reactivos químicos y anticuerpos
colección de veneno de abeja
El veneno se recolectó utilizando obreras o reinas de varias poblaciones diferentes de abejas Apidas., Las muestras de veneno recolectadas de abejas europeas (Apis mellifera) y abejorros de cola buff (Bombus terrestris audax) se originaron en Perth (Australia), Dublín (Irlanda) y Londres (Inglaterra). El veneno de abeja fue recolectado de 30 trabajadores de cada una de las tres colonias diferentes de un apiario o granja como se describe. El veneno de abeja de Australia fue recolectado de un apiario mantenido por el Centro para la investigación Integrativa de abejas (CIBER), ubicado en la Universidad de Australia Occidental (UWA: -31.980151, 115.817919)., El veneno de abeja de Irlanda fue recolectado de una colonia en un colmenar en Trinity College Dublin (53.343933, -6.254635), y las otras dos colonias de granjas cerca de Glasnevin (53.383245, -6.276333) y Blanchardstown (53.384220, -6.375979). El veneno de abeja y abejorro de Inglaterra fue recolectado en la Royal Holloway University de Londres (51.425626, -0.562987). El veneno de abejorro fue recolectado de 20 trabajadores de cada una de las 2 colonias compradas comercialmente, con los abejorros de una sola reina de cada una de estas dos colonias utilizados para la recolección de veneno de abejorro reina., Se prepararon mezclas maestras biológicas independientes manteniendo el veneno de diferentes colonias separadas, con el veneno de 312 abejas recolectadas en total.
El veneno Glandular fue recolectado por disección manual. Las abejas fueron capturadas cerca de la entrada de la colmena para las abejas, o directamente de la colonia para los abejorros, y anestesiadas con dióxido de carbono y refrigeradas en hielo. El aparato de picadura se diseccionó de cada individuo; luego se extirpó la glándula de veneno y se colocó en solución salina tamponada con fosfato (PBS)., Las glándulas se perforaron con una aguja Terumo (25 g × 5/8) y se centrifugaron (13.000 g, 10 min, 4 °C), y se recogió el sobrenadante, que contenía veneno en suspensión líquida. La concentración de proteínas de cada mezcla maestra se cuantificó con un ensayo de proteína compatible con detergente (Bio-Rad), midiendo la absorbancia a 750 nm con un Millennium Science BioTek PowerWave XS2 (software Gen 5 1.11, versión 1.11.5). Cada mezcla maestra se alícuota y se almacena a -80 ° C.,
líneas celulares y Condiciones de cultivo
todas las líneas celulares fueron compradas de American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), excepto las células HEK293FT que fueron compradas de Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australia), SUM149 y SUM159 que fueron obtenidas de Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA), y las células T11 y B. 15 que fueron amablemente proporcionadas por Charles Perou y Lyuba Varticovski de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill e institutos nacionales de salud, respectivamente. T11 y B. 15 son líneas celulares muy bien caracterizadas37,38.,
Las células fueron incubadas a 37 ° C y 5% de CO2 y suplementadas con un 1% de antibiótico–antimicótico. Se cultivaron células HDFa (fibroblastos dérmicos humanos adultos normales primarios) en DMEM con un 10% de suero bovino fetal (FBS). MCF 10A y MCF-12A (células epiteliales inmortalizadas mamarias humanas, no transformadas) se mantuvieron en DMEM/F-12 con suplementos (5% de suero fetal de caballo, 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico, 10 µg/µL de insulina, 100 ng/mL de toxina del cólera y 500 ng/mL de hidrocortisona). Las células NIH / 3T3 (fibroblastos embrionarios murinos) se mantuvieron en DMEM con un 10% de FBS., HEK293FT (células de riñón embrionario humano 293 que expresan de forma estable el antígeno T Grande SV40) se cultivó en DMEM con 10% de FBS y suplementos (1% de glutamina y 0,4 mg/mL de Geneticina G418, Gibco). MCF7 (cáncer de mama luminal a humano)se mantuvo en MEM α con 10% de FBS y suplementos (1% de piruvato de sodio, bicarbonato de sodio y aminoácidos no esenciales). T-47D y ZR-75-1 (ambos cáncer de mama luminal a humano) se cultivaron en RPMI con 10% de FBS. El MDA-MB-231 (cáncer de mama bajo en Claudina humana) se cultivó en DMEM con 10% de FBS., SUM149 (cáncer de mama humano similar a la basal) se cultivó en F-12 con 10% de FBS. SUM159 (cáncer de mama bajo en Claudina humana) se cultivó en F-12 con FBS al 5% y suplementos (5 µg/mL de insulina y 1 µg/mL de hidrocortisona). El MDA-MB-453 (cáncer de mama enriquecido con HER2 humano) se cultivó en DMEM con 10% de FBS. SKBR3 (cáncer de mama enriquecido con HER2 humano) se cultivó en RPMI con 10% de FBS y 1% de piruvato de sodio. p53-T11 (Claudina murina-cáncer de mama bajo) se mantuvo en el medio RPMI 1640 con 10% de FBS. BRCA-B. 15 (cáncer de mama de tipo basal Murino) se mantuvo en medio RPMI 1640 con 10% de FBS.,
