para producir una superficie conductora de electricidad para SEM, las muestras biológicas a menudo se cubren utilizando evaporación de película delgada o pulverización catódica de carbono o metal en un recubridor de vacío, que requiere deshidratación previa de la muestra. Este proceso de recubrimiento puede ocultar detalles ultraestructurales finos, dependiendo del grosor de la capa depositada (generalmente 2-20 nm)., Estos procedimientos convencionales son difíciles de llevar a cabo en especímenes microbiológicos típicos, que generalmente son suspensiones de Pequeñas partículas biológicas en agua (<100 nm para la mayoría de los virus, o en el rango de tamaño submicrométrico para muchas bacterias, hongos y parásitos). Un problema adicional es que los microbios de interés en muestras de pacientes o muestras ambientales pueden estar presentes en concentraciones relativamente bajas, lo que dificulta la observación de ellos en una superficie.,
en este informe describimos métodos para concentrar suspensiones microbianas para observación SEM en sustratos de filtro pre-recubiertos. Mostramos que, en lugar de un recubrimiento de pulverización catódica, un líquido iónico (tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazolio) diluido en agua se puede utilizar para infiltrar rápidamente una muestra microbiológica de SEM, formando una superficie conductora electrón-lucente, lo que evita la carga de la muestra y da buenos resultados con las muestras microbianas (Fig. 1)., Los líquidos iónicos son sales altamente conductoras que permanecen en estado líquido a temperatura ambiente y tienen una presión de vapor insignificante (≤5 × 10-9 Torr). Bajo las condiciones de alto vacío de un SEM moderno (≤1 × 10-6 Torr) los líquidos iónicos permanecen en estado líquido y no se evaporan durante el funcionamiento, mientras siguen siendo conductivos19,20,21,22,23. Los líquidos iónicos más útiles para aplicaciones en SEM biológico tienen una conductividad eléctrica de alrededor de 100 mScm-1, son electroquímicamente estables (tienen una ventana electroquímica de alrededor de 5,8 V), además de ser solubles en agua y son fácilmente sintetizados24., Se ha demostrado previamente que los líquidos iónicos con estas propiedades proporcionan un contraste de imagen SEM comparable al uso de recubrimientos de metal y carbono cuando se usan con muestras aislantes19,25. También se han utilizado para la obtención de imágenes macroscópicas de muestras biológicas, como algas marinas, células cultivadas de tejidos y cromosomas condensados20,21,22. Se han utilizado sustratos conductores como óxido de indio-estaño, papel de aluminio o cubreobjetos recubiertos de metal para evitar la carga20, sin embargo, estos materiales no son adecuados para la filtración para investigaciones SEM de microbios., Descubrimos que, para obtener resultados óptimos utilizando líquido iónico con objetos subcelulares como virus o flagelos bacterianos, era necesario recubrir previamente los filtros de policarbonato con aluminio u oro. No se detectó ninguna deriva de muestras cuando se utilizaron muestras biológicas teñidas con líquido iónico, ya que estaban bien apoyadas por la membrana conductora utilizada durante el proceso de filtración inicial. Los filtros de policarbonato SPI-pore son hidrofílicos y permanecen así después del recubrimiento metálico, lo que los convierte en un sustrato ideal para trabajar con muestras biológicas hidratadas., La tinción de líquido iónico también se puede realizar dentro de un gabinete de seguridad biológica, proporcionando una alternativa rápida y segura al recubrimiento por pulverización catódica cuando se trabaja con muestras infecciosas, ya que el equipo de recubrimiento al vacío puede causar aerosoles y no es fácilmente contenido20,21,22. Hemos resuelto elegantemente el problema de concentrar la muestra y evitar la carga, mediante un recubrimiento metálico del propio sustrato filtrante antes de aplicar la muestra biológica (Fig. 2). En ausencia de recubrimiento de película delgada de las muestras, también se requirió infiltración con líquidos iónicos para evitar la carga., Los resultados son comparables con el uso de SEM con recubrimiento de pulverización catódica y TEM con técnica de tinción negativa (Figs 1 y 2: Figs suplementarias S1–S5). La ultrafiltración es un paso importante, ya que ayuda a eliminar los desechos que pueden ocultar los detalles de los virus o bacterias presentes en las muestras biológicas. En el presente informe, demostramos imágenes claras de virus y flagelos bacterianos en muestras de SEM no recubiertas, que previamente requerían deshidratación y recubrimiento de pulverización catódica para lograr, ampliando así la resolución y el rango de muestras microbianas que pueden investigarse con SEM.,
comparación de los métodos convencionales de preparación de muestras SEM de recubrimiento de pulverización catódica (paneles en el lado izquierdo) con tratamiento líquido iónico (paneles centrales) derecha) para la observación de microbios: a) Leptospira biflexa, B) Salmonella Senftenberg, C) vaccinia y D) virus del Ébola. Las imágenes SEM en los paneles laterales de la izquierda eran de muestras que estaban recubiertas de oro, en Filtros simples sin recubrimiento., Las imágenes en los paneles centrales fueron de muestras tratadas con líquido iónico después de la deposición en filtros de aluminio pre-recubiertos. En el lado derecho, imágenes TEM de muestras similares preparadas usando tinción negativa de tungstato de metilamina.
