Para produzir uma superfície eletricamente condutora para SEM, espécimes biológicos são, muitas vezes, revestidas utilizando filme fino de evaporação ou de pulverização catódica de carbono ou de metal em um vácuo coater, que exige antes de desidratação da amostra. Este processo de revestimento pode obscurecer detalhes ultra-estruturais finos, dependendo da espessura da camada depositada (geralmente 2-20 nm)., Estes procedimentos convencionais são difíceis de realizar, em típico microbiológicas de amostras, os quais, geralmente, são suspensões de pequenas partículas biológicas em água (<100 nm, para a maioria dos vírus, ou na sub-micron intervalo de tamanho máximo de bactérias, fungos e parasitas). Um problema adicional é que os micróbios de interesse em espécimes de pacientes ou amostras ambientais podem estar presentes em concentrações relativamente baixas, tornando a observação deles em uma superfície difícil.,neste relatório, descrevemos métodos de concentração de suspensões microbianas para observação SEM em substratos filtrantes pré-revestidos. Nós mostramos que, em vez de revestimento de sputter, um líquido iônico (tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazólio) diluído em água pode ser usado para se infiltrar rapidamente em uma amostra de SEM microbiológica, formando uma superfície condutora eletron-lúcida, que impede o carregamento de amostras e dá bons resultados com espécimes microbianos (Fig. 1)., Os líquidos iónicos são sais altamente condutores que permanecem no estado líquido à temperatura ambiente e têm uma pressão de vapor negligenciável (≤5 × 10-9 Torr). Sob as altas condições de vácuo de um moderno SEM (≤1 × 10-6 Torr) líquidos iônicos permanecem em estado líquido e não evaporam durante a operação, enquanto ainda são condutivos 19,20,21,22,23. Os líquidos iónicos mais úteis para aplicações em SEM biológicos têm uma condutividade eléctrica de cerca de 100 mScm−1, são electroquímicos estáveis (com uma janela electroquímica de cerca de 5,8 V), bem como são solúveis em água e são facilmente sintetizados 24., Líquidos iónicos com estas propriedades têm sido previamente demonstrados para dar contraste de imagem SEM comparável ao uso de metal e revestimento de carbono quando utilizados com espécimes isolantes19,25. Eles também foram usados para imagens macroscópicas de espécimes biológicos, como algas marinhas, células cultivadas em tecidos e cromossomos condensados20,21,22. Substratos condutores, tais como óxido de índio-estanho, folha de alumínio ou tampas revestidas de metal, têm sido utilizados para impedir o carregamento20, no entanto, estes materiais são inadequados para filtração para investigações SEM de micróbios., Descobrimos que, para melhores resultados usando líquido iônico com objetos subcelulares como vírus ou flagelas bacterianas, era necessário o revestimento prévio de filtros de policarbonato com alumínio ou ouro. Nós não detectamos qualquer deriva de espécime ao usar espécimes biológicos manchados com líquido iônico, uma vez que eles eram bem apoiados pela membrana condutora utilizada durante o processo de filtração inicial. Os filtros de policarbonato de espi-poro são hidrofílicos e permanecem assim após o revestimento de metal, tornando-os um substrato ideal para trabalhar com amostras biológicas hidratadas., A coloração de líquido iônico também pode ser realizada dentro de um armário de segurança biológica, proporcionando uma alternativa rápida e segura ao revestimento de sputter quando se trabalha com amostras infecciosas, uma vez que o equipamento de revestimento de vácuo pode causar aerossóis e não é facilmente conter 20,21,22. Resolvemos elegantemente o problema da concentração da amostra e da prevenção da carga, através do revestimento metálico do próprio substrato do filtro, antes da aplicação da amostra biológica (Fig. 2). Na ausência de revestimento de película fina das amostras, infiltração com líquidos iónicos também era necessária para evitar o carregamento., Os resultados são comparáveis com a utilização de SEM com revestimento por pulverização catódica e MET utilizando uma técnica de coloração negativa (figos 1 e 2: figos suplementares S1–S5). Ultra-filtração é um passo importante, uma vez que ajuda a remover detritos que podem obscurecer os detalhes de vírus ou bactérias presentes em amostras biológicas. No presente relatório, demonstramos imagens claras de vírus e flagelas bacterianas em amostras SEM revestimento, que anteriormente necessitavam de desidratação e revestimento de sputter para atingir, ampliando assim a resolução e gama de amostras microbianas que podem ser investigadas com SEM.,
a Comparação dos convencionais de revestimento por pulverização catódica SEM métodos de preparação de amostras (painéis sobre o lado esquerdo) com líquido iônico tratamento (centro de painéis) e convencional TEM (painéis no lado direito) para a observação de microrganismos: (a) de Leptospira biflexa, (b) Salmonella Senftenberg, (c), vaccinia e (d) vírus Ebola. As imagens SEM nos painéis do lado esquerdo eram de amostras que eram revestidas com ouro, em filtros simples e não revestidos., As imagens nos painéis centrais eram de amostras tratadas com líquido iónico após deposição em Filtros de alumínio pré-revestidos. Do lado direito, as imagens GDT de espécimes semelhantes preparadas com a coloração negativa de tungstato de metilamina.