ensayos de viabilidad celular
la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente de acuerdo con el protocolo del proveedor. Las células se platearon en placas de cultivo de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h. para los ensayos de dosis-respuesta, los medios se descartaron y se reemplazaron con medios que contenían las concentraciones indicadas de veneno de abeja o péptido y se cultivaron durante 24 h., Para la viabilidad celular durante 60 min, las células fueron tratadas con la CI50 de veneno de abeja o melittin para cada línea celular por intervalos cortos de tiempo durante 1 h, y la viabilidad se determinó inmediatamente después del tratamiento. Para determinar la viabilidad, las células se incubaron con el reactivo CellTiter-Glo (CTG) 2.0 durante 10 min. La viabilidad celular se cuantificó midiendo la luminiscencia utilizando un lector multilabel EnVision 2102 (PerkinElmer). Se realizaron experimentos en réplicas biológicas (n = 3).,
la producción de un anticuerpo monoclonal primario contra melittin
la producción de anticuerpos se realizó de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética Animal Del Harry Perkins Institute of Medical Research. Ratones hembra A / J fueron inmunizados con veneno de abeja recolectado en Australia. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 12 µg de veneno en el adyuvante de Freund completo (Difco), seguido de un aumento en el adyuvante de Freund incompleto el día 29 y un aumento acuoso en PBS a 7 µg/ratón El Día 49. Los ratones se sangraron el día 60 y los sueros se analizaron mediante ELISA., El mejor respondedor fue potenciado con 7 µg de veneno de abeja en PBS 4 días antes de la fusión. Las células del bazo se fusionaron con células de mieloma Sp2/O de acuerdo con los procedimientos normalizados82. Los sobrenadantes que contenían anticuerpos se evaluaron mediante ELISA. Se seleccionó el clon 3B9 de hibridoma para un estudio posterior. El anticuerpo se produjo mediante el cultivo de células de hibridoma en biorreactores en medio libre de suero de hibridoma (Gibco). El anticuerpo fue purificado por cromatografía de proteína G-Sepharosa. El anticuerpo purificado fue dializado en PBS (pH 7.3). El anticuerpo fue en adelante referido como el anticuerpo anti-melittin (3B9).,
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Venoms and peptides were plated out into clear curve-based 96-well plates at 5 µg / mL in carbonate buffer and incubated at 4 °C for 24 h. the liquid was removed, and the plates washed three times in a solution of 0.05% TWEEN-20 («Tween-20,» Sigma-Aldrich) in PBS. Los anticuerpos primarios se añadieron a los pocillos con diluciones 1:2 a partir de 10 µg/mL en diluyente (albúmina sérica bovina (ASC) al 0,1% en PBS), y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Se retiraron los anticuerpos primarios y se lavaron las placas tres veces en 0.,05% Tween-20 en PBS. El anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-ratón IgG γ-chain-specific se añadió a los pocillos (1:1000 en diluyente) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios fueron removidos, y las placas lavadas tres veces en 0.05% Tween – 20 en PBS. Elisa-developing buffer, una solución de agua purificada que contiene 10% de ácido cítrico (pH 4.2), 2% ABTS y 0.1% de H2O2, se añadió a los pozos, y las placas se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min., La absorbancia se registró a 405 nm utilizando el lector de placas de luz VICTOR con el software Wallac 1420 Manager (PerkinElmer). El control fue el anticuerpo IgG monoclonal de ratón (28/00 8C1-6) que reacciona con il-12 humano, aplicado al péptido de melittin en la placa ELISA. Se realizaron experimentos en réplicas biológicas (n = 3).