Preparación de muestras biológicas para SEM.
(a) los componentes de la unidad de filtro se muestran antes del montaje., La imagen sem insertada muestra un filtro recubierto de oro con un alto aumento antes de aplicar una muestra. Tenga en cuenta que el filtro está limpio y los poros son claramente evidentes. (b) La unidad de filtro se muestra después del montaje y en uso con una bomba de jeringa en un gabinete de bioseguridad (c,d). La flecha azul en (d) apunta a la unidad de filtro. e) imágenes de filtros a los que se haya evaporado metal. El espesor del Al es de 18 nm y 9 nm y el Au es de 27 nm y 9 nm de espesor. Para el filtro con ambos metales, el espesor del Al y el Au es de 18 nm y 27 nm, respectivamente., (f) SEM y (g) el mapa elemental correspondiente generado por microanálisis de rayos X de una región similar a la resaltada por el rectángulo punteado en (e). (h–k) imágenes SEM de Salmonella teñidas con líquido iónico que ilustran el efecto de los diferentes tipos de metal y el grosor del metal evaporado en las imágenes finales grabadas (h al 9 nm, I Au 9 nm, j al 18 nm, K Au 27 nm). Las flechas rojas indican flagelos.
Las imágenes de bacterias teñidas con líquido iónico tenían una topografía superficial más suave que las que estaban deshidratadas y recubiertas de pulverización catódica., Las mediciones de tamaño muestran que las muestras deshidratadas se contrajeron en aproximadamente un 10-20 por ciento (Tabla 1). Interpretamos el detalle de la superficie de las bacterias deshidratadas, recubiertas de pulverización catódica como arrugas de la pared celular debido a la contracción, en lugar de la observación de características adicionales que están presentes in vivo: estas arrugas son por lo tanto propensos a ser artefactos debido a la sequedad. Las flagelas bacterianas también fueron claramente visibles con el tratamiento líquido iónico en los sustratos conductores (Fig. 1, Suplemento Fig. S3). Estos resultados fueron comparables a los observados con el recubrimiento SEM-sputter y la tinción TEM-negativa.,
las técnicas de líquido iónico también se pueden utilizar de forma segura con patógenos infecciosos, en un recinto SEM biológicamente contenido, lo que permite la caracterización de nuevos agentes infecciosos en una condición más cercana a su» estado nativo » hidratado que mediante técnicas convencionales de preparación de muestras8. En el caso de esta investigación, nuestro protocolo convencional involucró deshidratación en series de etanol, seguido de secado al aire y recubrimiento metálico antes de la obtención de imágenes SEM., Para el protocolo de líquido iónico, la muestra biológica tenía una gota de una solución acuosa al 2,5% de tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazolio colocada directamente sobre ella. Después del secado para eliminar el exceso de líquido, la muestra húmeda se colocó directamente en el SEM. Cuando se trata de muestras infecciosas, se necesita un paso adicional de fijación de aldehído para el procedimiento convencional para evitar el riesgo de aerosoles infecciosos que podrían generarse durante el proceso de recubrimiento por pulverización catódica., Este paso de fijación no es necesario con la técnica de líquido iónico, ya que la muestra puede procesarse en una campana de contención biológica y luego colocarse directamente en un SEM en un recinto SEM biológicamente contenido8, para obtener imágenes en un estado no fijado e hidratado, que es mucho más cercano al estado nativo del organismo. La microscopía complementa las pruebas diagnósticas convencionales que pueden pasar por alto cepas nuevas o variantes3, 26, 27, 28 y pueden identificar rápidamente el tipo de organismo presente, guiando la selección de pruebas más específicas29., Sin embargo, la microscopía electrónica generalmente requiere una concentración mínima de partículas para la identificación confiable de microbios. Para los virus, esto es entre 105 A 106 partículas de virus / mL4,5. Con las técnicas de filtración, tanto TEM como SEM de virus pueden llevarse a cabo con tan solo 5000 partículas por muestrea7.
