingang van de korf voor honingbijen, of rechtstreeks uit de kolonie voor hommels, en verdoofd met kooldioxide en gekoeld op ijs. De steek apparaat werd ontleed van elk individu; vervolgens het GIF klier verwijderd en geplaatst in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)., De klieren werden doorboord met een Terumo naald (25 g × 5/8) en gecentrifugeerd (13.000 g, 10 min, 4 °C), en het supernatant verzameld, met gif in vloeibare suspensie. De eiwitconcentratie van elke Mastermix werd gekwantificeerd met een Detergent Compatible Protein Assay (Bio-Rad), waarbij de absorptie bij 750 nm werd gemeten met een Millennium Science BioTek PowerWave XS2 (Gen 5 1.11 Software, Versie 1.11.5). Elke Mastermix werd vervolgens aliquoteerd en opgeslagen bij -80 °C.,
cellijnen en cultuur voorwaarden
Alle cellijnen werden gekocht bij de American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), behalve voor HEK293FT cellen die werden gekocht van Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australië), SUM149 en SUM159 die werden verkregen uit Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA), en T11 en B. 15 cellen die werden verzorgd door Charles Perou en Lyuba Varticovski van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill en Nationale Instituten van Gezondheid, respectievelijk. T11 en B. 15 zijn zeer goed gekarakteriseerde cellijnen 37, 38.,
cellen werden geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2 en aangevuld met 1% antibioticum–antimycotisch. HDFa (normal primary adult human dermale fibroblast) cellen werden gekweekt in DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS). MCF 10A en MCF-12A (humane mammary vereeuwigde epitheliale cellen, niet-getransformeerd) werden gehandhaafd in DMEM/F-12 met supplementen (5% foetaal paardenserum, 20 ng/mL epidermale groeifactor, 10 µg/µL insuline, 100 ng/mL choleratoxine en 500 ng/mL hydrocortison). NIH / 3T3 (muriene embryonale fibroblast) cellen werden gehandhaafd in DMEM met 10% FBS., HEK293FT (humane embryonale nier 293 cellen die stabiel het SV40 grote T antigeen tot expressie brengen) werd gekweekt in DMEM met 10% FBS en supplementen (1% glutamine en 0,4 mg/mL G418 Geneticine, Gibco). MCF7 (humaan luminaal a-borstkanker) bleef behouden in MEM α met 10% FBS en supplementen (elk 1% natriumpyruvaat, natriumbicarbonaat en niet-essentiële aminozuren). T-47D en ZR-75-1 (beide humane Luminal a borstkanker) werden gekweekt in RPMI met 10% FBS. MDA-MB-231 (menselijke claudin-lage borstkanker) werd gekweekt in DMEM met 10% FBS., SUM149 (menselijke basaal-achtige borstkanker) werd gekweekt in F-12 met 10% FBS. SUM159 (humane claudin-lage borstkanker) werd gekweekt in F-12 met 5% FBS en supplementen (5 µg/mL insuline en 1 µg/mL hydrocortison). MDA-MB-453 (menselijke HER2-verrijkte borstkanker) werd gekweekt in DMEM met 10% FBS. SKBR3 (humaan HER2-verrijkte borstkanker) werd gekweekt in RPMI met 10% FBS en 1% natriumpyruvaat. p53-T11 (muriene claudin-lage borstkanker) werd gehandhaafd in rpmi 1640 medium met 10% FBS. BRCA-B. 15 (muriene basale borstkanker) werd gehandhaafd in rpmi 1640 medium met 10% FBS.,
levensvatbaarheid van cellen
levensvatbaarheid van cellen werd bepaald door de luminescente levensvatbaarheid van cellen volgens het Protocol van de leverancier. Cellen werden geplateerd in 96-wells kweekplaten en geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur. voor de dosis-respons assays, media werd weggegooid en vervangen door media met aangegeven concentraties van bijengif of peptide en gekweekt gedurende 24 uur., Voor de levensvatbaarheid van de cellen gedurende 60 minuten werden de cellen behandeld met de IC50 van het gif van de honingbij of melittine voor elke cellijn gedurende korte tijdsintervallen gedurende 1 uur, en de levensvatbaarheid werd onmiddellijk na de behandeling bepaald. Om de levensvatbaarheid te bepalen, werden de cellen gedurende 10 minuten geïncubeerd met CellTiter-Glo (CTG) 2.0-reagens. De levensvatbaarheid van de cellen werd gekwantificeerd door luminescentie te meten met behulp van een Envision 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer). Experimenten werden uitgevoerd in biologische replicaten (n = 3).,