Preparação de amostras biológicas para SEM.
(a) os Componentes da unidade filtrante são mostrados antes da montagem., A imagem inset SEM mostra um filtro revestido a ouro em alta ampliação antes de uma amostra ser aplicada. Note que o filtro está limpo e os poros são claramente evidentes. b) a unidade filtrante é apresentada após a montagem e em utilização com uma bomba de seringa num armário de biossegurança (c,d). A seta azul Em (d) aponta para a unidade de filtragem. e) imagens de filtros que tenham evaporado metal neles. A espessura do Al é de 18 nm e 9 nm e a UA de 27 nm e 9 nm de espessura. Para o filtro com ambos os metais, a espessura do Al e da UA é de 18 nm e 27 nm, respectivamente., f) SEM E g) O mapa elementar correspondente gerado pela Microanálise de raios X de uma região semelhante à destacada pelo rectângulo pontilhado na alínea e). (h-k) Imagens SEM de Salmonella manchadas com líquido iónico que ilustram o efeito de diferentes tipos metálicos e a espessura do metal evaporado nas imagens finais registadas (h Al 9 nm, i Au 9 nm, j Al 18 nm, K Au 27 nm). As setas vermelhas indicam flagelas.
as imagens de bactérias manchadas com líquido iónico tinham uma topografia de superfície mais suave do que as que estavam desidratadas e revestidas por pulverizador., As medições das dimensões mostram que as amostras desidratadas diminuíram cerca de 10-20% (Quadro 1). Interpretamos o detalhe da superfície da bactéria desidratada revestida por pulverizador como rugas Da Parede Celular devido à retração, em vez de observação de características adicionais que estão presentes in vivo: estas rugas são, portanto, susceptíveis de ser artefatos devido à secagem. Flagelas bacterianas também eram claramente visíveis com tratamento líquido iônico nos substratos condutores(Fig. 1, Supplementary Fig. S3). Estes resultados foram comparáveis aos observados com o revestimento SEM-sputter e a coloração TEM-negativa.,
Iônico líquido técnicas também podem ser utilizadas com segurança, com agentes infecciosos, em um biologicamente contidos SEM gabinete, permitindo a caracterização de novos agentes infecciosos em uma condição mais próxima da sua hidratado “estado natural” do que convencionais de preparação de amostras techniques8. No caso desta investigação nosso protocolo convencional envolveu desidratação em série de etanol, seguido de secagem ao ar e revestimento de metal antes da imagem SEM., Para o protocolo líquido iónico, a amostra biológica tinha uma gota de uma solução aquosa a 2,5% de tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazólio colocado directamente sobre ela. Após a coagulação para remover o excesso de fluido, a amostra húmida foi então colocada directamente no SEM. Ao tratar amostras infecciosas, é necessário um passo adicional de fixação de aldeído para o procedimento convencional, a fim de evitar o risco de aerossóis infecciosos que possam ser gerados durante o processo de revestimento por pulverização., Esta etapa de fixação não é necessária com a técnica de líquido iônico, uma vez que a amostra pode ser processada em um capô de contenção biológica e, em seguida, ser colocada diretamente em um SEM em um enclosure8 biologicamente contido, para a imagem em um estado não fixo, hidratado, que é muito mais próximo do estado nativo do organismo. A microscopia complementa testes de diagnóstico convencionais que podem falhar novos ou variantes de strains3, 26,27, 28 e podem identificar rapidamente o tipo de organismo presente, orientando a seleção de testes mais específicos 29., No entanto, a microscopia eletrônica geralmente requer uma concentração mínima de partículas para a identificação confiável de micróbios. Para os vírus, este valor situa-se entre 105 e 106 partículas virais/mL4,5. Com técnicas de filtração, tanto o Met como o MEE dos