kemiska reagens och antikroppar
bee venom samling
giftet samlades med hjälp av arbetare eller drottningar från flera olika populationer av Apid bin., Venomprover som samlats in från Europeiska honungsbin (Apis mellifera) och buff-tailed bumblebees (Bombus terrestris audax) härstammar från Perth (Australien), Dublin (Irland) och London (England). Honeybee venom samlades in från 30 arbetare av var och en av tre olika kolonier från en apiary eller gård enligt beskrivningen. Honeybee venom från Australien samlades in från en apiary som upprätthölls av Centre for Integrative Bee Research (CIBER), belägen vid University of Western Australia (UWA: -31.980151, 115.817919)., Bins gift från Irland har samlats in från en koloni på en bikupa vid Trinity College i Dublin (53.343933, -6.254635), och de två andra kolonier från gårdar i närheten Glasnevin (53.383245, -6.276333) och Blanchardstown (53.384220, -6.375979). Honungsbin och humlor venom från England samlades in vid Royal Holloway University of London (51.425626, -0.562987). Humla venom samlades in från 20 arbetare från var och en av 2 kommersiellt inköpta kolonier, med singeldrottning humla från var och en av dessa två kolonier som används för insamling av drottning humla venom., Oberoende biologiska masterblandningar framställdes genom att hålla giftet från olika kolonier separat, med giftet av 312 bin samlade totalt.
Körtelgift samlades in genom manuell dissektion. Bin fångades nära bikupans ingång för honungsbin, eller direkt från kolonin för humlor och bedövades med koldioxid och kyldes på is. Stingapparaten dissekerades från varje individ; sedan avlägsnades venomkörteln och placerades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)., Körtlarna genomborrades med en Terumo-nål (25 g × 5/8) och centrifugerades (13 000 g, 10 min, 4 °C) och supernatanten uppsamlades, innehållande gift i flytande suspension. Proteinkoncentrationen av varje master mix kvantifierades med en Diskmedelskompatibel proteinanalys (Bio-Rad), som mäter absorbansen vid 750 nm med en Millennium Science BioTek PowerWave XS2 (Gen 5 1.11 programvara, Version 1.11.5). Varje master mix var sedan alikvoted och lagras vid -80 ° C.,
Cell-linjer och kultur villkor
Alla cell-linjer köptes från American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), med undantag för HEK293FT celler som köptes från Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australien), SUM149 och SUM159 som erhölls från Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA), och T11 och B. 15 celler som har vänligen tillhandahållits av Charles Perou och Lyuba Varticovski från University of North Carolina at Chapel Hill och National Institutes of Health, respektive. T11 och B. 15 är mycket väl karaktäriserade cellinjer37, 38.,
celler inkuberades vid 37 °C och 5% CO2 och kompletterades med 1% antibiotikum–antimykotisk. HDFa (normala primära vuxna humana dermala fibroblastceller) odlades i DMEM med 10% fetalt bovint serum (FBS). MCF 10a och MCF-12A (Human mammary immortalized epithelial cells, nontransformed) upprätthölls i DMEM / F-12 med tillägg (5% fetalt hästserum, 20 ng/mL epidermal tillväxtfaktor, 10 µg/µL insulin, 100 ng / mL koleratoxin och 500 ng / mL hydrokortison). NIH/3T3 (murina embryonala fibroblast) celler kvar i DMEM med 10% FBS., HEK293FT (mänskliga embryonala njure 293 celler stabilt uttrycka SV40 stor T-antigen) var odlade i DMEM med 10% FBS och kosttillskott (1% glutamin och 0,4 mg/mL G418 Geneticin, Gibco). MCF7 (Human luminal A bröstcancer) bibehölls i mem α med 10% FBS och kosttillskott (1% vardera av natriumpyruvat, natriumbikarbonat och icke-essentiella aminosyror). T-47D och ZR-75-1 (både mänskliga luminala En bröstcancer) odlades i RPMI med 10% FBS. MDA-MB-231 (mänskliga claudin-låg bröstcancer) var odlade i DMEM med 10% FBS., SUM149 (Human basal-liknande bröstcancer) odlades i F-12 med 10% FBS. SUM159 (mänskliga claudin-låg bröstcancer) var odlade i F-12 med 5% FBS och kosttillskott (5 µg/mL insulin och 1 µg/mL hydrokortison). MDA-MB-453 (mänskliga HER2-berikad bröstcancer) var odlade i DMEM med 10% FBS. SKBR3 (human HER2-berikad bröstcancer) odlades i RPMI med 10% FBS och 1% natriumpyruvat. p53− T11 (murina claudin-låg bröstcancer) bibehölls i RPMI 1640 medium med 10% FBS. BRCA− B. 15 (murina basal-som bröstcancer) bibehölls i RPMI 1640 medium med 10% FBS.,
