Chemische Reagenzien und Antikörper
Bienengiftsammlung
Das Gift wurde unter Verwendung von Arbeitern oder Königinnen aus verschiedenen Populationen von Apid-Bienen gesammelt., Giftproben von europäischen Honigbienen (Apis mellifera) und Buff-Tailed Hummeln (Bombus terrestris audax) stammen aus Perth (Australien), Dublin (Irland) und London (England). Honigbienengift wurde von 30 Arbeitern jeder von drei verschiedenen Kolonien aus einem Bienenhaus oder Bauernhof wie beschrieben gesammelt. Honigbienengift aus Australien wurde aus einem Bienenhaus des Centre for Integrative Bee Research (CIBER) an der University of Western Australia (UWA: -31.980151, 115.817919) gesammelt., Honigbienengift aus Irland wurde von einer Kolonie in einem Bienenhaus am Trinity College Dublin (53.343933, -6.254635) und den anderen beiden Kolonien von Farmen in der Nähe von Glasnevin (53.383245, -6.276333) und Blanchardstown (53.384220, -6.375979) gesammelt. Honigbienen – und Hummelgift aus England wurde an der Royal Holloway University of London gesammelt (51.425626, -0.562987). Bumblebee Venom wurde von 20 Arbeitern aus jeder von 2 kommerziell gekauften Kolonien gesammelt, wobei die Single-Queen-Hummeln aus jeder dieser beiden Kolonien für die Sammlung von Queen Bumblebee Venom verwendet wurden., Unabhängige biologische Master-Mischungen wurden hergestellt, indem das Gift aus verschiedenen Kolonien getrennt gehalten wurde, wobei das Gift von insgesamt 312 Bienen gesammelt wurde.
Drüsengift wurde durch manuelle Dissektion gesammelt. Bienen wurden in der Nähe des Eingangs des Bienenstocks für Honigbienen oder direkt aus der Kolonie für Hummeln gefangen und mit Kohlendioxid betäubt und auf Eis gekühlt. Der Stachelapparat wurde von jedem Individuum seziert; dann wurde die Giftdrüse entfernt und in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) gegeben., Die Drüsen wurden mit einer Terumonadel (25 G × 5/8) durchstochen und zentrifugiert (13.000 g, 10 min, 4 °C), und der Überstand wurde gesammelt und enthielt Gift in flüssiger Suspension. Die Proteinkonzentration jeder Mastermischung wurde mit einem detergentionskompatiblen Protein Assay (Bio-Rad) quantifiziert, der die Absorption bei 750 nm mit einem Millennium Science BioTek PowerWave XS2 (Gen 5 1.11 Software, Version 1.11.5) misst. Jede Mastermischung wurde dann aliquoted und bei -80 °C gelagert.,
Zelllinien und Kulturbedingungen
Alle Zelllinien wurden aus der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erworben, mit Ausnahme von HEK293FT-Zellen, die von Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australien), SUM149 und SUM159 erworben wurden Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA) und T11 und B. 15 Zellen, die freundlicherweise von Charles Perou und Lyuba Varticovski von der University of North Carolina in Chapel Hill und den National Institutes of Health zur Verfügung gestellt wurden, beziehungsweise. T11 und B. 15 sind sehr gut charakterisierte Zelllinien37, 38.,
Zellen wurden bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert und mit 1% Antibiotikum–Antimykotikum ergänzt. HDFa (normal primary adult human Dermal Fibroblast) Zellen wurden in DMEM mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) kultiviert. MCF 10A und MCF-12A (humane unsterbliche Epithelzellen der Brustdrüse, nicht transformiert) wurden in DMEM/F-12 mit Nahrungsergänzungsmitteln (5% fetales Pferdeserum, 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor, 10 µg/µL Insulin, 100 ng/ml Choleratoxin und 500 ng/ml Hydrocortison) aufrechterhalten. NIH / 3T3 (murine embryonic fibroblast) Zellen wurden in DMEM