los experimentos de competencia de anticuerpos anti-melittin
Las células HDFa y SUM159 se platearon en placas de cultivo de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h., Se incubaron concentraciones crecientes del anticuerpo anti-melittin con las concentraciones IC50 de veneno de abeja o melittin para cada línea celular durante 1 h a temperatura ambiente, y luego se agregaron a las células durante 24 h. la viabilidad celular se determinó como se describe en «ensayos de viabilidad celular». Se realizaron experimentos en réplicas biológicas (n = 3).
Western blot
Las células se platearon en placas de 6 pocillos a una densidad de 300.000 células/pocillo y se incubaron a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h., Los experimentos de cultivo celular se llevaron a cabo como se describe, y luego se siguió el protocolo estándar de Western blot como se describe en este documento. Las células se lavaron con PBS frío y se lisaron con tampón de lisis de proteína fría (dodecil sulfato de sodio (SDS) al 2%, 125 mmol/l Tris-HCl, pH 6,8). Las muestras se sonicaron durante 10 s a 10 mA, y las concentraciones de proteínas se cuantificaron con el ensayo de proteína compatible con detergente (Bio-Rad). Se mezclaron cantidades iguales de proteínas con tampón de carga (tampón de muestra Laemmli, Bio-Rad) suplementado con el agente reductor ditiotreitol (TDT)., Las muestras de proteínas se desnaturalizaron hirviendo a 95 ° C durante 5 min, se cargaron en geles prefabricados mini-proteicos (Bio-Rad) y se sometieron a electroforesis a 100 V, y luego se transfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad) con el sistema de Transferencia Turbo Trans-Blot (Bio-Rad) durante 7 min. Las membranas se incubaron con TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl y 0.1% Tween-20) con 5% de leche descremada para bloquear la Unión inespecífica. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios diluidos en ASC al 3% y azida de sodio al 0,02%., La señal se detectó con Luminata Crescendo Western HRP Substrate (Millipore) con el ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) ejecutando el software Image Lab (Bio-Rad, versión 6). Western blots se derivaron del mismo experimento y se procesaron en paralelo. Los escaneos sin recortar de los western blots se proporcionan en Figs suplementarios. 10–15.
citometría de flujo
la Apoptosis y la necrosis se evaluaron utilizando el kit de detección de Apoptosis anexina V-FITC I (BD Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células SUM159 fueron plateadas en placas de cultivo de 6 pocillos durante 24 h., Los medios se descartaron y se reemplazaron con medios que contenían veneno de abeja o melittin (concentraciones de CI50) y se cultivaron durante 60 min. Las células se recolectaron con tripsina y medios, y se centrifugaron (1000g, 5 min, 24 °C), se lavaron con PBS en frío, se centrifugaron (1000g, 5 min, 24 °C) y se resuspendieron en 1× tampón de unión. Las células se prepararon a una concentración de 1 millón de células/mL en 1× tampón de unión. Las muestras se incubaron con FITC y PI (5 µL de cada uno) en la oscuridad durante 15 min., La presencia de células vivas, muertas, apoptóticas o necróticas se evaluó con el citómetro BD Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, USA) con el software BD Accuri C6, y se analizó con FlowJo™ (Ashland, USA, Windows Versión 7). Se realizaron experimentos en réplicas biológicas (n = 3). Las estrategias de apertura se presentan en la Fig. 16.
