Kémiai reagenseket, valamint az antitestek
Méh méreg gyűjtemény
A méreg volt gyűjtése munkavállalók vagy queens több különböző populációk Apid méhek., Az Európai mézfélékből (Apis mellifera) és a barnafarkú darázsfélékből (Bombus terrestris audax) gyűjtött mérgminták Perthből (Ausztrália), Dublinból (Írország) és Londonból (Anglia) származnak. A méhmérget a három különböző Telep 30 dolgozójától gyűjtötték össze egy méhészetből vagy gazdaságból a leírtak szerint. Az ausztráliai méhmérget a nyugat-ausztráliai Egyetemen található integratív Méhkutatási Központ (CIBER) által fenntartott méhészetből gyűjtötték (UWA: -31.980151, 115.817919)., Az Írországból származó mézelő méhmérget a dublini Trinity College egyik méhészetében gyűjtötték össze (53.343933, -6.254635), a másik két telepet a Glasnevin melletti gazdaságokból (53.383245, -6.276333) és Blanchardstown (53.384220, -6.375979). A londoni Royal Holloway Egyetemen (51.425626, -0.562987) angol méh-és darázsmérget gyűjtöttek. Darázsmérget gyűjtöttek 20 munkavállalók mindegyikéből 2 kereskedelmi forgalomban vásárolt kolóniák, a két kolónia mindegyikéből származó egykirálynő darázsméreggel, amelyet a Queen darázsméreg gyűjtésére használtak., A független biológiai mesterkeverékeket úgy állították elő, hogy a méreg különböző kolóniákból elkülönülten maradt, összesen 312 méh mérgével.
A Mirigymérget kézi boncolással gyűjtötték össze. A méheket a kaptár bejárata közelében fogták el a méhek számára, vagy közvetlenül a darázs kolóniájából, szén-dioxiddal érzéstelenítve, jégen hűtve. A szúróberendezést minden egyes személytől kivágták, majd a méregmirigyet eltávolították, és foszfátpufferezett sóoldatba (PBS) helyezték., A mirigyeket egy Terumo tűvel (25 g × 5/8) átszúrták és centrifugálták (13 000 g, 10 perc, 4 °C), valamint a felülúszót összegyűjtötték, amely folyékony szuszpenzióban tartalmaz mérget. A fehérje koncentrációja minden mester mix volt számszerűsíteni a Mosószer Kompatibilis Protein Assay (Bio-Rad), mérési ekkor 750 nm, a Millenniumi Tudományos BioTek PowerWave XS2 (Gen 5 1.11 Szoftver, Verzió 1.11.5). Ezután minden mesterkeveréket -80 °C-on tároltak.,
sejtvonalak, kultúra feltételek
Minden sejtvonalak vásároltak az American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), kivéve HEK293FT sejtek, amelyek vásárolt Invitrogen (Thermo Fisher Tudományos, Victoria, Ausztrália), SUM149, valamint SUM159, hogy kapott Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA), pedig T11, valamint B. 15 sejtek, amelyek kedvesen által nyújtott Charles Perou, valamint Ljuba Varticovski, a University of North Carolina a Kápolna-Domb, valamint a Nemzeti Egészségügyi Intézetek, ill. A T11 és a B. 15 nagyon jól jellemzett sejtvonal37,38.,
a sejteket 37 °C–on és 5% CO2-on inkubáltuk, és 1% antibiotikum-antimikotikummal egészítettük ki. A HDFa (normál elsődleges felnőtt humán dermális fibroblaszt) sejteket DMEM-ben tenyésztették 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS). MCF 10A, valamint MCF-12A (emberi emlő halhatatlanná hámsejtek, nontransformed) fennmaradtak DMEM/F-12-kiegészítők (5% – os magzati ló szérum, 20 ng/mL epidermális növekedési faktor, 10 µg/µL inzulin, 100 ng/mL-es kolera toxin, 500 ng/mL hidrokortizon). A NIH/3T3 (Murin embrionális fibroblaszt) sejteket DMEM-ben tartották 10% FBS-vel., HEK293FT (humán embrionális vese 293 sejtek stabilan expresszáló SV40 Nagy t antigén) tenyésztették DMEM 10% FBS és kiegészítők (1% glutamin és 0,4 mg/mL G418 Geneticin, Gibco). Az MCF7-et (humán luminal a mellrák) mem α-ban 10% FBS-vel és kiegészítőkkel (1% nátrium-piruvát, nátrium-hidrogén-karbonát és nem esszenciális aminosavak) tartották fenn. A T – 47D-t és a ZR-75-1-et (mindkét humán luminal a mellrák) RPMI-ben tenyésztették 10% FBS-vel. Az MDA-MB-231-et (humán claudin-alacsony mellrák) DMEM-ben tenyésztették 10% FBS-vel., A SUM149-et (humán bazális-szerű emlőrákot) F-12-ben tenyésztették 10% FBS-vel. A SUM159-et (humán claudin-alacsony mellrák) F-12-ben tenyésztették 5% FBS-vel és kiegészítőkkel (5 µg/mL inzulin és 1 µg/mL hidrokortizon). Az MDA-MB-453-at (humán HER2-dúsított mellrákot) DMEM-ben tenyésztették 10% FBS-vel. Az SKBR3-at (humán HER2-dúsított emlőrákot) RPMI-ben tenyésztették 10% FBS-vel és 1% nátrium-piruváttal. a p53-T11 (murine claudin-alacsony mellrák) rpmi 1640 közegben maradt fenn, 10% FBS-vel. A BRCA-B. 15 (Murin bazális jellegű emlőrák) rpmi 1640 közegben maradt fenn, 10% FBS-vel.,
sejt-életképességi vizsgálatok
a sejtek életképességét a szállítói protokoll szerint a lumineszcens sejt életképességi vizsgálata határozta meg. Sejtek bevonatú 96-hát kultúra tányérok, inkubálják 37 °C-on, 5% CO2-24 h. A dózis–hatás vizsgálatok, média elvetettük helyett a média tartalmazó feltüntetett koncentráció méh méreg vagy peptid, kulturált 24 h., A sejtek 60 perc feletti életképessége érdekében a sejteket 1 órán át rövid idő alatt, a kezelés után azonnal meghatározott életképesség mellett, minden egyes sejtvonalhoz IC50-nel vagy melittinnel kezelték. Az életképesség meghatározásához a sejteket CellTiter-Glo (CTG) 2,0 reagenssel inkubáltuk 10 percig. A sejtek életképességét a lumineszcencia mérésével számszerűsítettük egy 2102-es többrétegű olvasó (PerkinElmer) segítségével. A kísérleteket biológiai replikátumokban végezték (n = 3).,
A melittin elleni elsődleges monoklonális antitest előállítását
az antitest termelést a Harry Perkins Orvostudományi Intézet állat-Etikai Bizottsága által jóváhagyott protokolloknak megfelelően végezték. A nőstény a / J egereket Ausztráliában gyűjtött méhméreggel immunizálták. Az egerek intraperitoneális injekciókat kaptak 12 µg méregből a teljes Freund Adjuvánsban( Difco), majd a 29. napon a hiányos Freund adjuváns fokozódása, a 49. napon pedig a PBS vizes növekedése 7 µg/egér mellett. Az egereket a 60. napon vérezték, a szérumokat pedig az ELISA tesztelte., A legjobb válaszadót 7 µg mézelő méhméreggel növelték PBS-ben 4 nappal a fúzió előtt. A lépsejteket Sp2 / O myeloma sejtekkel kapcsolták össze a szokásos eljárásoknak82 megfelelően. Az antitest tartalmú szupernatánsokat az ELISA szűrte. A Hybridoma clone 3B9-et további vizsgálat céljából választották ki. Az antitestet a hybridoma sejtek bioreaktorokban történő termesztésével állították elő Hybridoma szérum szabad közegben (Gibco). Az antitestet g-Szefaróz kromatográfiával tisztítottuk. A tisztított antitestet PBS-ben (pH 7,3) dializálták. Az antitestet ezentúl anti-melittin antitestnek (3B9) nevezték.,
Enzim-kapcsolt immunoszorbens vizsgálat (ELISA)