productie van een primair monoklonaal antilichaam tegen melittine
productie van antilichamen werd uitgevoerd in overeenstemming met protocollen goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Harry Perkins Institute of Medical Research. Vrouwelijke A / J muizen werden geïmmuniseerd met honingbij GIF verzameld in Australië. Muizen kregen intraperitoneale injecties van 12 µg venom in Complete Freund ’s adjuvans (Difco), gevolgd door een boost in onvolledige Freund’ s adjuvans op dag 29 en een waterige boost in PBS bij 7 µg/muis op dag 49. Muizen werden op dag 60 gebloed en sera werden door ELISA getest., De beste responder werd versterkt met 7 µg honingbijengif in PBS 4 dagen vóór de fusie. Miltcellen werden gesmolten met SP2 / o myeloomcellen volgens standaardprocedures82. Antilichaam-bevattende supernatanten werden gescreend met ELISA. Hybridoma kloon 3B9 werd geselecteerd voor verder onderzoek. Het antilichaam werd geproduceerd door de hybridomacellen te kweken in bioreactoren in het Hybridomaserumvrij Medium (Gibco). Het antilichaam werd gezuiverd door proteã ne G-Sepharose chromatografie. Gezuiverd antilichaam werd gedialyseerd in PBS (pH 7,3). Het antilichaam werd voortaan aangeduid als het anti-melittin antilichaam (3B9).,
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Venoms en peptiden werden bij 5 µg/mL in carbonaatbuffer in heldere, op curve gebaseerde 96-wells platen geplaatst en gedurende 24 uur geïncubeerd bij 4 °c. de vloeistof werd verwijderd en de platen werden driemaal gewassen in een oplossing van 0,05% TWEEN-20 (“Tween-20,” Sigma-Aldrich) in PBS. De primaire antilichamen werden toegevoegd aan de putten met 1:2 verdunningen vanaf 10 µg/mL in verdunningsmiddel (0,1% bovine serum albumine (BSA) in PBS), en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De primaire antilichamen werden verwijderd en de platen werden drie keer in 0 gewassen.,05% Tween-20 in PBS. Het polyclonal goat anti-mouse IgG γ-chain-specific secondary antilichaam werd toegevoegd aan de putjes (1:1000 in verdunningsmiddel) en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De primaire antilichamen werden verwijderd en de platen werden driemaal gewassen in 0,05% Tween-20 in PBS. ELISA-ontwikkelende buffer, een oplossing van gezuiverd water met 10% citroenzuur (pH 4.2), 2% ABTS, en 0,1% H2O2, werd toegevoegd aan de putten, en platen werden geïncubeerd in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten., De absorptie werd geregistreerd bij 405 nm met behulp van de VICTOR Light plate reader met Wallac 1420 Manager Software (PerkinElmer). De controle was het monoklonale IgG-antilichaam van de muis (28/00 8C1-6) dat reageert met humaan IL-12, aangebracht op het melittinepeptide op de ELISA-plaat. Experimenten werden uitgevoerd in biologische replicaten (n = 3).
anti-melittine antilichaam competitie experimenten
HDFa en SUM159 cellen werden geplateerd in 96-wells kweekplaten en geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur., Toenemende concentraties van het anti-melittine antilichaam werden geïncubeerd met de IC50 concentraties van honingbij GIF of melittine voor elke cellijn gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, en vervolgens toegevoegd aan de cellen gedurende 24 uur. Experimenten werden uitgevoerd in biologische replicaten (n = 3).