cellviabilitetsanalyser
Cellviabiliteten bestämdes genom luminescerande Cellviabilitetsanalys enligt leverantörens protokoll. Celler pläterades i 96-brunnskulturplattor och inkuberades vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h. för dosresponsanalysen kasserades media och ersattes med media som innehåller angivna koncentrationer av bipågift eller peptid och odlades för 24 h., För cellviabiliteten över 60 min behandlades celler med IC50 av honeybee venom eller melittin för varje cellinje under korta tidsintervall över 1 h och viabiliteten bestämdes omedelbart efter behandlingen. För att bestämma viabiliteten inkuberades celler med CellTiter-Glo (CTG) 2.0-reagens i 10 min. Cellviabiliteten kvantifierades genom att mäta luminiscens med hjälp av en EnVision 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer). Experiment utfördes i biologiska replikat (n = 3).,
produktion av en primär monoklonal antikropp mot melittin
antikroppsproduktion utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av Animal Ethics Committee av Harry Perkins Institute of Medical Research. Kvinnliga a / J-möss immuniserades med honeybee venom samlad i Australien. Möss fick intraperitoneala injektioner av 12 µg venom i fullständig Freunds adjuvans (Difco), följt av en ökning i ofullständig Freunds adjuvans Dag 29 och en vattenhaltig ökning i PBS vid 7 µg/mus på dag 49. Möss blödde på dag 60, och sera testades av ELISA., Den bästa respondenten förbättrades med 7 µg honungsbinsgift i PBS 4 dagar före fusion. Mjältceller smältes med SP2 / o-myelomceller enligt standardförfarandet82. Antikroppsinnehållande supernatanter screenades av ELISA. Hybridoma clone 3B9 valdes ut för ytterligare studier. Antikroppen producerades genom att odla hybridoma-cellerna i bioreaktorer i Hybridoma Serum Free Medium (Gibco). Antikroppen renades genom protein g-Sefaros kromatografi. Renad antikropp dialyserades i PBS (pH 7.3). Antikroppen kallades hädanefter antimelittinantikroppen (3B9).,
enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA)
Venom och peptider pläterades ut i tydliga kurvbaserade 96-brunnsplattor vid 5 µg/mL i karbonatbuffert och inkuberades vid 4 °C i 24 h. vätskan avlägsnades och plattorna tvättades tre gånger i en lösning av 0,05% TWEEN-20 (”Tween-20,” Sigma-Aldrich) i PBS. De primära antikropparna tillsattes till brunnarna med 1: 2 utspädningar från 10 µg / mL i spädningsvätska (0, 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS) och inkuberades i 1 timme vid rumstemperatur. De primära antikropparna avlägsnades och plattorna tvättades tre gånger i 0.,05% Tween-20 i PBS. Den polyklonala get anti-mus IgG γ-kedjespecifika sekundära antikroppen sattes till brunnarna (1:1000 i spädningsvätska) och inkuberades under 1 h vid rumstemperatur. De primära antikropparna avlägsnades och plattorna tvättades tre gånger i 0,05% Tween-20 i PBS. ELISA-utvecklingsbuffert, en lösning av renat vatten innehållande 10% citronsyra (pH 4.2), 2% ABTS och 0,1% H2O2, tillsattes till brunnarna och plattorna inkuberades i mörkret vid rumstemperatur i 15 min., Absorbans spelades in vid 405 nm med VICTOR Ljus plattläsare med Wallac 1420 Manager (PerkinElmer). Kontrollen var den monoklonala IgG-antikroppen (28/00 8C1-6) som reagerar med humant IL-12, applicerad på melittinpeptiden på ELISA-plattan. Experiment utfördes i biologiska replikat (n = 3).