microscopía de células vivas
las células SKBR3 se platearon en un plato de microondas con fondo de vidrio (10 × 35 mm, MatTek) y se incubaron durante 24 h., El plato de microondas se dejó equilibrar en una cámara de incubación de microscopio confocal NIKON Eclipse Ti (37 °C y 5% de CO2) durante 20 min. Se utilizó el objetivo 20× con alineación de Kohler, y se tomaron imágenes cada minuto desde 10 min antes hasta 1 h después del tratamiento con el IC50 de veneno de abeja recolectado en Australia., Los autores reconocen las instalaciones y la asistencia científica y técnica ofrecidas por el National Imaging Facility, una estrategia nacional de infraestructura de investigación colaborativa (NCRIS), así como el Australian Microscopy & Microanalysis Research Facility, ambos en el Centre for Microscopy, Characterization and Analysis (CMCA), UWA, un centro financiado por la Universidad, el estado y los gobiernos de la Commonwealth.,
Microscopía Electrónica de barrido
cubreobjetos de vidrio (12 mm de diámetro, Menzel, Thermo Fisher Scientific) se cubrieron con bromhidrato de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) durante 20 min y luego se lavaron dos veces con agua purificada. Las células SUM159 se platearon en los portaobjetos de vidrio a una densidad de 62.500 células / pocillo y se incubaron a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h. las células se lavaron dos veces con PBS y luego se trataron con el vehículo o las concentraciones IC50 de veneno de abeja y melittin durante 1 h., Las células se lavaron dos veces con PBS, luego se fijaron con formaldehído al 4% en PBS durante 25 min, y luego se lavaron nuevamente tres veces con PBS. En preparación para la microscopía, las muestras se sumergieron en glutaraldehído al 2,5% y se incubaron a 4 °C durante 2 h. Las muestras se lavaron con agua desionizada y se sumergieron en concentraciones crecientes de etanol (50%, 70%, 95%, 100%, y luego etanol «seco» absoluto al 100%). Entre cada inmersión, las muestras se deshidrataron en un microondas especializado (sistema de microondas DE LABORATORIO PELCO, BioWave 34700)., El proceso de deshidratación se completó con un aparato de secado de punto crítico E3000 para reemplazar el etanol en la muestra con CO2 supercrítico. Los cubreobjetos procesados se montaron en soportes SEM (ProSciTech) con lengüetas de carbono. Las muestras fueron recubiertas con platino de 3 nm para hacerlas conductoras electrónicamente antes de ser visualizadas bajo el microscopio electrónico de barrido (Zeiss 1555 VP-FESEM) en CMCA, UWA. Las imágenes se tomaron con el detector en la lente a una distancia de trabajo de 2,6 mm, una apertura de 30 µm y un voltaje de aceleración de 5 kV., Las imágenes fueron analizadas con el software de análisis de imágenes FIJI (ImageJ)83.
inmunofluorescencia
cubreobjetos de vidrio (12 mm de diámetro, Menzel, Thermo Fisher Scientific) se colocaron en placas de 24 pocillos y se cubrieron con poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) durante 20 min y luego se lavaron dos veces con agua purificada. Las células SUM159 se platearon en los portaobjetos de vidrio y se incubaron a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h. las células se trataron durante 30 min con vehículo, o la CI50 de veneno de abeja, melittin, RGD1-melittin y la concentración molar equivalente como melittin para DEDE-melittin., Las células se lavaron dos veces con PBS, luego se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 25 min, y luego se lavaron nuevamente tres veces con PBS. La Unión de anticuerpos inespecíficos se bloqueó utilizando suero de cabra Normal al 5% (Thermo Fisher Scientific) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadieron anticuerpos primarios a las células, incluyendo el anticuerpo monoclonal anti-melittin (5 µg/mL) y 1:500 de anti-EGFR (Abcam). Las muestras se incubaron con un suave balanceo a 4 °C durante la noche., Las células se lavaron tres veces con PBS, y luego se incubaron con 1:500 de anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 goat Anti-mouse, 1:500 de anticuerpo secundario Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit, y Hoechst (1:5000) en PBS a temperatura ambiente durante 1 h. Las muestras se lavaron tres veces con PBS y se montaron en cubreobjetos de vidrio con Slowfade Diamond Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific). Las diapositivas se tomaron con el microscopio invertido Nikon Ti-e de fluorescencia confocal. Las imágenes fueron tomadas utilizando un objetivo de aire de 20× (NA 0.,75), y excitación secuencial usando longitudes de onda de 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (anticuerpo secundario Alexa Fluor 488), y 561 nm (anticuerpo secundario Alexa Fluor 594). Las imágenes se recogieron utilizando el programa informático Nis-C Elements y se procesaron utilizando FIJI (ImageJ) en CMCA83.