Western blot
cellen werden geplateerd op 6-putplaten met een dichtheid van 300.000 cellen / put en geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur., De experimenten van de celcultuur werden uitgevoerd zoals beschreven, en toen werd het standaard Western blot-protocol gevolgd zoals hierin beschreven. Cellen werden gewassen met koude PBS en gelyseerd met koude eiwit lysis buffer (2% natriumdodecylsulfaat (SDS), 125 mmol/l Tris-HCl, pH 6,8). Monsters werden gedurende 10 s bij 10 mA gesoniceerd en eiwitconcentraties werden gekwantificeerd met de Detergent Compatible Protein Assay (Bio-Rad). Gelijke hoeveelheden eiwitten werden gemengd met ladingsbuffer (Laemmli Monsterbuffer, Bio-Rad) aangevuld met het reductiemiddel dithiothreitol (DTT)., Eiwitmonsters werden gedenatureerd door gedurende 5 minuten bij 95 °C te koken, in mini-PROTEAN prefab gels (Bio-Rad) te laden en bij 100 V aan elektroforese te worden onderworpen, en vervolgens gedurende 7 minuten met het Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) over te brengen op PVDF-membranen (Bio-Rad). Membranen werden geïncubeerd met Tbst (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl en 0,1% Tween-20) met 5% vetvrije melk om niet-specifieke binding te blokkeren. Membranen werden ‘ s nachts bij 4 °C geïncubeerd met de primaire antilichamen verdund in 3% BSA en 0,02% natriumazide., Het signaal werd gedetecteerd met Luminata Crescendo Western HRP substraat (Millipore) met het ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) met Image Lab Software (Bio-Rad, versie 6). Western blots werden afgeleid van hetzelfde experiment en parallel verwerkt. Ongesneden scans van de westelijke vlekken worden geleverd in aanvullende vijgen. 10–15.
flowcytometrie
apoptose en necrose werden beoordeeld met behulp van de Annexine V-FITC apoptose Detection Kit I (Bd Biosciences) volgens het Protocol van de fabrikant. SUM159 cellen werden geplateerd in 6-put cultuurplaten voor 24 uur., Media werden vervolgens weggegooid en vervangen door media die honingbijengif of melittine (IC50-concentraties) bevatten en gedurende 60 minuten gekweekt. Cellen werden verzameld met trypsine en media, en gecentrifugeerd (1000g, 5 min, 24 °C), gewassen met koude PBS, gecentrifugeerd (1000g, 5 min, 24 °C), en resuspendeerd in 1× bindende buffer. De cellen werden bereid tot een concentratie van 1 miljoen cellen / mL in 1 × bindende buffer. De monsters werden gedurende 15 minuten in het donker geïncubeerd met FITC en PI (5 µL van elk)., De aanwezigheid van levende, dode, apoptotische of necrotische cellen werd beoordeeld met de BD Accuri C6 Cytometer (Bd Biosciences, San Jose, USA) met de BD Accuri C6 software, en geanalyseerd met FlowJo™ (Ashland, USA, Windows versie 7). Experimenten werden uitgevoerd in biologische replicaten (n = 3). De gating strategieën zijn weergegeven in aanvullende Fig. 16.
Live-cell microscopie
SKBR3 cellen werden in een glazen bodem microwell schaal (10 × 35 mm, MatTek) geplateerd en gedurende 24 uur geïncubeerd., De microwellschotel werd gedurende 20 minuten in een Nikon Eclipse ti confocal microscoop fase-top incubatiekamer (37 °C en 5% CO2) in evenwicht gehouden. De 20× doelstelling werd gebruikt met Kohler uitlijning, en beelden werden elke minuut genomen van 10 minuten voor tot 1 uur na de behandeling met de IC50 van honingbij GIF verzameld in Australië., De auteurs erkennen de faciliteiten en wetenschappelijke en technische bijstand die worden aangeboden door de National Imaging Facility, een National Collaborative Research Infrastructure Strategy (NCRIS), evenals de Australian Microscopy & Microanalysis Research Facility, beide in het Centre for Microscopy, Characterization and Analysis (CMCA), UWA, een faciliteit die wordt gefinancierd door de overheid van de Universiteit, de staat en het Gemenebest.,