Anti-melittin antikroppskonkurrensexperiment
HDFa-och SUM159-celler pläterades i 96-well-odlingsplattor och inkuberades vid 37 °C och 5% CO2 för 24 h., Ökande koncentrationer av antimelittinantikroppen inkuberades med IC50-koncentrationerna av honeybee venom eller melittin för varje cellinje för 1 h vid rumstemperatur och tillsattes sedan till cellerna för 24 h. Cellviabiliteten bestämdes enligt beskrivningen i”Cellviabilitetsanalyser”. Experiment utfördes i biologiska replikat (n = 3).
Western blot
celler pläterades på 6-brunnsplattor vid en densitet av 300,000 celler / brunn och inkuberades vid 37 °C och 5% CO2 för 24 h., Cellodlingsexperiment utfördes som beskrivet, och sedan följdes standard Western blot-protokollet som beskrivet häri. Cellerna tvättades med kall PBS och lyserades med kall proteinlysbuffert (2% natriumdodecylsulfat (SDS), 125 mmol/l Tris-HCl, pH 6.8). Prov sonicerades för 10 s vid 10 mA, och proteinkoncentrationerna kvantifierades med den Diskmedelskompatibla Proteinanalysen (Bio-Rad). Lika stora mängder proteiner blandades med laddningsbuffert (Laemmli Provbuffert, Bio-Rad) kompletterat med reduktionsmedlet ditiothreitol (DTT)., Proteinprover denaturerades genom kokning vid 95 ° C i 5 min, laddad i Mini-PROTEAN prefabricerade geler (Bio-Rad) och utsattes för elektrofores vid 100 V och överfördes sedan till PVDF-membran (Bio-Rad) med Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) i 7 min. Membran inkuberades med TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl och 0.1% Tween-20) med 5% nonfat mjölk för att blockera ospecifik bindning. Membran inkuberades över natten vid 4 ° C med de primära antikropparna utspädda i 3% BSA och 0, 02% natriumazid., Signalen detekteras med Luminata Crescendo Västra HRP Substrat (Millipore) med ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) som körs Bild Lab Programvara (Bio-Rad, Version 6). Western blots härleddes från samma experiment och bearbetades parallellt. Uncropped skanningar av Västra blots finns i kompletterande fikon. 10–15.
flödescytometri
apoptos och nekros utvärderades med hjälp av Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit i (BD Biosciences) enligt tillverkarens protokoll. SUM159 celler pläterades i 6-well kultur plattor för 24 h., Media kasserades sedan och ersattes med media som innehåller honungsbi gift eller melittin (IC50-koncentrationer) och odlades i 60 min. Celler samlades med trypsin och media och centrifugerades (1000g, 5 min, 24 °C), tvättades med kalla PBS, centrifugerades (1000g, 5 min, 24 °C) och resuspenderades i 1× bindningsbuffert. Celler bereddes till en koncentration av 1 miljon celler / mL i 1× bindningsbuffert. Proverna inkuberades med FITC och PI (5 µL vardera) i mörkret i 15 min., Förekomsten av levande, döda, apoptotiska eller nekrotiska celler bedömdes med BD Accuri C6-cytometern (BD Biosciences, San Jose, USA) med BD Accuri C6-programvara och analyserades med FlowJo™ (Ashland, USA, Windows version 7). Experiment utfördes i biologiska replikat (n = 3). Parningsstrategierna presenteras i kompletterande Fig. 16.