vírus podem ser realizados com apenas 5000 partículas por amostra.a coloração líquida iónica em filtros pré-revestidos é amplamente aplicável a qualquer amostra biológica que possa beneficiar da filtração para partículas de interesse concentradas., A utilização de filtros revestidos de metal com mais do que um tipo de revestimento em diferentes áreas permite a selecção de qualquer um destes revestimentos dá os melhores resultados para observar uma determinada amostra ou características específicas e ajuda a poupar tempo (Fig. 2a, e-k). Por exemplo, após a coloração líquida iónica de flagelas bacterianas aparecerem mais brilhantes contra o substrato revestido com Al, enquanto na área revestida com Au do filtro o contraste é invertido e as flagelas aparecem mais escuras (Fig. 2h-k)., Da mesma forma, as imagens do vírus Ebola e da Leptospira biflexa mostraram detalhes topográficos de boa qualidade quando fotografados com um filtro revestido de alumínio, mas o material biológico tinha menos detalhes e aparecia como uma silhueta plana escura quando fotografada em filtros revestidos de ouro (figos suplementares S4 e S5). Propomos que isso seja devido ao maior sinal secundário de emissão de elétrons de UA em comparação com Al. Nesta investigação recolhemos imagens SEM com o detector secundário de electrões, que é mais comumente usado para imagens de rotina com espécimes biológicos., Em SEM, o coeficiente secundário de emissão de elétrons (δ) é relativamente constante independentemente do número atômico. No entanto, uma exceção é com a UA, para a qual δ É quase o dobro da Al e muitos outros elementos. O valor de δ também é afetado pela energia do feixe: a 20 kV, δ é 0,1 para Al e 0,2 para Au30. Medindo a intensidade em imagens de elétrons secundárias tomadas a 4 kV com Al e Au na mesma imagem (Fig. 2f), calculamos o sinal da UA para ser 2,1 vezes a intensidade da Al, que é perto do esperado teoricamente., Com as imagens gravadas de espécimes nos filtros revestidos a ouro, interpretamos os resultados como produzindo muito contraste do substrato de fundo, que tendia a obscurecer detalhes finos como flagelas que aparecem como uma silhueta em um fundo brilhante. No entanto, o líquido iônico infiltrado micróbios e o filtro revestido de alumínio, têm coeficientes de emissão semelhantes, assim o contraste é em grande parte devido à topografia, em vez das diferenças na composição do material, permitindo mais detalhes finos a ser visto.,o pré-revestimento dos filtros com metal não afectou as dimensões dos poros nem a capacidade de filtração dos filtros (Fig. 2). Todo o protocolo de coloração de líquido iônico pode ser realizado em um banco de laboratório padrão em cerca de 15 minutos e se encaixa dentro de um armário de biossegurança(Fig. 2c, d). In sputter coating for SEM, too thin a layer causes poor conduction and charging, while too thick a layer obscureds fine details., A espessura utilizada para pré-revestimento dos substratos pode ser muito maior do que revestimentos de pulverizadores normalmente utilizados para amostras biológicas, para garantir boa condutividade, desde que os poros filtrantes não sejam bloqueados. (Figo. 2e-k, Suplemento Fig. S2).nesta investigação, utilizámos revestimentos de 18 e 27 nm para Al e Au, respectivamente, uma vez que estas espessuras foram consideradas suficientes para evitar a carga, em comparação com filtros não revestidos (Fig. suplementar. S2). Os substratos com estas espessuras mínimas eram facilmente selecionados, visto que eram visíveis como um revestimento metálico brilhante., Quando estavam presentes revestimentos inferiores a 27 nm para ua Ou 18 nm para o Al, tinham um aspecto opaco ou branco-plano (Fig. 2). Com coloração líquida iônica usando esses filtros revestidos de metal, conseguimos visualizar os detalhes estruturais finos de bactérias, como as flagelas de Salmonella, que têm 20 nm de diâmetro, por SEM (Fig. 2j, k, Supplementary Fig. S3).,