Mérgekből, valamint peptidek volt bevonatú ki a tiszta görbe alapú 96-hát lemezek 5 µg/mL a puffer-karbonát, valamint keresztül 4 °C-on 24 óra. A folyékony eltávolították, majd a tányért mosni, háromszor oldat 0,05% TWEEN-20 (“Tween-20,” Sigma-Aldrich) PBS-ben. Az elsődleges antitesteket 1:2 hígítással, 10 µg/mL hígítóanyagból (0,1% szarvasmarha szérum albumin (BSA) PBS-ben) kiindulva, szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk. Az elsődleges antitesteket eltávolították, a lemezeket háromszor 0-ban mosták.,05% Tween-20 a PBS-ben. Az IgG γ-láncspecifikus szekunder antitestet a kutakhoz (1:1000 hígítóban) adták, majd szobahőmérsékleten 1 órán át inkubálták. Az elsődleges antitesteket eltávolították,a lemezeket háromszor 0,05%-os Tween-20 PBS-ben mosták. ELISA-fejlődő puffert, 10% citromsavat (pH 4.2), 2% ABT-t és 0,1% H2O2-t tartalmazó tisztított víz oldatot adtak a kutakhoz, a lemezeket pedig sötétben, szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltuk., Az abszorbanciát 405 nm-en rögzítették a Victor Light plate olvasó segítségével Wallac 1420 Manager szoftverrel (PerkinElmer). A kontroll az egér monoklonális IgG antitest (28/00 8C1-6) volt, amely reagál a humán IL-12-vel, amelyet az ELISA lemezen lévő melittin peptidre alkalmaztak. A kísérleteket biológiai replikátumokban végezték (n = 3).
Anti-melittin antitest verseny kísérletek
HDFa, valamint SUM159 sejtek bevonatú 96-hát kultúra tányérok, inkubálják 37 °C-on, 5% CO2-24 h., Az anti-melittin antitest növekvő koncentrációját az IC50 koncentrációjú méhméreggel vagy melittinnel inkubáltuk minden egyes sejtvonalhoz 1 órán át szobahőmérsékleten, majd 24 órán keresztül hozzáadtuk a sejtekhez. a sejtek életképességét a “sejt életképességi vizsgálataiban”leírtak szerint határoztuk meg. A kísérleteket biológiai replikátumokban végezték (n = 3).
Western blot
a sejteket 300 000 sejt/kút sűrűségű 6-kútlemezre vonták, és 37 °C-on, 24 órán át pedig 5% CO2-on inkubálták., Sejtkultúra kísérleteket végeztünk a leírtak szerint, majd a standard Western blot protokollt követte az itt leírtak szerint. A sejteket hideg PBS-szel mostuk, majd hideg protein-lízis pufferrel (2% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), 125 mmol/l Tris-HCl, pH 6,8) lizáltuk. A mintákat 10 s-on 10 mA-On szonikálták, a fehérje koncentrációját pedig a mosószerrel kompatibilis fehérje teszttel (Bio-Rad) számszerűsítették. Egyenlő mennyiségű fehérjét kevertünk a ditiotreitol redukálószerrel (DTT) kiegészített betöltő pufferrel (Laemmli Mintapuffer, Bio-Rad)., Fehérje minták voltak denaturált forralással a 95 °C-on 5 perc, betöltve a Mini-PROTEAN előregyártott gélek (Bio-Rad), valamint kitéve elektroforézis 100 V, majd át PVDF membrán (Bio-Rad) a Transz-Blot Turbo Átviteli Rendszer (Bio-Rad) 7 min. A membránokat tbst-vel (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl és 0,1% Tween-20) inkubáltuk 5% zsírmentes tejjel a nem specifikus kötés blokkolására. A membránokat 4 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk 3% BSA-ban és 0,02% nátrium-azidban hígított primer antitestekkel., A jelet Luminata Crescendo Western HRP szubsztrát (Millipore) segítségével észlelték a Chemidoc MP képalkotó rendszerrel (Bio-Rad), amely Image Lab szoftvert Futtatott (Bio-Rad, 6.Verzió). A nyugati blotokat ugyanabból a kísérletből származtatták és párhuzamosan dolgozták fel. A nyugati blotok nem metszett vizsgálatát kiegészítő füge biztosítja. 10–15.