levande cellmikroskopi
SKBR3 celler pläterades in i en glas-botten microwell skålen (10 × 35 mm, MatTek) och inkuberades för 24 h., Mikrovågsskålen lämnades för att balansera i en NIKON Eclipse ti-konfokalmikroskopstadium-toppinkubationskammare (37 °C och 5% CO2) i 20 min. 20× – målet användes med Kohler-inriktning, och bilder togs varje minut från 10 min före till 1 h efter behandling med IC50 av honeybee venom samlad i Australien., Författarna erkänner faciliteter och vetenskapligt och tekniskt stöd som erbjuds av de Nationella Imaging Anläggning, en Nationell Samverkande Forskning Infrastruktur Strategi (NCRIS) förmåga, såväl som den Australiska Mikroskopi & Microanalysis Research Facility, båda vid Centrum för Mikroskopi, Karakterisering och Analys (CMCA), UWA, en anläggning som finansieras av Universitet, Stat och Commonwealth Regeringar.,
Scanning elektronmikroskopi
glas täckglas (12 mm diameter, Menzel, Thermo Fisher Scientific) var belagda med poly-L-lysinhydrobromid (Sigma-Aldrich) under 20 min och tvättades sedan två gånger med renat vatten. SUM159-celler pläterades på glasskivorna vid en densitet av 62,500-celler / brunn och inkuberades vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h. celler tvättades två gånger med PBS och behandlades sedan med fordon eller IC50-koncentrationerna av honeybee venom och melittin för 1 h., Cellerna tvättades två gånger med PBS, fixerades sedan med 4% formaldehyd i PBS i 25 min och tvättades sedan igen tre gånger med PBS. Som förberedelse för mikroskopi var proverna nedsänkta i 2,5% glutaraldehyd och inkuberades vid 4 ° C för 2 h. proverna tvättades med avjoniserat vatten och nedsänktes i ökande koncentrationer av etanol (50%, 70%, 95%, 100%, och sedan 100% absolut ”torr” etanol). Mellan varje nedsänkning dehydrerades proverna i en specialiserad mikrovågsugn (PELCO, BioWave 34700 Laboratory Microwave System)., Dehydreringsprocessen slutfördes med en kritisk Punkttorkningsapparat E3000 för att ersätta etanolen i provet med superkritisk CO2. De bearbetade täckskenorna monterades på sem-fästen (ProSciTech) med kolflikar. Proverna var belagda med 3-nm platina för att göra dem elektroniskt ledande innan de visualiseras under skanningselektronmikroskopet (Zeiss 1555 VP-FESEM) vid CMCA, UWA. Bilder togs med in-linsdetektorn vid 2,6-mm arbetsavstånd, 30-µm-bländare och en accelerationsspänning på 5 kV., Bilder analyserades med bildanalysprogrammet FIJI (ImageJ)83.
immunofluorescens
glas täckglas (12 mm diameter, Menzel, Thermo Fisher Scientific) placerades i 24-well plattor och belagda med poly-L-lysin (Sigma-Aldrich) för 20 min och tvättades sedan två gånger med renat vatten. SUM159 celler var klädd på objektglas och inkuberas vid 37 °C och 5% CO2 för 24 h. Celler behandlades för 30 min med bil, eller IC50 av honungsbinas gift, melittin, RGD1-melittin, och motsvarande molar koncentration som melittin för DEDE-melittin., Cellerna tvättades två gånger med PBS, fixerades sedan med 4% paraformaldehyd i PBS i 25 min och tvättades sedan igen tre gånger med PBS. Icke-specifik antikroppsbindning blockerades med användning av 5% normalt getserum (Thermo Fisher Scientific) i PBS för 1 h vid rumstemperatur. Primära antikroppar tillsattes till cellerna, inklusive den monoklonala antimelittinantikroppen (5 µg/mL) och 1:500 av anti-EGFR (Abcam). Proverna inkuberades med mild gungning vid 4 ° C över natten., Cellerna tvättades tre gånger med PBS och inkuberades sedan med 1: 500 av Alexa Fluor 488 goat Anti-mouse sekundär antikropp, 1: 500 av Alexa Fluor 594 goat Anti-rabbit sekundär antikropp och Hoechst (1: 5000) i PBS vid rumstemperatur i 1 h. proverna tvättades tre gånger med PBS och monterades på glasbeläggningar med SlowFade Diamond Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific). Diabilder avbildades med hjälp av konfokal fluorescens Nikon Ti-e inverterat mikroskop. Bilder togs med hjälp av en 20× air mål (NA 0.,75), och sekventiell excitation med våglängder av 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (Alexa Fluor 488 sekundär antikropp), och 561 nm (Alexa Fluor 594 sekundär antikropp). Bilder samlades in med NIS-C Elements-programvara och bearbetades med FIJI (ImageJ) på CMCA83.