mit 10% FBS beibehalten., HEK293FT (humane embryonale Niere 293 Zellen, die das SV40-T-Antigen stabil exprimieren) wurde in DMEM mit 10% FBS und Nahrungsergänzungsmitteln (1% Glutamin und 0,4 mg/ml G418 Geneticin, Gibco) kultiviert. MCF7 (Human luminal A breast cancer) wurde in MEM α mit 10% FBS und Nahrungsergänzungsmitteln (jeweils 1% Natriumpyruvat, Natriumbicarbonat und nicht essentiellen Aminosäuren) aufrechterhalten. T-47D und ZR-75-1 (beide humaner Luminal-A-Brustkrebs) wurden in RPMI mit 10% FBS kultiviert. MDA-MB-231 (humanes Claudin-niedriges Brustkrebs) wurde in DMEM mit 10% FBS kultiviert., SUM149 (menschlichen basal-ähnlichen Brustkrebs) wurde kultiviert in F-12 mit 10% FBS. SUM159 (humanes Claudin – niedriger Brustkrebs) wurde in F-12 mit 5% FBS und Ergänzungsmitteln (5 µg/ml Insulin und 1 µg/ml Hydrocortison) kultiviert. MDA-MB-453 (humanes HER2-angereichertes Brustkrebs) wurde in DMEM mit 10% FBS kultiviert. SKBR3 (humanes HER2-angereichertes Brustkrebs) wurde in RPMI mit 10% FBS und 1% Natriumpyruvat kultiviert. p53− T11 (murine claudin-low Brustkrebs) aufrechterhalten wurde in RPMI 1640 medium mit 10% FBS. BRCA-B. 15 (muriner basalartiger Brustkrebs) wurde im RPMI 1640-Medium mit 10% FBS aufrechterhalten.,
Cell-viability assays
die Lebensfähigkeit der Zellen wurde bestimmt durch die Luminescent Cell Viability Assay, entsprechend der Lieferant zu Protokoll. Die Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten plattiert und bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h inkubiert. Für die Dosis–Wirkungs-Assays wurden Medien verworfen und durch Medien ersetzt, die angegebene Konzentrationen von Bienengift oder Peptid enthielten, und für 24 h kultiviert., Für die Zelllebensfähigkeit über 60 min wurden Zellen mit dem IC50 von Honigbienengift oder Melittin für jede Zelllinie für kurze Zeitintervalle über 1 h behandelt und die Lebensfähigkeit unmittelbar nach der Behandlung bestimmt. Um die Lebensfähigkeit zu bestimmen, wurden die Zellen 10 min lang mit CellTiter-Glo (CTG) 2.0-Reagenz inkubiert. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch Messung der Lumineszenz mit einem EnVision 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer) quantifiziert. Experimente wurden in biologischen Replikaten (n = 3).,
Die Produktion eines primären monoklonalen Antikörpers gegen Melittin
Die Antikörperproduktion wurde gemäß Protokollen durchgeführt, die von der Tierethikkommission des Harry Perkins Institute of Medical Research genehmigt wurden. Weibliche A / J-Mäuse wurden mit in Australien gesammeltem Honigbienengift immunisiert. Mäuse erhielten intraperitoneale Injektionen von 12 µg Gift in Complete Freund ’s Adjuvant (Difco), gefolgt von einem Anstieg in Complete Freund‘ s Adjuvant am Tag 29 und einem wässrigen Anstieg in PBS bei 7 µg/Maus am Tag 49. Mäuse wurden am Tag 60 geblutet und Seren wurden durch ELISA getestet., Der beste Responder wurde 4 Tage vor der Fusion mit 7 µg Honigbienengift in PBS verstärkt. Milzzellen wurden nach Standardverfahren mit Sp2/O-Myelomzellen verschmolzen82. Antikörperhaltige Überstände wurden mittels ELISA gescreent. Hybridoma-Klon-3B9 ausgewählt wurde, für eine weitere Studie. Der Antikörper wurde durch Wachstum der Hybridomazellen in Bioreaktoren in Hybridom Serum Free Medium (Gibco) produziert. Der Antikörper wurde durch Protein-G-Sepharose-Chromatographie gereinigt. Gereinigter Antikörper wurde in PBS (pH 7.3) dialysiert. Der Antikörper wurde fortan als Anti-Melittin-Antikörper (3B9) bezeichnet.,