áramlási citometria
az apoptózist és a nekrózist az annexin V-FITC apoptózis detektáló készlet I (BD Biosciences) alkalmazásával értékelték a gyártó protokollja szerint. A SUM159 cellákat 24 órán át 6-kút tenyésztő lemezekkel vonták be., A táptalajokat ezután kidobták, és helyükre mézelő méhmérget vagy melittint (IC50 koncentráció) tartalmazó és 60 percig tenyésztett közeg került. A cellákat tripszinnel és közeggel gyűjtöttük össze, és centrifugáltuk (1000g, 5 perc, 24 °C), hideg PBS-vel mostuk, centrifugáltuk (1000g, 5 perc, 24 °C), majd 1× kötő pufferben reszuszpendáltuk. A sejteket 1 millió sejt/mL koncentrációra állítottuk elő 1× kötő pufferben. A mintákat 15 percig sötétben fitc-vel és Pi-vel (mindegyikből 5 µL) inkubáltuk., Az élő, halott, apoptotikus vagy nekrotikus sejtek jelenlétét a BD Accuri C6 Citométerrel (BD Biosciences, San Jose, USA) BD Accuri C6 szoftverrel értékelték, majd a FlowJo™ (Ashland, USA, Windows 7 verzió) segítségével elemezték. A kísérleteket biológiai replikátumokban végezték (n = 3). A gating stratégiák kerülnek bemutatásra kiegészítő ábra. 16.
élő sejtes mikroszkópiát
az SKBR3 sejteket üvegfenekű mikrohullámú edénybe (10 × 35 mm, MatTek) vonták, majd 24 órán át inkubálták., A mikróedényt egy NIKON Eclipse Ti confocal Mikroszkóp Színpad-felső inkubációs kamrában (37 °C és 5% CO2) hagyták egyensúlyba 20 percig. A 20× – es objektívet Kohler-beállítással használták, a képeket percenként 10 perctől 1 óráig készítették az Ausztráliában gyűjtött mézelő méhméreg IC50-es kezelése után., A szerzők elismerik a National Imaging Facility, a National Collaborative Research Infrastructure Strategy (NCRIS) képesség, valamint az Ausztrál mikroszkópia & Microanalysis Research Facility, mind a Center for Microscopy, Characterization and Analysis (CMCA), UWA, a létesítmény által finanszírozott egyetemi, állami és Nemzetközösségi kormányok.,
pásztázó elektronmikroszkópia
az Üvegborítókat (12 mm átmérőjű, Menzel, Thermo Fisher Tudományos) 20 percig poli-lizin-hidrobromiddal (Sigma-Aldrich) vonták be, majd kétszer tisztított vízzel mossuk. SUM159 sejtek bevonatú az üvegre diák egy sűrűsége 62,500 sejt/jól keresztül, 37 °C-on, 5% CO2-24 h. Sejtek mosott kétszer PBS majd kezelni a jármű vagy a IC50 koncentrációja a méh mérge pedig melittin 1 h., A sejteket kétszer PBS-vel mossuk, majd 4% formaldehiddel PBS-ben 25 percig rögzítjük, majd háromszor mossuk újra PBS-vel. A mikroszkópiára való felkészülés során a mintákat 2,5% glutáraldehidbe merítettük, majd 4 °C-on 2 órán át inkubáltuk.(50%, 70%, 95%, 100%, ezután 100% abszolút “száraz” etanol). Az egyes merítések között a mintákat egy speciális mikrohullámú sütőben (PELCO, BioWave 34700 laboratóriumi mikrohullámú rendszer) dehidratálták., A dehidratációs folyamatot egy E3000 kritikus Pontszárító berendezéssel fejeztük be, hogy a mintában lévő etanolt szuperkritikus CO2-vel helyettesítsük. A feldolgozott burkolatokat a SEM tartókra (ProSciTech) szerelték fel szén fülekkel. A mintákat 3 nm-es platinával vonták be, hogy elektronikusan vezetőképessé tegyék őket, mielőtt a szkennelési elektronmikroszkóp alatt (Zeiss 1555 VP-FESEM) láthatóvá válnának a CMCA-nál, UWA. A képeket 2,6 mm-es üzemi távolságon, 30 µm-es nyíláson és 5 kV-os gyorsító feszültségen készítették., A képeket a Fidzsi (ImageJ)83 képelemző szoftverrel elemeztük.
