rastrovací elektronový mikroskop v mikrobiologie a diagnostika infekční onemocnění

K výrobě elektricky vodivý povrch pro SEM, biologické vzorky jsou často potažené pomocí tenkého filmu odpařování nebo naprašování uhlíku nebo kovu ve vakuu nanášecího zařízení, které vyžaduje před dehydratací vzorku. Tento proces povlaku může zakrývat jemné ultrastrukturální detaily v závislosti na tloušťce nanesené vrstvy (obvykle 2-20 nm)., Tyto konvenční postupy jsou obtížné provádět na typické mikrobiologické vzorky, které jsou obvykle suspenze malých biologických částic ve vodě (<100 nm pro většinu virů, nebo v sub-µm velikost rozsah pro mnoho bakterií, hub a parazitů). Dalším problémem je, že mikroby zájmu o vzorky pacientů nebo vzorky prostředí mohou být přítomny v relativně nízkých koncentracích, což ztěžuje jejich pozorování na povrchu.,

v této zprávě popisujeme metody koncentrace mikrobiálních suspenzí pro pozorování SEM na předem potažených filtračních substrátech. Jsme ukázat, že místo prskat povlak, iontové kapaliny (1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate) se zředí ve vodě může být použit k rychle proniknout mikrobiologického SEM vzorek, tvoří se elektron-lucent vodivý povrch, který zabraňuje exemplář nabíjení a dává dobré výsledky s mikrobiální vzorky (Obr. 1)., Iontové kapaliny jsou vysoce vodivé soli, které zůstávají v kapalném stavu při pokojové teplotě a mají zanedbatelný tlak par (≤5 × 10-9 Torr). Pod vysoké vakuum podmínky moderního SEM (≤1 × 10-6 Torr) iontové kapaliny zůstávají v tekutém stavu, a není odpařit během provozu, zatímco ještě je conductive19,20,21,22,23. Nejužitečnější iontových kapalin pro aplikace v biologických SEM mají elektrickou vodivost kolem 100 mScm−1, jsou electrochemically stabilní (mají elektrochemické okno kolem 5.8 V), stejně jako rozpustné ve vodě a jsou snadno synthesised24., Iontové kapaliny s těmito vlastnostmi byly dříve prokázány, že poskytují kontrast obrazu SEM srovnatelný s použitím kovového a uhlíkového povlaku při použití s izolačními vzorky19,25. Také byly použity pro makroskopické zobrazování biologických vzorků, jako jsou mořské řasy, tkáně, kultivované buňky a kondenzované chromosomes20,21,22. K zabránění zpoplatnění byly použity vodivé substráty, jako je oxid indium-cín, hliníková fólie nebo krytiny potažené kovem20, tyto materiály jsou však nevhodné pro filtraci mikrobů., Zjistili jsme, že pro optimální výsledky pomocí iontové kapaliny s nižší objekty, jako jsou viry nebo bakteriální flagellae, před vrstvou polykarbonátové filtry s hliník nebo zlato bylo nutné. Jsme neobjevili žádné exemplář drift při použití iontové kapaliny barevného biologických vzorků, protože oni byli dobře podporován vodivé membrány používané během počátečního procesu filtrace. Polykarbonátové filtry SPI-pórů jsou hydrofilní a zůstávají tak po kovovém povlaku, což z nich činí ideální substrát pro práci s hydratovanými biologickými vzorky., Iontové kapaliny barvení může být také prováděno v rámci biologické bezpečnosti kabinetu, poskytující rychlé a bezpečné alternativou k praskání povlaku při práci s infekčními vzorky, od vakuové nanášecí zařízení může způsobit aerosoly a není snadno contained20,21,22. Elegantně jsme vyřešili problém koncentrace vzorku a zabránění nabíjení kovovým povlakem samotného filtračního substrátu před aplikací biologického vzorku(obr. 2). Při absenci tenkovrstvého povlaku vzorků byla také vyžadována infiltrace iontovými kapalinami, aby se zabránilo nabíjení., Výsledky jsou srovnatelné s použitím SEM s rozprašovacím povlakem a TEM pomocí techniky negativního barvení (obr. 1 a 2: doplňkové fíky S1–S5). Ultra-filtrace je důležitým krokem, protože pomáhá odstraňovat nečistoty, které mohou zakrýt detaily virů nebo bakterií přítomných v biologických vzorcích. V této zprávě jsme se prokázat jasné zobrazování virů a bakterií flagellae v nenatíraný SEM exempláře, které dříve vyžadovaly dehydratace a prskat povlak dosáhnout, a tím prodlužuje rozlišení a rozsah mikrobiální vzorky, které mohou být zkoumány pomocí SEM.,