os resultados obtidos com filtração e infiltração líquida iónica simples para o SEM são de qualidade muito comparável aos obtidos com o revestimento convencional de sputter em SEM e com coloração negativa na met para uma variedade de espécimes bacterianos e virais, incluindo Leptospira, Salmonella, vírus da vaccinia e vírus Ebola (Fig. 1, Supplementary Fig. S3-S5)7,16,31,32. Nós descobrimos que havia muito menos retracção do líquido iônico infiltrado bactérias e vírus, em comparação tanto com as preparações revestidas de sputter desidratado SEM e as imagens GDT negativas manchadas (Tabela 1)., Em todos os casos, as dimensões dos micróbios mem desidratados revestidos por pulverização sem escorrimento e corados negativos foram de 9,9% a 18,9% inferiores às amostras tratadas com líquido iónico (Quadro 1). Em uma investigação anterior obtivemos imagens congeladas-vitrificados vírus Ebola por crio-microscopia eletrônica, o diâmetro do vírus Ebola foi medido como 96-98 nm16 que é muito semelhante ao valor de 98,5 ± 10.2 nm para o diâmetro medido da mesma amostra tratada com líquido iônico no presente estudo., Isto demonstra ainda que os volumes das amostras de líquido iónico infiltrado são comparáveis aos medidos em condições de hidratação congeladas e reflectem de perto o estado nativo totalmente hidratado do vírus Ebola. Para uma estrutura baciliforme, uma redução de 10% nas dimensões é equivalente a uma redução de 27% no volume devido à desidratação, embora o colapso e achatamento da forma cilíndrica implicaria um grau ainda maior de perda de água., É claro que este achatamento e colapso devido à desidratação está presente em certa medida em todas as imagens de vírus revestidos de sputter e bactérias(Fig. 1).
embora as imagens pareçam relativamente semelhantes, o revestimento de sputter dourado parece dar um pouco mais de contraste do que o líquido iónico. Outra diferença observável é menos da rugosidade da superfície das paredes celulares bacterianas nas imagens manchadas de líquido iônico. Isto pode ser visto nas imagens de Salmonella (Fig. 1, Supplementary Fig. S3)., Nestas imagens, há uma aparência clara texturizada e enrugada na superfície das células bacterianas revestidas de sputter e uma aparência suave nas paredes celulares dos líquidos iónicos infiltrados preparações. Nós propomos que esta diferença observada é em grande parte o resultado da perda de turgor celular devido à desidratação e perda de volume nos espécimes revestidos de sputter e, assim, as rugas podem realmente ser um artefato ou característica que é acentuada pela desidratação., A evidência de apoio para isso vem do fato de que outras estruturas finas, como flagelas, são claramente visíveis (e de aparência semelhante) em ambos os espécimes tratados com líquido derramado e iônico. Assim, os resultados de estudos anteriores utilizando revestimento de bactérias sputter podem ter de ser cuidadosamente re-interpretados à luz de possíveis efeitos de desidratação.o procedimento iónico de líquido apresentado no presente inquérito é rápido e reprodutível, uma vez que os filtros de amostras podem ser preparados antecipadamente., Como o líquido iônico tem uma pressão de vapor muito baixa, um benefício adicional é que Artefatos de secagem como encolhimento, rugas ou fissuras que podem ocorrer durante a observação SEM são evitados (Tabela 1, Figo suplementar. S3). No futuro, antecipamos o desenvolvimento de uma variedade de diferentes tipos de revestimentos de filtros para melhorar ainda mais as técnicas SEM usando coloração líquida iônica para espécimes biológicos na faixa de tamanho de nanómetro.
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