immunfluoreszcencia
az Üvegborítókat (12 mm átmérőjű, Menzel, Thermo Fisher Scientific) 24 lyukú lemezekbe helyezték, és 20 percig poli-l-lizinnel (Sigma-Aldrich) vonták be, majd kétszer tisztított vízzel mossuk. SUM159 sejtek bevonatú az üvegre diák, valamint keresztül, 37 °C-on, 5% CO2-24 h. A sejteket kezeltek 30 perc a jármű, vagy a IC50 a méh mérge, melittin, RGD1-melittin, valamint az azonos moláris koncentrációja, mint a melittin a DEDE-melittin., A sejteket kétszer PBS-vel mossuk, majd 4% paraformaldehidet rögzítünk PBS-ben 25 percig, majd háromszor mossuk újra PBS-vel. A nem specifikus antitestkötést 5% – os normál Kecskeszérum (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával blokkolták PBS-ben 1 órán át szobahőmérsékleten. Elsődleges antitesteket adtak a sejtekhez, beleértve a monoklonális anti-melittin antitestet (5 µg/mL) és 1:500 anti-EGFR-t (Abcam). A mintákat 4 °C-on egy éjszakán át gyengéd ringatással inkubáltuk., A sejtek mosott háromszor PBS, majd inkubáljuk 1:500 Alexa Fluor 488 kecske anti-egér másodlagos ellenanyag, 1:500 Alexa Fluor 594 kecske anti-nyúl másodlagos antitest, valamint a Hoechst (1:5000) PBS-ben szobahőmérsékleten 1 h. A minták sodorta le háromszor a PBS pedig szerelve rá üveg coverslips a SlowFade Gyémánt Antifade Közeg (Thermo Fisher Scientific). A diákat konfokális fluoreszcencia Nikon Ti-E invertált mikroszkóppal imagálták. A képeket egy 20× air objektív (NA 0.,75), valamint a szekvenciális gerjesztés segítségével hullámhosszon 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (Alexa Fluor 488 másodlagos antitest), és 561 nm (Alexa Fluor 594 másodlagos antitest). A képeket NIS-C Elements szoftver segítségével gyűjtötték össze, majd a CMCA83-on Fidzsi (ImageJ) segítségével dolgozták fel.
biolumineszcencia resonance energy transfer (BRET)
Receptor–ligand interakciókat vizsgáltak a BRET-tel, a korábban leírtakhoz hasonló módszerrel.84,85., A BRET magában foglalja az energia (dipól–dipól) nem radiatív átadását két olyan fehérje vagy molekula között, amelyek vagy donor luciferázzal vagy akceptor fluoroforral vannak ellátva, miután a szubsztrát oxidációja a luciferázzal és az azt követő fénykibocsátással54. A FITC-címkéket a melittin (FITC-melittin) és a DEDE-melittin (FITC–DEDE-melittin) n végéhez konjugálták. Az SV40 Nagy t antigént (HEK293FT) stabilan expresszáló hek293 sejteket 6 lyukú lemezekre vonták be, 550 000 sejt/kút sűrűségében 24 órán keresztül., A Hek293ft sejteket cDNA-t tartalmazó plazmidokkal transzfektálták NanoLuc-EGFR-hez Fugén alkalmazásával. Röviden, a plazmid cDNA-t szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk transzfekciós reagens és szérummentes DMEM keverékével 10 ng/µL NanoLuc-EGFR: 4 µL Fugén: 100 µL SFM arányban. A mix volt hozzá, hogy a HEK293FT sejtek végső koncentrációja 10 ng/µL NanoLuc-EGFR per nos, a 6-nos lemez, valamint a sejtek keltetett 24 h. Sejtek mosni PBS, szakad a tripszin, akkor gyűjtött média tartalmazó 5% foetalis borjú szérum a fenolvörös-ingyenes DMEM., Sejtek bevonatú 50 000 sejt/hát a poli-l-lizin-bevont 96-hát fehér tányérok, keltetett 24 h. Mind a telítettség a kinetikus BRET vizsgálatok, két szűrőt használtak, hogy egyidejűleg intézkedés a rövid -, illetve hosszú hullámhosszú lumineszcencia megfelelő emissziós hullámhossz a donor, illetve akceptor molekula, ill.