la tinción de líquido iónico en filtros pre-recubiertos es ampliamente aplicable a cualquier muestra biológica que pueda beneficiarse de la filtración para concentrar partículas de interés., El uso de filtros recubiertos de metal con más de un tipo de recubrimiento en diferentes áreas permite la selección de cualquiera de estos recubrimientos da los resultados óptimos para observar una muestra en particular o características específicas y ayuda a ahorrar tiempo (Fig. 2a–e-k). Por ejemplo, después de la tinción de líquido iónico, las flagelas bacterianas parecían más brillantes contra el sustrato recubierto de Al, mientras que en el área recubierta de Au del filtro el contraste se invierte y las flagelas parecían más oscuras (Fig. 2h-k)., Del mismo modo, las imágenes del virus del Ébola y Leptospira biflexa mostraron un detalle topográfico de buena calidad cuando se tomaron con un filtro recubierto de aluminio, pero el material biológico tuvo menos detalle y apareció como una silueta plana oscura cuando se tomaron con filtros recubiertos de oro (Figs suplementarios S4 y S5). Proponemos que esto se debe a la señal de emisión secundaria de electrones más alta de Au en comparación con Al. En esta investigación recolectamos imágenes SEM con el detector de electrones secundario, que se usa más comúnmente para imágenes de rutina con muestras biológicas., En SEM, el coeficiente de emisión de electrones secundario (δ) es relativamente constante independientemente del número atómico. Sin embargo, una excepción es con Au, para el cual δ es casi el doble de Al y muchos otros elementos. El valor de δ también se ve afectado por la energía del haz: a 20 kV, δ es 0.1 para Al y 0.2 para Au30. Midiendo la intensidad en imágenes de electrones secundarios tomadas a 4 kV con Al y Au en la misma imagen (Fig. 2f), calculamos que la señal de la UA es 2.1 veces la intensidad de la Al, que es cercana a la esperada teóricamente., Con las imágenes grabadas de especímenes en los filtros recubiertos de oro, interpretamos los resultados como que producen demasiado contraste del sustrato de fondo, que tendía a oscurecer detalles finos como flagelas que aparecen como «siluetas» sobre un fondo brillante. Sin embargo, los microbios infiltrados en líquido iónico y el filtro recubierto de aluminio tienen coeficientes de emisión similares, por lo que el contraste se debe en gran medida a la topografía en lugar de las diferencias en la composición del material, lo que permite ver detalles más finos.,
El recubrimiento previo de los filtros con metal no afectó el tamaño de los poros ni la capacidad de filtración de los filtros (Fig. 2). Todo el protocolo de tinción de líquido iónico se puede llevar a cabo en un banco de laboratorio estándar en aproximadamente 15 minutos y cabe dentro de un gabinete de bioseguridad (Fig. 2c, d). En el recubrimiento de pulverización catódica para SEM, una capa demasiado delgada causa mala conducción y carga, mientras que una capa demasiado gruesa oscurece los detalles finos., El espesor utilizado para el recubrimiento previo de los sustratos puede ser mucho mayor que los recubrimientos de pulverización catódica utilizados normalmente para muestras biológicas, para garantizar una buena conductividad, siempre y cuando los poros del filtro no estén bloqueados. (Higo. 2e-k, suplemento Fig. S2).