Srovnání konvenční prskat povlak SEM metody přípravy vzorků (panely na levé straně) s iontové kapaliny léčba (centra panely) a konvenční TEM (panely na pravé straně) pro pozorování mikrobů: (a) Leptospira biflexa, (b) Salmonella Senftenberg, (c) vakcínie a (d) virus Ebola. SEM snímky v levé boční panely byly z exempláře, které byly prskat potažené zlatem, na běžný nenatíraný filtry., Obrázky ve středových panelech byly vzorků ošetřených iontovou kapalinou po nanesení na předem potažené hliníkové filtry. Na pravé straně TEM obrazy podobných vzorků připravených za použití methylaminu tungstate negativní barvení.

Příprava biologických vzorků pro SEM.

(a) komponenty filtrační jednotky jsou zobrazeny před montáží., Vložený SEM obrázek ukazuje zlatý potahovaný filtr při vysokém zvětšení před nanesením vzorku. Všimněte si, že filtr je čistý a póry jsou jasně patrné. b) filtrační jednotka je zobrazena po montáži a při použití s čerpadlem stříkačky v biologické bezpečnosti (c, d). Modrá šipka v (d) ukazuje na filtrační jednotku. e) obrazy filtrů, které na nich odpařily kov. Tloušťka Al je 18 nm a 9 nm a Au je 27 nm a 9 nm. Pro filtr s oběma kovy je tloušťka Al A Au 18 nm a 27 nm., f) SEM a g) odpovídající elementární mapa generovaná rentgenovou mikroanalýzou oblasti podobné oblasti zvýrazněné tečkovaným obdélníkem v písmenu e). (h–k) SEM obrázky salmonely obarvené iontovou kapalinou ilustrující účinek různých typů kovů a tloušťky kovu odpařené na konečných zaznamenaných snímcích (h Al 9 nm, i Au 9 nm, j Al 18 nm, k Au 27 nm). Červené šipky označují bičíky.

snímky bakterií potřísněné iontové kapaliny má plynulejší topografie povrchu než ty, které byly dehydrované a prskat povlakem., Měření velikosti ukazují, že dehydratované vzorky se zmenšily přibližně o 10-20 procent (Tabulka 1). Interpretujeme povrchu detail na dehydrataci, prskat potažené bakterie jako zvlnění buněčné stěny v důsledku smrštění, spíše než pozorování dalších funkcí, které jsou přítomny in vivo: tyto vrásky jsou tak pravděpodobné, že bude artefaktů kvůli vysychání. Bakteriální bičíky byly také jasně viditelné při iontové kapalné úpravě na vodivých substrátech (obr. 1, Doplňkový Obr. Galaxie). Tyto výsledky byly srovnatelné s výsledky, které jsme pozorovali při potahování SEM-rozprašováním a TEM-negativním barvením.,

Iontové kapaliny techniky mohou být také použity bezpečně s infekčními patogeny, v biologicky obsažené SEM prostoru, což umožňuje charakterizaci nových infekčních agens ve stavu blíže k jejich hydratované „přirozeném stavu“, než konvenční příprava vzorku techniques8. V případě tohoto šetření náš konvenční protokol zahrnoval dehydrataci v sérii ethanolu, následované sušením vzduchu a kovovým povlakem před zobrazením SEM., Pro iontové kapaliny protokolu, biologický vzorek byl pokles o 2,5% vodného roztoku 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate umístěny přímo na ní. Po blotování, aby se odstranila přebytečná tekutina, byl mokrý vzorek umístěn přímo do SEM. Při jednání s infekčními vzorky, další aldehydové fixaci krok je potřeba pro konvenční postup, aby se zabránilo riziku infekčních aerosolů, které by mohly být generovány během prskat povlak proces., Tato fixace krok není vyžadován, s iontové kapaliny techniku, jelikož vzorek může být zpracován v biotechnologické hood a pak být umístěny přímo v SEM v biologicky obsažené SEM enclosure8, pro zobrazování v nepřipevněné, hydratované, což je mnohem blíže k nativní stav organismu. Mikroskopie doplňuje konvenční diagnostické testy, které mohou chybět román nebo varianta strains3,26,27,28 a může rychle identifikovat typ organismu přítomen, řídí výběr z více konkrétní tests29., Elektronová mikroskopie však obvykle vyžaduje minimální koncentraci částic pro spolehlivou identifikaci mikrobů. U virů je to mezi 105 až 106 virovými částicemi / mL4, 5. S filtračními technikami lze provádět jak tem, tak SEM virů s tak malými částicemi 5000 na vzorek7.