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Venoms und Peptide wurden plated in klare Kurve-basierte 96-well-Platten bei 5 µg/mL in Carbonat-Puffer inkubiert und bei 4 °C für 24 h möglich. Die Flüssigkeit wurde entfernt und die Platten gewaschen drei mal in eine Lösung von 0,05% TWEEN-20 („Tween-20, Sigma-Aldrich) in PBS. Die primären Antikörper wurden mit 1:2 Verdünnungen ab 10 µg/ml in Verdünnungsmittel (0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS) in die Vertiefungen gegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die primären Antikörper wurden entfernt und die Platten dreimal in 0 gewaschen.,05% Tween-20 in PBS. Der polyklonale Ziegen-Anti-Maus-IgG γ-kettenspezifische sekundäre Antikörper wurde den Vertiefungen zugesetzt (1: 1000 in Verdünnungsmittel) und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die primären Antikörper wurden entfernt und die Platten dreimal in 0,05% Tween-20 in PBS gewaschen. ELISA-Entwicklungspuffer, eine Lösung aus gereinigtem Wasser, die 10% Zitronensäure (pH 4,2), 2% ABTS und 0,1% H2O2 enthielt, wurde den Vertiefungen zugegeben, und Platten wurden im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert., Die Absorption wurde bei 405 nm mit dem VICTOR Lichtplattenleser mit Wallac 1420 Manager Software (PerkinElmer) aufgezeichnet. Die Kontrolle war der monoklonale IgG-Antikörper der Maus (28/00 8C1-6), der mit menschlichem IL-12 reagiert und auf das Melittinpeptid auf der ELISA-Platte aufgebracht wurde. Experimente wurden in biologischen Replikaten (n = 3).
Anti-Melittin-Antikörper-Wettbewerbsexperimente
HDFa-und SUM159-Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten plattiert und 24 h bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert., Zunehmende Konzentrationen des Anti-Melittin-Antikörpers wurden mit den IC50-Konzentrationen von Honigbienengift oder Melittin für jede Zelllinie für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann den Zellen für 24 h zugesetzt. Experimente wurden in biologischen Replikaten (n = 3).
Western blot
Zellen wurden auf 6-Well-Platten mit einer Dichte von 300.000 Zellen / Well plattiert und bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h inkubiert., Zellkulturexperimente wurden wie beschrieben durchgeführt, und dann wurde das Standard-Western-Blot-Protokoll wie hierin beschrieben befolgt. Die Zellen wurden mit kaltem PBS gewaschen und mit kaltem Proteinlysepuffer (2% Natriumdodecylsulfat (SDS), 125 mmol/l Tris-HCl, pH 6,8) lysiert. Die Proben wurden für 10 s bei 10 mA soniniert und die Proteinkonzentrationen mit dem detergentionskompatiblen Protein-Assay (Bio-Rad) quantifiziert. Gleiche Mengen an Proteinen wurden mit Ladungspuffer (Laemmli-Probenpuffer, Bio-Rad) gemischt, ergänzt mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT)., Proteinproben wurden durch Kochen bei 95 °C für 5 min denaturiert, in Mini-PROTEAN-Fertiggele (Bio-Rad) geladen und bei 100 V Elektrophorese unterzogen und dann mit dem Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) für 7 min auf PVDF-Membranen (Bio-Rad) übertragen. Die Membranen wurden inkubiert mit TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) mit 5% fettfreier Milch blockiert unspezifische Bindung. Membranen wurden über Nacht bei 4 °C mit den primären Antikörpern in 3% BSA und 0,02% Natriumazid verdünnt inkubiert., Das signal wurde erkannt und mit Luminata Crescendo Western HRP Substrate (Millipore) mit dem ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) mit Bild-Labor-Software (Bio-Rad, Version 6). Western blots wurden, stammen aus demselben experiment und parallel verarbeitet werden. Unbeschnitten scans des Western-blots sind in der Ergänzenden Abb. 10–15.