en esta investigación se utilizaron recubrimientos de 18 y 27 nm para Al y Au respectivamente, ya que se encontró que estos espesores eran suficientes para evitar la carga, en comparación con los filtros sin recubrimiento (Fig.suplementaria. S2). Los sustratos con estos espesores mínimos se seleccionaron fácilmente ya que eran visibles como un recubrimiento metálico brillante., Cuando los recubrimientos de menos de 27 nm Para Au o 18 nm para el Al estaban presentes, tenían un aspecto opaco o blanco plano (Fig. 2). Con la tinción líquida iónica utilizando estos filtros recubiertos de metal, pudimos visualizar los detalles estructurales finos de bacterias, como las flagelas de Salmonella, que son de 20 nm de diámetro, por SEM (Fig. 2j, k, suplemento Fig. S3).,
los resultados obtenidos con filtración e infiltración de líquido iónico simple para SEM son muy comparables en calidad con los del recubrimiento de pulverización catódica convencional en SEM y tinción negativa en TEM para una variedad de muestras bacterianas y virales, incluyendo Leptospira, Salmonella, virus vaccinia y virus Ebola (Fig. 1, Suplemento Fig. S3-S5) 7,16,31,32. Encontramos que había mucho menos contracción de las bacterias y virus infiltrados en el líquido iónico en comparación con las preparaciones sem recubiertas de pulverización catódica deshidratadas y las imágenes teñidas negativas de TEM (Tabla 1)., En todos los casos, las dimensiones de los microbios sem deshidratados recubiertos por pulverización catódica y los microbios TEM teñidos negativos fueron de 9,9% a 18,9% menores que las muestras tratadas con líquido iónico (Tabla 1). En una investigación previa se tomó una imagen del virus del Ébola vitrificado congelado por microscopía crioelectrónica, el diámetro del virus del Ébola se midió como 96-98 nm16, lo que es muy similar al valor de 98,5 ± 10,2 nm para el diámetro medido de las mismas muestras tratadas con líquido iónico en el presente estudio., Esto demuestra además que los volúmenes de las muestras infiltradas de líquido iónico son comparables a los medidos en condiciones de hidratación congelada y reflejan de cerca el estado nativo totalmente hidratado del virus del Ébola. Para una estructura baciliforme, una reducción del 10% en las dimensiones equivale a una reducción del 27% en el volumen debido a la deshidratación, aunque el colapso y el aplanamiento de la forma cilíndrica implicaría un grado aún mayor de pérdida de agua., Se desprende claramente que este aplanamiento y colapso debido a la deshidratación está presente en cierta medida en todas las imágenes de virus y bacterias recubiertos de pulverización catódica (Fig. 1).
aunque las imágenes parecen relativamente similares, el recubrimiento de pulverización catódica de oro parece dar un poco más de contraste que el líquido iónico. Otra diferencia observable es la menor rugosidad de la superficie de las paredes celulares bacterianas en las imágenes teñidas con líquido iónico. Esto se puede ver en las imágenes de Salmonella (Fig. 1, Suplemento Fig. S3)., En estas imágenes hay una apariencia texturizada y arrugada clara en la superficie de las células bacterianas recubiertas de pulverización catódica y una apariencia suave en las paredes celulares de los preparados infiltrados de líquido iónico. Proponemos que esta diferencia observada es en gran medida el resultado de la pérdida de turgencia celular debido a la deshidratación y la pérdida de volumen en las muestras recubiertas de pulverización catódica y, por lo tanto, las arrugas pueden ser en realidad un artefacto o característica que se acentúa por la deshidratación., La evidencia que respalda esto proviene del hecho de que otras estructuras finas, como las flagelas, son claramente visibles (y de apariencia similar) tanto en las muestras recubiertas de pulverización catódica como en las tratadas con líquido iónico. Por lo tanto, los resultados de estudios anteriores que utilizan la capa de pulverización catódica de bacterias pueden tener que ser reinterpretados con cautela a la luz de los posibles efectos de deshidratación.
el procedimiento de líquido iónico presentado en esta investigación es rápido y reproducible ya que los filtros de muestras se pueden preparar con anticipación., Como el líquido iónico tiene una presión de vapor muy baja, un beneficio adicional es que se evitan los artefactos de secado como contracción, arrugas o grietas que pueden ocurrir durante la observación de SEM (Tabla 1, Fig. S3). En el futuro, anticipamos el desarrollo de una variedad de diferentes tipos de recubrimientos de filtro para mejorar aún más las técnicas de SEM utilizando tinción líquida iónica para muestras biológicas en el rango de tamaño nanométrico.
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