Scanning elektronenmicroscopie
Glass coverslips (12 mm diameter, Menzel, Thermo Fisher Scientific) werden gedurende 20 minuten gecoat met poly-l-Lysinehydrobromide (Sigma-Aldrich) en vervolgens tweemaal gewassen met gezuiverd water. SUM159 cellen werden geplateerd op de glasplaten met een dichtheid van 62.500 cellen / put en geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur. cellen werden tweemaal gewassen met PBS en vervolgens behandeld met vehicle of de IC50 concentraties van honingbij gif en melittine gedurende 1 uur., De cellen werden tweemaal met PBS gewassen, dan met 4% formaldehyde in PBS gedurende 25 min, en dan opnieuw drie keer met PBS gewassen. Ter voorbereiding op de microscopie, werden de monsters ondergedompeld in 2,5% glutaaraldehyde en werden geïncubeerd bij 4 °C gedurende 2 uur. de monsters werden gewassen met gedeïoniseerd water en ondergedompeld in toenemende concentraties van ethanol (50%, 70%, 95%, 100%, en dan 100% absolute” droge ” ethanol). Tussen elke onderdompeling werden de monsters gedehydrateerd in een gespecialiseerde magnetron (PELCO, BioWave 34700 laboratorium Microgolfsysteem)., Het dehydratatieproces werd voltooid met een kritische Puntdroogtoestel E3000 om de ethanol in het monster te vervangen door superkritisch CO2. De verwerkte coverslips werden gemonteerd op SEM mounts (ProSciTech) met carbon tabs. De steekproeven werden met 3 nm platina met een laag bedekt om hen elektronisch geleidend te maken alvorens onder de scanning elektronenmicroscoop (Zeiss 1555 VP-FESEM) bij CMCA, UWA te worden gevisualiseerd. Beelden werden genomen met de in-lens detector op 2,6-mm werkafstand, 30-µm diafragma, en een acceleratiespanning van 5 kV., Beelden werden geanalyseerd met de image analysis software FIJI (ImageJ)83.
immunofluorescentie
Glass coverslips (12 mm diameter, Menzel, Thermo Fisher Scientific) werden in 24-Wells platen geplaatst en gedurende 20 minuten gecoat met poly-l-lysine (Sigma-Aldrich) en vervolgens tweemaal gewassen met gezuiverd water. SUM159 cellen werden geplateerd op de glasplaten en geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur. cellen werden behandeld gedurende 30 minuten met vehicle, of de IC50 van honingbij GIF, melittine, rgd1-melittine, en de equivalente molaire concentratie als melittine voor DEDE-melittine., De cellen werden tweemaal met PBS gewassen, dan met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 25 min, en dan opnieuw drie keer met PBS gewassen. Niet-specifieke antilichaambinding werd geblokkeerd met 5% normaal Geitenserum (Thermo Fisher Scientific) in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Er werden primaire antilichamen aan de cellen toegevoegd, waaronder het monoklonale anti-melittineantilichaam (5 µg/mL) en 1:500 anti-EGFR (Abcam). De monsters werden geïncubeerd met zacht schommelen bij 4 °C ‘ s nachts., De cellen werden drie keer gewassen met PBS, en vervolgens geïncubeerd met 1: 500 van Alexa Fluor 488 geit anti-muis secundair antilichaam, 1:500 van Alexa Fluor 594 geit anti-konijn secundair antilichaam, en Hoechst (1:5000) in PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. de monsters werden drie keer gewassen met PBS en gemonteerd op glas coverslips met SlowFade diamant Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific). De dia ‘ s werden imaged gebruikend de confocal fluorescentie Nikon ti-e omgekeerde microscoop. Beelden werden genomen met behulp van een 20× lucht objectief (NA 0.,75), en sequentiële excitatie met golflengten van 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (Alexa Fluor 488 secundair antilichaam), en 561 nm (Alexa Fluor 594 secundair antilichaam). Beelden werden verzameld met behulp van NIS-C Elements Software en verwerkt met behulp van FIJI (ImageJ) op CMCA83.