a valós idejű ligandum-asszociációs kinetikai kísérletekhez a táptalajt eltávolították a sejtekből, amelyeket ezután a nanoluc szubsztrát furimazin 50 µL/kútjával inkubáltunk A Hank kiegyensúlyozott Sóoldatában (HBSS) hígított 10 µM végső koncentrációig., A sejteket ezután 5 percig kiegyenlítették a CLARIOstar lemezolvasóban (BMG Labtech, Ausztrália) az alapértékek rögzítéséhez. A ligandumok (TAMRA-EGAA, FITC-melittin, valamint a FITC–DEDE-melittin) volt, majd hozzátette, hogy egy sor megfelelő végleges koncentráció, valamint NanoBRET felvételeket hozott minden 90 s 60 percig 37 °C-os a telítettség kísérletek, a média távolítottak el a sejtek, valamint különböző koncentrációban TAMRA-EGAA, FITC-melittin, valamint a FITC–DEDE-melittin ki a jelenléte vagy hiánya egy konkurens koncentráció (1 µM) a jelöletlen EGAA, valamint keresztül 37 °C-on 60 perc a sötétben., A furimazint 10 µM végső koncentrációban adták hozzá. A felvételek a LUMIstar Omega (BMG Labtech, Ausztrália) felhasználásával készültek. Az adatokat “nyers BRET arányként” mutatjuk be, amely a hosszú hullámhosszú emisszió (akceptor) rövid hullámhosszú emisszió (donor) arányából származik. A kísérleteket biológiai replikátumokban végezték (n = 3).
kombinált gyógyszerhatások elemzése
a méhméreg vagy a melittin docetaxellel volt kombinálva, és a T11 sejtekben 24 órán át nem állandó arányban jelzett koncentrációban alkalmazták., A sejtek életképességét a CellTiter-Glo alkalmazásával értékelték, amint azt korábban említettük. A méhméreg vagy a melittin docetaxellel történő együttes hatását a CompuSyn szoftver (ComboSyn) alkalmazásával a medián dózishatás módszerrel értékelték. Ez a módszer két szer kombinációja alapján határozza meg a CI-t (ahol a CI < 1 szinergista, CI > 1 antagonista, a CI = 1 pedig additív)56. A kísérleteket biológiai replikátumokban végezték (n = 3).,
állatmodell és kezelések
ezeket az állatkísérleteket az Uwa állat-Etikai Bizottsága által jóváhagyott protokolloknak megfelelően végezték. Szimulálni egy speciális modell a claudin-alacsony mellrák, 2.5 × 105 T11 sejtek felfüggesztették a szérum-ingyenes média BD Matrigel Mátrix Magas Koncentráció (BD Bioscience) egy 1:1 arány a teljes mennyiség 100 µL, valamint szubkután a szárnyakon 5 hetes BALB/cJ nőstények (Állati Források Központ, WA, Ausztrália) segítségével 26-G tű., Az alkalmazott T11 sejteket lentivirálisan transzdukálták a ZsGreen-luciferáz konstrukcióval, és háromszor válogatták, hogy a luciferáz-pozitív sejtek 99% – ánál nagyobb dúsítást érjenek el. A melittint Milli-Q vízben + 5% dextrózban felfüggesztették. A Docetaxel (por) felfüggesztették a 25% – os TWEEN 80 (Sigma-Aldrich), valamint 75% – a keverék 15.25:84.75 (v/v) megoldás az abszolút etanol, tisztított víz tartani, -20 °C-Közvetlenül azelőtt, hogy a kezelések, a docetaxel frissen hígított Milli-Q víz + 5% – os dextróz a szükséges végső koncentrációja., Három nappal a T11 daganatok (~50 mm3) kialakulása után az egereket 4 csoportba randomizálták (n = 12 egér/csoport). A kezeléseket intratumorálisan adták be napokon 3, 5, 7, 9, 11, 13, és 15 T11 sejt beoltása után, vivőanyaggal, melittinnel( 5 mg / kg), docetaxellel (7 mg/kg) vagy melittin (5 mg/kg) és docetaxel (7 mg/kg) kombinációval. Az állatokat 2 naponta monitorozták a tumor mérete, és a módosított ellipszoid képlettel számított térfogatok (térfogat = Szélesség 2 × Hossz/2). Az állatokat emberileg feláldozták, amikor a daganatok elérték a 800 mm-T3.,