Durchflusszytometrie
Apoptose und Nekrose wurden mit dem Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit I (BD Biosciences) nach dem Herstellerprotokoll beurteilt. SUM159 Zellen wurden in 6-Well Kulturplatten für 24 h plattiert., Medien wurden dann verworfen und durch Medien ersetzt, die Honigbienengift oder Melittin (IC50-Konzentrationen) enthielten, und für 60 min kultiviert. Die Zellen wurden mit Trypsin und Medien gesammelt und zentrifugiert (1000 g, 5 min, 24 °C), mit kaltem PBS gewaschen, zentrifugiert (1000 g, 5 min, 24 °C) und in 1× Bindungspuffer resuspendiert. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 1 Million Zellen/ml in 1× Bindungspuffer hergestellt. Die Proben wurden mit FITC und PI (jeweils 5 µL) im Dunkeln für 15 min inkubiert., Das Vorhandensein lebender, toter, apoptotischer oder nekrotischer Zellen wurde mit dem BD Accuri C6 Cytometer (BD Biosciences, San Jose, USA) mit der BD Accuri C6 Software untersucht und mit FlowJo™ (Ashland, USA, Windows Version 7) analysiert. Experimente wurden in biologischen Replikaten (n = 3). Die Gating-Strategien sind in der ergänzenden Abb. 16.
Lebendzellenmikroskopie
SKBR3-Zellen wurden in eine Glasbodenmikrowellschale (10 × 35 mm, MatTek) plattiert und 24 h inkubiert., Die Mikrowellschale wurde in einer konfokalen NIKON Eclipse Ti-Inkubationskammer (37 °C und 5% CO2) für 20 min im Gleichgewicht gelassen. Das 20× – Objektiv wurde mit Kohler-Ausrichtung verwendet, und Bilder wurden jede Minute von 10 min vor bis 1 h nach der Behandlung mit dem IC50 von Honigbienengift aufgenommen, das in Australien gesammelt wurde., Die Autoren erkennen die Einrichtungen und die wissenschaftliche und technische Unterstützung an, die von der National Imaging Facility, einer nationalen Strategie für die Infrastruktur für Sonderforschungsbereiche (NCRIS), sowie der australischen Mikroanalyseeinrichtung für Mikroskopie & angeboten werden, beide am Zentrum für Mikroskopie, Charakterisierung und Analyse (CMCA), UWA, eine Einrichtung, die von der Regierung der Universität, des Staates und des Commonwealth finanziert wird.,
Rasterelektronenmikroskopie
Glasdeckel (12 mm Durchmesser, Menzel, Thermo Fisher Scientific) wurden 20 min lang mit Poly-l-Lysin-Hydrobromid (Sigma-Aldrich) beschichtet und anschließend zweimal mit gereinigtem Wasser gewaschen. SUM159-Zellen wurden mit einer Dichte von 62,500 Zellen/Well auf die Glasscheiben plattiert und bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h inkubiert. Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann mit Vehicle oder den IC50-Konzentrationen von Honigbienengift und Melittin für 1 h behandelt., Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, dann 25 Minuten lang mit 4% Formaldehyd in PBS fixiert und dann dreimal mit PBS erneut gewaschen. Zur Vorbereitung der Mikroskopie wurden die Proben in 2,5% Glutaraldehyd getaucht und bei 4 °C für 2 h inkubiert. Die Proben wurden mit deionisiertem Wasser gewaschen und in steigende Ethanolkonzentrationen eingetaucht (50%, 70%, 95%, 100%, und dann 100% absolutes „trockenes“ Ethanol). Zwischen jedem Eintauchen wurden die Proben in einer speziellen Mikrowelle (PELCO, BioWave 34700 Laboratory Microwave System) dehydriert., Der Dehydratisierungsprozess wurde mit einer kritischen Punkttrocknungsvorrichtung E3000 abgeschlossen, um das Ethanol in der Probe durch überkritisches CO2 zu ersetzen. Die verarbeiteten Deckgläser wurden auf SEM-Halterungen (ProSciTech) mit Carbon-Laschen montiert. Die Proben wurden mit 3-nm-Platin beschichtet, um sie elektronisch leitfähig zu machen, bevor sie unter dem Rasterelektronenmikroskop (Zeiss 1555 VP-FESEM) bei CMCA, UWA, visualisiert wurden. Die Bilder wurden mit dem Inlinsendetektor bei 2,6 mm Arbeitsabstand, 30 µm Blende und einer Beschleunigungsspannung von 5 kV aufgenommen., Die Bilder wurden mit der Bildanalysesoftware FIJI (ImageJ)83 analysiert.