las interacciones Receptor–ligando fueron evaluadas con BRET, utilizando un método similar al descrito previamente84, 85., BRET implica la transferencia no radiativa de energía (dipolo–dipolo) entre dos proteínas o moléculas de interés etiquetadas con una luciferasa donante o un fluoróforo aceptador después de la oxidación del sustrato por la luciferasa y la posterior emisión de lumino54. Las etiquetas FITC se conjugaron al término N de melittin (FITC-melittin) y DEDE-melittin (FITC–DEDE-melittin). Las células HEK293 que expresaban de forma estable el antígeno T Grande SV40 (HEK293FT) se platearon en placas de 6 pocillos a una densidad de 550.000 células/pocillo durante 24 h., Las células HEK293FT fueron transfectadas con plásmidos que contenían ADNc para NanoLuc-EGFR usando FuGENE. Brevemente, se incubó cDNA plásmido durante 10 min a temperatura ambiente con una mezcla de reactivo de transfección y DMEM libre de suero en una relación de 10 ng/µL NanoLuc-EGFR: 4 µL de Fugeno: 100 µL de SFM. La mezcla se añadió a las células HEK293FT a una concentración final de 10 ng/µL NanoLuc-EGFR por pocillo de la placa de 6 pocillos, y las células se incubaron durante 24 h. las células se lavaron con PBS y se separaron con tripsina, luego se recolectaron en medios que contenían 5% de suero fetal de ternera en DMEM libre de rojo fenol., Las células se platearon a 50.000 células / pocillo en placas blancas de 96 pocillos recubiertas de poli-L-lisina y se incubaron durante 24 h.para los ensayos BRET de saturación y cinética, se utilizaron dos filtros para medir simultáneamente la luminiscencia de longitud de onda corta y larga correspondiente a las longitudes de onda de emisión de las moléculas donante y aceptor, respectivamente.
para los experimentos de cinética de asociación de ligandos en tiempo real, se eliminó el medio de las células, que luego se incubaron con 50 µL/pocillo del sustrato nanoluc furimazina a una concentración final de 10 µM diluido en la solución salina balanceada de Hank (Hbss)., Las células se equilibraron en el lector de placas de CLARIOstar (BMG Labtech, Australia) durante 5 minutos para registrar las lecturas basales. Los ligandos (TAMRA-EGF, FITC-melittin y FITC–DEDE-melittin) se agregaron a un rango de concentraciones finales correctas, y se tomaron registros NanoBRET cada 90 s durante 60 min a 37 °C. Para los experimentos de saturación, se eliminaron los medios de las células, y se agregó un rango de concentraciones de TAMRA-EGF, FITC-melittin y FITC–dede-melittin en presencia o ausencia de una concentración competidora (1 µM) de EGF sin etiquetar e 37 °C durante 60 min en la oscuridad., Se añadió furimazina a una concentración final de 10 µM. Las grabaciones se realizaron utilizando el Lumistar Omega (BMG Labtech, Australia). Los datos se presentan como la «relación BRET cruda», derivada de la relación de la emisión de longitud de onda larga (aceptor) sobre la emisión de longitud de onda corta (donante). Se realizaron experimentos en réplicas biológicas (n = 3).