a tumorok immunhisztokémiai analízise
a Tumorszöveteket 4% paraformaldehidben rögzítették, háromszor PBS-ben mosták, 70% etanolban hagyták. A daganatokat paraffinba ágyazták, és 5 µm-es metszeteket készítettek. A hematoxilin / eozin festéshez a diákat viaszmentesítették, csökkenő etanolos oldattal hidratálták, Gill hematoxilinnal festették, 70% etanollal dehidratálták, eozinnal festették, további dehidratáltak 100% etanollal, toluollal tisztították, és Akrimount IHC rögzítőközeggel (StatLab) borították., A tumorsejtek apoptózisát a szöveti szakaszokban TUNEL-vizsgálattal (In Situ sejthalál detektáló készlet, Roche) határozták meg.
biolumineszcencia képalkotás
az in vivo tumor növekedésének változásainak pontos nyomon követése érdekében a kezelésekkel biolumineszcencia elemzést végeztünk az IVIS Lumina II képalkotó rendszer segítségével a CMCA-n, UWA-n. Az elemzéseket a tumorok kialakulása után 2 naponta végeztük. Az egereket intraperitoneálisan 200 µL D-Luciferinnel (Kajmán vegyi anyag) injektálták a PBS-ben oldott 150 mg/kg végső koncentrációban, mielőtt 4% izofluránban érzéstelenítették., Az érzéstelenítést követően az egereket a biolumineszcencia imager előmelegített kamrájába helyezték, majd az injekció beadása után 7-12 perccel, 2% – os izoflurán alatt, amíg a biolumineszcencia jelintenzitása el nem érte az egyensúlyi állapotot.
statisztikai elemzés
minden adat Több, legalább három példányban végzett kísérletből származik. Statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism v8 (GraphPad Software Inc.), Az Office Excel 365 (Microsoft) és az SPSS prediktív elemző szoftver (IBM, 26-os verzió)., A sejt-életképességét vizsgálatok, adatok normalizált átlagos lumineszcencia a jármű állapota, ami volt, úgy 100% életképességét, a IC50s nyert GraphPad Prizma. A kezelt T11 tumorok immunhisztokémiájához a P-HER2 (Tyr1248) és a p-EGFR (Tyr1068) kimutatására a járművet 100% – ra normalizálták., Adott esetben és amint azt a fő szöveg is jelzi, a statisztikai szignifikanciát párosítatlan Kétfarkú diák t-tesztjeivel határozták meg, párosítatlan egyirányú ANOVA Tukey HSD post hoc tesztjeivel, többszörös összehasonlítások korrigálása, kétirányú ANOVA ismételt intézkedésekkel, majd Sidak vagy Tukey többszörös összehasonlító tesztje, vagy egy általános lineáris modell (GLM). Minden vizsgálat esetében a különbségeket szignifikánsnak tekintették p < 0, 05 ( * ), p < 0, 01 ( * ), és p < 0, 001 ( * *).,
jelentési összefoglaló
a kutatástervezéssel kapcsolatos további információk az e cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting összefoglalóban találhatók.
Leave a Reply