Immunfluoreszenz
Glasdeckel (12 mm Durchmesser, Menzel, Thermo Fisher Scientific) wurden in 24-Well-Platten gelegt und 20 min mit Poly-l-Lysin (Sigma-Aldrich) beschichtet und dann zweimal mit gereinigtem Wasser gewaschen. SUM159-Zellen wurden auf die Glasscheiben plattiert und bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h inkubiert. Zellen wurden 30 min lang mit Vehicle oder dem IC50 von Honigbienengift, Melittin, RGD1-Melittin und der äquivalenten molaren Konzentration als Melittin für DEDE-Melittin behandelt., Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, dann 25 Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert und dann dreimal mit PBS erneut gewaschen. Die unspezifische Antikörperbindung wurde mit 5% normalem Ziegenserum (Thermo Fisher Scientific) in PBS für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Den Zellen wurden primäre Antikörper zugesetzt, einschließlich des monoklonalen Anti-Melittin-Antikörpers (5 µg/ml) und 1:500 Anti-EGFR (Abcam). Die Proben wurden mit sanftem Schaukeln bei 4 °C über Nacht inkubiert., Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und dann mit 1:500 von Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Secondary antibody, 1:500 von Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit Secondary Antibody und Hoechst (1:5000) inkubiert in PBS bei Raumtemperatur für 1 h. Die Proben wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit SlowFade Diamond Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) auf Glasdeckel montiert. Dias wurden mit dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop Nikon Ti-E invertiert abgebildet. Die Bilder wurden mit einem 20× Luft-Objektiv (NA 0.,75) und sequentielle Anregung unter Verwendung von Wellenlängen von 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (Alexa Fluor 488 sekundärer Antikörper) und 561 nm (Alexa Fluor 594 sekundärer Antikörper). Bilder wurden mit NIS-C Elements Software gesammelt und mit FIDSCHI (ImageJ) bei CMCA83 verarbeitet.
Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET)
Rezeptor–Ligand-Wechselwirkungen wurden mit BRET unter Verwendung einer Methode ähnlich der zuvor beschriebenen bewertet84, 85., BRET beinhaltet die nichtradiative Übertragung von Energie (Dipol–Dipol) zwischen zwei Proteinen oder Molekülen von Interesse, die entweder mit einer Donor-Luciferase oder einem Akzeptor-Fluorophor nach Substratoxidation durch die Luciferase und anschließender Emission von Lichtstrahlen markiert sind. FITC-Tags wurden an den N-Endpunkt von Melittin (FITC-Melittin) und DEDE–Melittin (FITC-DEDE-Melittin) konjugiert. HEK293-Zellen, die das SV40 Large T-Antigen (HEK293FT) stabil exprimierten, wurden 24 h lang auf 6-Well-Platten mit einer Dichte von 550.000 Zellen/Well plattiert., HEK293FT-Zellen wurden mit cDNA enthaltenden Plasmiden für NanoLuc-EGFR unter Verwendung von Fugen transfektiert. Kurzzeitig wurde Plasmid-cDNA für 10 min bei Raumtemperatur mit einer Mischung aus Transfektionsreagenz und serumfreiem DMEM in einem Verhältnis von 10 ng/µL NanoLuc-EGFR: 4 µL Fugen: 100 µL SFM inkubiert. Die Mischung wurde den HEK293FT-Zellen in einer Endkonzentration von 10 ng/µL NanoLuc-EGFR pro Well der 6-Well-Platte zugesetzt und die Zellen für 24 h inkubiert. Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit Trypsin abgelöst, dann in Medien gesammelt, die 5% fetales Kalbsserum in phenolrotfreiem DMEM enthielten., Die Zellen wurden bei 50.000 Zellen/Well in poly-l-Lysin-beschichtete 96-Well-weiße Platten plattiert und 24 h inkubiert. Sowohl für Sättigungs – als auch für kinetische BRET-Assays wurden zwei Filter verwendet, um gleichzeitig die kurz-und langwellige Lumineszenz zu messen, die den Emissionswellenlängen der Donor-bzw.