bioluminescence resonance energy transfer (BRET)
receptor–ligand interaktioner utvärderades med Bret, med användning av en metod som liknar den som tidigare beskrivits84,85., BRET innefattar den icke-radiativa överföringen av energi (dipol–dipol) mellan två proteiner eller molekyler av intresse märkta med antingen en donator luciferas eller en acceptor fluorophore efter substrattoxidation av luciferas och efterföljande emission av light54. FITC-taggar konjugerades till N-terminalen av melittin (FITC-melittin) och Dede-melittin (FITC–dede-melittin). HEK293 celler stabilt uttrycker SV40 stora t-antigenet (HEK293FT) pläterades på 6-brunnsplattor vid en densitet av 550.000 celler/brunn för 24 h., HEK293FT celler var transfected med plasmider innehållande cDNA för NanoLuc-EGFR med FuGENE. I korthet inkuberades plasmid cDNA i 10 minuter vid rumstemperatur med en blandning av transfektionsreagens och serumfri DMEM vid ett förhållande av 10 ng/µL NanoLuc-EGFR: 4 µL Fugen: 100 µL SFM. Blandningen tillsattes till hek293ft-cellerna vid en slutlig koncentration av 10 ng / µL NanoLuc-EGFR per brunn av 6-brunnsplattan och celler inkuberades för 24 h. celler tvättades med PBS och lossnades med trypsin och samlades sedan i media innehållande 5% fetalt kalvserum i fenolrödfri DMEM., Celler pläterades vid 50 000 celler / brunn i poly-l-lysinbelagda 96-brunnsvita plattor och inkuberades för 24 h. för både mättnads – och kinetiska BRET-analyser användes två filter för att samtidigt mäta den korta och långa våglängdsluminiscens som motsvarar emissionsvåglängderna hos givar-och acceptormolekylerna.
För realtids-ligand föreningen kinetik experiment, media bort från cellerna, som sedan inkuberas med 50 µL/brunn NanoLuc substrat furimazine till en slutlig koncentration av 10 µM utspädd i Hank är Balanserad saltlösning (HBSS)., Cellerna var då jämvikt i CLARIOstar plattan läsare (BMG Labtech, Australien) i 5 min för att spela in basala värden. De ligander (TAMRA-FONDEN, FITC-melittin, och FITC–DEDE-melittin) var sedan till ett utbud av rätt slutliga koncentrationer, och NanoBRET inspelningar tas varje 90 s 60 min vid 37 °C. För mättnad experiment, media bort från cellerna, och en rad koncentrationer av TAMRA-FONDEN, FITC-melittin, och FITC–DEDE-melittin lagts till i närvaron eller frånvaron av en konkurrerande koncentration (1 µM) av omärkta FONDEN och inkuberas vid 37 °C i 60 min i mörkret., Furimazin tillsattes vid en slutlig koncentration av 10 µM. Inspelningar gjordes med hjälp av Lumistar Omega (BMG Labtech, Australien). Data presenteras som ”raw BRET ratio”, härledd från förhållandet mellan långvåglängdsutsläpp (acceptor) över kortvåglängdsutsläpp (givare). Experiment utfördes i biologiska replikat (n = 3).