bioluminescentie resonantie energie overdracht (BRET)
Receptor–ligand interacties werden beoordeeld met BRET, met behulp van een methode vergelijkbaar met de eerder beschreven 84,85., BRET impliceert de nonradiative overdracht van energie (dipool–dipool) tussen twee proteã nen of molecules van belang geëtiketteerd met of een donor luciferase of een acceptor fluorophore na substraatoxidatie door luciferase en latere emissie van licht54. FITC-tags werden geconjugeerd aan het n eindpunt van melittin (FITC-melittin) en DEDE-melittin (FITC–DEDE-melittin). HEK293 cellen die stabiel het SV40 grote T-antigeen (HEK293FT) uitdrukken, werden gedurende 24 uur op 6-putplaten met een dichtheid van 550.000 cellen/put geplaatst., HEK293FT-cellen werden getransfecteerd met plasmiden die cDNA bevatten voor NanoLuc-EGFR met behulp van FuGENE. Kort, plasmide cDNA werd geïncubeerd gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met een mix van transfectie reagens en serum-vrije DMEM in een verhouding van 10 ng/µL NanoLuc-EGFR: 4 µL FuGENE: 100 µL SFM. Het mengsel werd toegevoegd aan de hek293ft-cellen met een uiteindelijke concentratie van 10 ng/µL NanoLuc-EGFR per putje van de 6-putje plaat, en cellen geïncubeerd gedurende 24 uur. cellen werden gewassen met PBS en losgemaakt met trypsine, vervolgens verzameld in media met 5% foetaal kalfsserum in fenolrood-vrije DMEM., De cellen werden bij 50.000 cellen/goed in poly-L-lysine-gecoate 96-well witte platen geplateerd en gedurende 24 uur geïncubeerd. voor zowel verzadiging als kinetische Bret analyses, werden twee filters gebruikt om gelijktijdig de korte – en lange-golfluminescentie te meten die met de emissiegolflengten van de donor en acceptor moleculen, respectievelijk overeenstemmen.
voor real-time ligand associatie kinetische experimenten werd de media uit de cellen verwijderd, die vervolgens werden geïncubeerd met 50 µL/putje van het nanoluc substraat furimazine tot een uiteindelijke concentratie van 10 µM, verdund in Hank ‘ s Balanced Salt Solution (HBSS)., De cellen werden vervolgens in evenwicht gebracht in de CLARIOstar plaatlezer (BMG Labtech, Australië) gedurende 5 minuten om basale metingen op te nemen. De liganden (TAMRA-EGF, FITC-melittin, en FITC–dede-melittin) werden vervolgens toegevoegd aan een reeks correcte eindconcentraties, en NanoBRET-opnamen genomen elke 90 s gedurende 60 min bij 37 °C. voor de verzadigingsexperimenten werd het medium uit de cellen verwijderd en een reeks concentraties TAMRA-EGF, FITC–melittin en FITC-dede-melittin toegevoegd in aanwezigheid of afwezigheid van een concurrerende concentratie (1 µM) van niet-gelabeld EGF en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 60 min in het donker., Furimazine werd toegevoegd bij een uiteindelijke concentratie van 10 µM. Opnames werden gemaakt met de LUMIstar Omega (BMG Labtech, Australië). De gegevens worden gepresenteerd als de “ruwe Bret-verhouding”, afgeleid van de verhouding van de emissie met lange golflengte (acceptor) over de emissie met korte golflengte (donor). Experimenten werden uitgevoerd in biologische replicaten (n = 3).
analyse van gecombineerde geneesmiddeleneffecten
Honingbijengif of melittine werd gecombineerd met docetaxel en toegediend in de concentraties aangegeven in een niet-constante verhouding in T11 cellen gedurende 24 uur., De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld met behulp van CellTiter-Glo zoals eerder vermeld. Het gecombineerde effect van honingbijengif of melittine met docetaxel werd beoordeeld met behulp van de mediane dosis-effectmethode met behulp van de CompuSyn-Software (ComboSyn). Deze methode bepaalt een BI op basis van het effect van een combinatie tussen twee middelen (waarbij CI < 1 synergistisch is, CI > 1 antagonistisch is en CI = 1 additief)56. Experimenten werden uitgevoerd in biologische replicaten (n = 3).,
diermodel en behandelingen