Für Echtzeit-Liganden-Assoziationskinetikexperimente wurden die Medien aus den Zellen entfernt, die dann mit 50 µL/well des NanoLuc-Substrats Furimazin auf eine Endkonzentration von 10 µM inkubiert wurden, verdünnt in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)., Die Zellen wurden dann im CLARIOstar Plate Reader (BMG Labtech, Australien) für 5 min ausgeglichen, um Basalwerte aufzuzeichnen. Die Liganden (TAMRA-EGF, FITC-Melittin und FITC–DEDE-Melittin) wurden dann zu einem Bereich korrekter Endkonzentrationen hinzugefügt, und Nanobretter wurden alle 90 s für 60 min bei 37 °C entnommen.Für die Sättigungsexperimente wurden die Medien aus den Zellen entfernt, und ein Bereich von Konzentrationen von TAMRA-EGF, FITC-Melittin und FITC–DEDE-Melittin wurde in Gegenwart oder Abwesenheit einer konkurrierenden Konzentration (1 µM) von nicht markiertem EGF hinzugefügt und bei 37 °C für 60 Minuten inkubiert. min im Dunkeln., Furimazin wurde in einer Endkonzentration von 10 µM zugegeben. Aufnahmen wurden mit dem LUMIstar Omega (BMG Labtech, Australien) gemacht. Die Daten werden als „Raw BRET Ratio“ dargestellt, abgeleitet aus dem Verhältnis der langwelligen Emission (Akzeptor) über die kurzwellige Emission (Donor). Experimente wurden in biologischen Replikaten (n = 3).
Analyse der kombinierten Arzneimittelwirkungen
Honigbienengift oder Melittin wurde mit Docetaxel kombiniert und in den angegebenen Konzentrationen in einem nicht konstanten Verhältnis in T11-Zellen für 24 h verabreicht., Die Zelllebensfähigkeit wurde, wie bereits erwähnt, mit CellTiter-Glo bewertet. Die kombinierte Wirkung von Honigbienengift oder Melittin mit Docetaxel wurde durch die mediane Dosis-Wirkungs-Methode mit der CompuSyn-Software (ComboSyn) beurteilt. Diese Methode bestimmt ein CI basierend auf der Wirkung einer Kombination zweier Wirkstoffe (wobei CI < 1 synergistisch, CI > 1 antagonistisch und CI = 1 additiv ist)56. Experimente wurden in biologischen Replikaten (n = 3).,
Tiermodell und Behandlungen
Diese Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die von der Tierethikkommission der UWA genehmigt wurden. Um ein fortgeschrittenes Modell von Claudin-niedrigem Brustkrebs zu simulieren, wurden 2,5 × 105 T11-Zellen in serumfreien Medien und BD Matrigel Matrix High Concentration (BD Bioscience) im Verhältnis 1:1 zu einem Gesamtvolumen von 100 µL suspendiert und subkutan mit einer 26-G-Nadel in die Flanken von 5 Wochen alten BALB/cJ-Weibchen (Animal Resources Centre, WA, Australien) injiziert., Die verwendeten T11-Zellen wurden lentiviral mit dem ZsGreen-Luciferase-Konstrukt transduziert und dreimal sortiert, um eine Anreicherung zu erreichen, die 99% der Luciferase-positiven Zellen überlegen ist. Melittin wurde in Milli-Q-Wasser + 5% Dextrose suspendiert. Docetaxel (in Pulverform) wurde in 25% TWEEN 80 (Sigma-Aldrich) und 75% einer Mischung aus 15,25:84,75 (v/v) Lösung aus absolutem Ethanol und gereinigtem Wasser suspendiert und bei -20 °C gehalten Unmittelbar vor den Behandlungen wurde Docetaxel in Milli-Q-Wasser + 5% Dextrose in der erforderlichen Endkonzentration frisch verdünnt., Drei Tage nach der Erzeugung von T11-Tumoren (~50 mm3) wurden Mäuse in 4 Gruppen randomisiert (n = 12 Mäuse/Gruppe). Die Behandlungen wurden intratumoral an Tagen injiziert 3, 5, 7, 9, 11, 13, und 15 nach Inokulation von T11-Zellen mit Vehikel Melittin (5 mg/kg), Docetaxel (7 mg/kg) oder einer Kombination von Melittin (5 mg/kg) und Docetaxel (7 mg/kg). Die Tiere wurden alle 2 Tage auf Tumorgröße überwacht und die Volumina nach der modifizierten Ellipsoidformel berechnet (Volumen = width2 × length/2). Tiere wurden menschlich geopfert, als die Tumoren 800 mm3 erreichten.,