analys av kombinerade läkemedelseffekter
Honeybee venom eller melittin kombinerades med docetaxel och administrerades vid de koncentrationer som indikerades i ett icke-konstant förhållande i T11-celler för 24 h., Cellviabiliteten bedömdes med hjälp av CellTiter-Glo som tidigare nämnts. Den kombinerade effekten av honeybee venom eller melittin med docetaxel utvärderades med mediandoseffektmetoden med hjälp av CompuSyn Software (ComboSyn). Denna metod bestämmer en CI baserat på effekten av en kombination mellan två medel (där ci < 1 är synergistisk, ci > 1 är antagonistisk och ci = 1 är additiv)56. Experiment utfördes i biologiska replikat (n = 3).,
djurmodell och behandlingar
dessa djurförsök utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av Animal Ethics Committee of UWA. För att simulera en avancerad modell av claudin-låg bröstcancer, 2.5 × 105 T11 celler avbröts i serum-fria medier och BD Matrigel Matris Hög Koncentration (BD Bioscience) i en 1:1-förhållande till en total volym på 100 µL och injiceras subkutant i flankerna av 5-veckan-gamla BALB/cJ kvinnor (Djur Resurser Centrum, WA, Australien) med en 26-G nål., De T11-celler som användes var lentiviralt transducerade med zsgreen-luciferase-konstruktionen och sorterades tre gånger för att uppnå en anrikning över 99% av luciferase-positiva celler. Melittin suspenderades i milli-Q water + 5% dextros. Docetaxel (i pulver) suspenderades i 25% TWEEN 80 (Sigma-Aldrich) och 75% av en blandning av 15,25:84,75 (v/v) lösning av absolut etanol och renat vatten och hölls vid -20 °C. omedelbart före behandlingarna späddes docetaxel nyligen i Milli-Q-vatten + 5% dextros vid den önskade slutliga koncentrationen., Tre dagar efter generering av T11-tumörer (~50 mm3) randomiserades möss till 4 grupper (n = 12 möss/grupp). Behandlingarna injicerades intratumoralt på dagar 3, 5, 7, 9, 11, 13, och 15 efter ympning av T11-celler, med fordon, melittin (5 mg/kg), docetaxel (7 mg/kg) eller en kombination av melittin (5 mg/kg) och docetaxel (7 mg/kg). Djur övervakades för tumörstorlek var 2: e dag och volymer beräknade med den modifierade ellipsoidformeln (volym = width2 × längd/2). Djur offrades mänskligt när tumörerna nådde 800 mm3.,
immunhistokemisk analys av tumörerna
tumörvävnader fixerades i 4% paraformaldehyd, tvättades tre gånger i PBS och lämnades i 70% etanol. Tumörer var inbäddade i paraffin och 5 µm avsnitt var förberedda. För hematoxylin / eosin färgning var diabilder avvaxade, hydratiserade med hjälp av en minskande lösningsbank av etanol, färgad med Gills hematoxylin, dehydrerad med 70% etanol, färgad med eosin, ytterligare dehydrerad med 100% etanol, rensad med toluen och monterad i täckglas med hjälp av Akrymount IHC monteringsmedia (StatLab)., Tumörcell apoptos bestämdes i vävnadssektioner genom TUNELANALYS (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche).
bioluminescensavbildning
för att noggrant spåra förändringar i tumörtillväxt in vivo med behandlingarna utförde vi bioluminescensanalys med Caliper Ivis Lumina II imaging system på CMCA, UWA. Analyserna utfördes vartannat dag efter generering av tumörer. Möss injicerades intraperitonealt med 200 µL D-Luciferin (Cayman Chemical) vid den slutliga koncentrationen av 150 mg/kg upplöst i PBS innan de bedövades vid 4% isofluran., Efter bedövning placerades möss inuti den förvärmda kammaren i bioluminescensbildaren och imiterades 7-12 min efter injektion, under 2% isofluran, tills bioluminescenssignalintensiteten hade nått ett stabilt tillstånd.
statistisk analys
Alla data härleddes från flera experiment som utfördes åtminstone i tre exemplar. Statistiska analyser utfördes med GraphPad Prism v8 (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft), och SPSS Predictive Analytics Software (IBM, Version 26)., För cellviabilitetsanalyserna normaliserades data till fordonets genomsnittliga luminescens, vilket ansågs vara 100% viabilitet, med IC50: erna härledda i GraphPad Prism. För immunhistokemi i de behandlade T11-tumörerna för att detektera p-HER2 (Tyr1248) och p-EGFR (Tyr1068) normaliserades fordonet till 100%., I förekommande fall och som anges i huvudtexten bestämdes statistisk signifikans med hjälp av oparade Tvåtailed Studentens t-test, oparade envägsanova med Tukeys HSD post hoc-testkorrigering för flera jämförelser, tvåvägsanova med upprepade åtgärder följt av Sidak eller Tukeys multipeljämförelsetest eller en generaliserad linjär modell (GLM). För alla tester ansågs skillnaderna vara signifikanta vid p < 0.05 (*), p < 0.01 ( * * ) och p < 0.001 (**).,
rapporteringssammanfattning
ytterligare information om forskningsdesign finns i Naturforskningsrapporteringssammanfattningen kopplad till denna artikel.
Leave a Reply