El análisis de los efectos combinados del fármaco
El veneno de abeja o melittin se combinó con docetaxel y se administró a las concentraciones indicadas en una relación no constante en células T11 durante 24 h., La viabilidad celular se evaluó utilizando CellTiter-Glo como se mencionó anteriormente. El efecto combinado de veneno de abeja o melittin con docetaxel se evaluó mediante el método de la mediana de dosis-efecto utilizando el software CompuSyn (ComboSyn). Este método determina un IC basado en el efecto de una combinación entre dos agentes (donde CI < 1 es sinérgico, CI > 1 es antagonista, y CI = 1 es aditivo)56. Se realizaron experimentos en réplicas biológicas (n = 3).,
modelo Animal y tratamientos
estos experimentos en animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética Animal de la UWA. Para simular un modelo avanzado de cáncer de mama bajo en Claudina, se suspendieron 2,5 × 105 células T11 en medios libres de suero y BD Matrigel Matrix High Concentration (BD Bioscience) en una proporción 1:1 a un volumen total de 100 µL y se inyectaron subcutáneamente en los flancos de Hembras BALB/cJ de 5 semanas de edad (Animal Resources Centre, WA, Australia) utilizando una aguja de 26 G., Las células T11 utilizadas se transducieron lentiviralmente con la construcción zsgreen-luciferasa y se clasificaron tres veces para lograr un enriquecimiento superior al 99% de las células luciferasa-positivas. La Melittin fue suspendida en agua Mili-Q + dextrosa al 5%. El Docetaxel (en polvo) se suspendió en un 25% de TWEEN 80 (Sigma-Aldrich) y en un 75% de una mezcla de 15,25:84,75 (v/v) solución de etanol absoluto y agua purificada y se mantuvo a -20 °C. inmediatamente antes de los tratamientos, el docetaxel se diluyó recientemente en agua Mili-Q + 5% de dextrosa a la concentración final requerida., Tres días después de la generación de tumores T11 (~50 mm3), los ratones fueron aleatorizados en 4 grupos (n = 12 ratones/grupo). Los tratamientos fueron inyectados intratumoral en los días 3, 5, 7, 9, 11, 13, y 15 después de la inoculación de T11 células, con vehículo, melitina (5 mg/kg), docetaxel (7 mg/kg), o una combinación de melitina (5 mg/kg) y docetaxel (7 mg/kg). Se monitorizó el tamaño del tumor en los animales cada 2 días y se calcularon los volúmenes mediante la fórmula elipsoide modificada (volumen = ancho 2 × Longitud/2). Los animales fueron sacrificados humanamente cuando los tumores alcanzaron los 800 mm3.,
el análisis inmunohistoquímico de los tumores
los tejidos tumorales se fijaron en paraformaldehído al 4%, se lavaron tres veces en PBS y se dejaron en etanol al 70%. Los tumores se incrustaron en parafina y se prepararon secciones de 5 µm. Para la tinción de hematoxilina/eosina, los portaobjetos fueron desparafinados, hidratados con un banco de solución decreciente de etanol, teñidos con hematoxilina de Gill, deshidratados con etanol al 70%, teñidos con eosina, deshidratados con etanol al 100%, aclarados con tolueno y montados en cubreobjetos con medios de montaje IHC Acrymount (StatLab)., La apoptosis de células tumorales se determinó en secciones de tejido mediante el ensayo TUNEL (in Situ Cell Death Detection Kit, Roche).
imágenes de bioluminiscencia
para rastrear con precisión los cambios en el crecimiento tumoral in vivo con los tratamientos, realizamos análisis de bioluminiscencia utilizando el sistema de imágenes Caliper Ivis Lumina II en CMCA, UWA. Los análisis se realizaron cada 2 días después de la generación de tumores. Los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 200 µL de D-Luciferina (Cayman Chemical) a la concentración final de 150 mg/kg disueltos en PBS antes de ser anestesiados con isoflurano al 4%., Una vez anestesiados, los ratones se colocaron dentro de la cámara precalentada de la bioluminiscencia imager y se tomaron imágenes 7-12 min después de la inyección, por debajo del 2% de isoflurano, hasta que la intensidad de la señal de bioluminiscencia había alcanzado un estado estacionario.
análisis estadístico
todos los datos se derivaron de múltiples experimentos realizados al menos por triplicado. Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism v8 (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft), y SPSS Predictive Analytics Software (IBM, versión 26)., Para los ensayos de viabilidad celular, los datos se normalizaron a la luminiscencia promedio de la condición del vehículo, que se consideró viabilidad al 100%, con el IC50s derivado en GraphPad Prism. Para la inmunohistoquímica en los tumores T11 tratados para detectar p-HER2 (Tyr1248) y P-EGFR (TYR1068), el vehículo se normalizó a 100%., Cuando fue apropiado y como se indica en el texto principal, la significancia estadística se determinó utilizando las pruebas t de Student no emparejadas de dos colas, ANOVA unidireccional no emparejada con la prueba post hoc de HSD de Tukey que corrigió para comparaciones múltiples, ANOVA bidireccional con medidas repetidas seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak o Tukey, o un modelo lineal generalizado (GLM). Para todas las pruebas, las diferencias se consideraron significativas cuando p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), y p < 0.001 (***).,
resumen de informes
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el resumen de informes de Investigación de Nature vinculado a este artículo.
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