Immunhistochemische Analyse der Tumoren
Tumorgewebe wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert, dreimal in PBS gewaschen und in 70% Ethanol belassen. Tumore wurden in Paraffin eingebettet und 5-µm-Abschnitte vorbereitet. Für die Hämatoxylin / Eosin-Färbung wurden Dias entwaxed, hydratisiert mit einer abnehmenden Lösungsbank von Ethanol, gefärbt mit Gill ‚ s Hämatoxylin, dehydriert mit 70% Ethanol, gefärbt mit Eosin, weiter dehydriert mit 100% Ethanol, gelöscht mit Toluol und montiert in Deckgläsern mit Acrymount IHC Montagemedien (StatLab)., Die Tumorzellapoptose wurde in Gewebeabschnitten durch TUNEL-Assay (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche) bestimmt.
Biolumineszenz-Bildgebung
Um Veränderungen des In-vivo-Tumorwachstums mit den Behandlungen genau zu verfolgen, führten wir eine Biolumineszenzanalyse mit dem Caliper IVIS Lumina II-Bildgebungssystem bei CMCA, UWA, durch. Die Analysen wurden alle 2 Tage nach der Tumorbildung durchgeführt. Mäuse wurden intraperitoneal mit 200 µL D-Luciferin (Cayman Chemical) in der Endkonzentration von 150 mg/kg, gelöst in PBS, injiziert, bevor sie mit 4% igem Isofluran anästhesiert wurden., Nach der Betäubung wurden die Mäuse in die vorgewärmte Kammer des Biolumineszenz-Imager gelegt und 7-12 min nach der Injektion unter 2% Isofluran abgebildet, bis die Biolumineszenzsignalintensität einen stetigen Zustand erreicht hatte.
Statistische Analyse
Alle Daten wurden aus mehreren mindestens dreifach durchgeführten Experimenten abgeleitet. Statistische Analysen wurden durchgeführt mit GraphPad Prism v8 (GraphPad Software Inc.), Office 365 Excel (Microsoft) und SPSS Predictive Analytics Software (IBM, Version 26)., Für die Zell-Viabilitäts-Assays wurden die Daten auf die durchschnittliche Lumineszenz des Fahrzeugzustands normalisiert, die als 100% Lebensfähigkeit angesehen wurde, wobei die IC50s in GraphPad Prism abgeleitet wurden. Für die Immunhistochemie in den behandelten T11-Tumoren zum Nachweis von p-HER2 (Tyr1248) und p-EGFR (Tyr1068) wurde Vehicle auf 100% normalisiert., Gegebenenfalls und wie im Haupttext angegeben, wurde die statistische Signifikanz unter Verwendung von ungepaarten t-Tests mit zwei Schwänzen, ungepaarten Einweg-ANOVA mit Tukey ’s HSD-Post-hoc-Test zur Korrektur mehrerer Vergleiche, Zweiwege-ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Sidaks oder Tukey‘ s Multiple-Comparison-Test oder einem generalisierten linearen Modell (GLM), bestimmt. Für alle tests, die Unterschiede wurden als signifikant bei p < 0.05 (*), p < 0.01 ( * * ) und p < 0.001 (***).,
Berichtszusammenfassung
Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verknüpften Nature Research Reporting Summary.
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