deze dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van UWA. Om een geavanceerd model van claudin-lage borstkanker te simuleren, werden 2,5 × 105 T11-cellen gesuspendeerd in serumvrije media en BD Matrigel Matrix High Concentration (Bd Bioscience) in een 1:1 verhouding tot een totaal volume van 100 µL en subcutaan geïnjecteerd in de flanken van 5 weken oude balb/cJ-vrouwen (Animal Resources Centre, WA, Australië) met behulp van een 26-G naald., De gebruikte T11-cellen werden lentiviraal getransducteerd met de zsgreen-luciferaseconstructie en drie keer gesorteerd om een verrijking van meer dan 99% luciferase-positieve cellen te bereiken. Melittine werd gesuspendeerd in Milli-Q water + 5% dextrose. Docetaxel (in poeder) werd gesuspendeerd in 25% TWEEN 80 (Sigma-Aldrich) en 75% van een mengsel van 15,25:84,75 (v/v) oplossing van absoluut ethanol en gezuiverd water en bewaard bij -20 °C. vlak voor de behandeling werd docetaxel vers verdund in Milli-Q water + 5% dextrose bij de vereiste eindconcentratie., Drie dagen na de generatie van T11 tumoren (~50 mm3), werden muizen gerandomiseerd in 4 groepen (n = 12 muizen/groep). De behandelingen werden intratumoraal geïnjecteerd op dagen 3, 5, 7, 9, 11, 13, en 15 na inoculatie van T11 cellen, met vehiculum, melittine (5 mg / kg), docetaxel (7 mg/kg), of een combinatie van melittine (5 mg/kg) en docetaxel (7 mg/kg). De dieren werden elke 2 dagen gecontroleerd op tumorgrootte en de volumes werden berekend met behulp van de gemodificeerde ellipsoïde formule (volume = breedte 2 × Lengte/2). Dieren werden op humane wijze geofferd toen de tumoren 800 mm3 bereikten.,
immunohistochemische analyse van de tumoren
tumorweefsels werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde, driemaal gewassen in PBS en achtergelaten in 70% ethanol. Tumoren werden ingebed in paraffine, en 5-µm secties werden voorbereid. Voor hematoxyline / eosine kleuring werden de glaasjes van was ontdaan, gehydrateerd met behulp van een afnemende oplossingsbank ethanol, gekleurd met Gill ‘ s hematoxyline, gedehydrateerd met 70% ethanol, gekleurd met eosine, verder gedehydrateerd met 100% ethanol, gezuiverd met tolueen, en gemonteerd in coverslips met behulp van Acrylmount IHC montagemedia (StatLab)., Tumorcelapoptose werd bepaald in weefselsecties door middel van TUNEL assay (In Situ celdood detectie Kit, Roche).
bioluminescentiebeeldvorming
om veranderingen in in vivo tumorgroei bij de behandelingen nauwkeurig te volgen, hebben we bioluminescentieanalyse uitgevoerd met behulp van het Caliper Ivis Lumina II imaging system bij CMCA, UWA. De analyses werden uitgevoerd om de 2 dagen na de generatie van tumoren. Muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met 200 µL d-luciferine (Cayman-chemische stof) in de uiteindelijke concentratie van 150 mg/kg opgelost in PBS voordat ze werden verdoofd bij 4% isofluraan., Eenmaal verdoofd, werden muizen geplaatst in de voorwarmde kamer van de bioluminescentiebeeldcamera en imaged 7-12 min na injectie, onder 2% isofluraan, totdat de intensiteit van het bioluminescentiesignaal een steady state had bereikt.
statistische analyse
alle gegevens zijn afkomstig van meerdere experimenten die ten minste in drievoud zijn uitgevoerd. Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism v8 (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft), en SPSS Predictive Analytics Software (IBM, Versie 26)., Voor de cel-levensvatbaarheid assays, werden de gegevens genormaliseerd aan de gemiddelde luminescentie van de voertuigconditie, die 100% levensvatbaarheid werd beschouwd, met IC50s afgeleid in GraphPad Prisma. Voor de immunohistochemie in de behandelde T11 tumors om p-HER2 (Tyr1248) en P-EGFR (Tyr1068) te ontdekken, werd het voertuig genormaliseerd aan 100%., Waar van toepassing en zoals aangegeven in de hoofdtekst, werd statistische significantie bepaald met behulp van ongepaarde tweestaart Student ‘S t-tests, ongepaarde one-way ANOVA met Tukey’ s HSD post hoc test corrigeren voor meerdere vergelijkingen, tweerichtings ANOVA met herhaalde metingen gevolgd door Sidak ’s of Tukey’ s multiple-comparison test, of een gegeneraliseerd lineair model (GLM). Voor alle tests werden verschillen significant geacht bij p < 0,05 ( * ), p < 0,01 ( * * ), en p < 0,001 (***).,
Rapporteringssamenvatting
nadere informatie over de opzet van het onderzoek is beschikbaar in de aan dit artikel gekoppelde samenvatting van de Nature Research Reporting.
Leave a Reply