iontové tekuté barvení na předem potažených filtrech je široce použitelné pro jakýkoli biologický vzorek, který může těžit z filtrace, aby koncentroval částice zájmu., Použití kovu potažené filtry s více než jeden typ povlaku na různé oblasti, umožňuje výběr podle toho, která z těchto povlaků dává optimální výsledky pro pozorování konkrétního jedince nebo konkrétní funkce, a pomáhá šetřit čas (Obr. 2a, e-k). Například, po iontové kapaliny barvení bakteriální flagellae objevil světlejší proti Al-potažený substrát, zatímco na Au-coated oblasti filtru kontrast je obrácen a flagellae se objevil tmavší (Obr. 2h-k)., Podobně obrazy Ebola a Leptospira biflexa ukázal, kvalitní topografický detail, když zobrazil s hliníkovým povlakem filtr, ale biologický materiál měl méně detailů a objevil se jako tmavá silueta ploché, když zobrazil na zlato potažené filtry (Doplňkové Fíky S4 a S5). Navrhujeme, aby to bylo způsobeno vyšším sekundárním signálem emisí elektronů z Au ve srovnání s Al. V tomto šetření jsme shromáždili SEM obrazy se sekundárním elektronovým detektorem, který se nejčastěji používá pro rutinní zobrazování s biologickými vzorky., V SEM je koeficient emisí sekundárních elektronů (δ) relativně konstantní bez ohledu na atomové číslo. Výjimkou je však Au, u kterého δ je téměř dvojnásobek oproti Al a mnoha dalším prvkům. Hodnota δ je také ovlivněna energií paprsku: při 20 kV je δ 0,1 pro Al a 0,2 pro Au30. Měřením intenzity sekundárních elektronových snímků pořízených při 4 kV s Al i Au na stejném obrázku(obr. 2f), vypočítali jsme signál z Au tak, aby byl 2,1 násobek intenzity Al,což se teoreticky blíží očekávanému., S obrazy zaznamenány exemplářů na zlato potažené filtry, budeme interpretovat výsledky jak produkovat příliš mnoho rozdíl od pozadí substrátu, který spíše obskurní jemné detaily, jako jsou flagellae, které se objevují jako „siluety“ na světlém pozadí. Iontová kapalina infiltrovaná mikroby a filtr potažený hliníkem však mají podobné emisní koeficienty, takže kontrast je do značné míry způsoben topografií spíše než rozdíly ve složení materiálu, což umožňuje vidět jemnější detaily.,

předběžný nátěr filtrů kovem neovlivnil velikost pórů ani filtrační kapacitu filtrů (obr. 2). Celý iontový protokol pro barvení kapalin lze provést na standardní laboratorní lavici asi za 15 minut a vejde se do skříně biologické bezpečnosti (obr. 2c, d). V prskat povlak pro SEM, příliš tenká vrstva způsobuje špatné vedení a nabíjení, zatímco příliš silná vrstva zakrývá jemné detaily., Tloušťka použité pro pre-povlak substráty mohou být mnohem větší, než prskat nátěry se obvykle používá pro biologické vzorky, pro zajištění dobré vodivosti, tak dlouho, dokud filtr póry nejsou blokovány. (Obr. 2e-k, Doplňkový Obr. S2).

V tomto šetření jsme použili povlaky z 18. a 27 nm, pro Al a Au respektive, protože tyto tloušťky byly dostatečné, aby se zabránilo nabíjení ve srovnání s uncoated filtry (Doplňkový Obr. S2). Substráty s těmito minimálními tloušťkami byly snadno vybrány, protože byly viditelné jako lesklý kovový povlak., Když byly přítomny povlaky menší než 27 nm pro Au nebo 18 nm pro Al, měly neprůhledný nebo plochý bílý vzhled(obr. 2). S ionic liquid barvení pomocí těchto kovové potažené filtry, jsme byli schopni vizualizovat jemné konstrukční detaily bakterií, jako je například flagellae Salmonel, které jsou 20 nm v průměru, pomocí SEM (Obr. 2j, k, Doplňkový obr. Galaxie).,

výsledky získané s filtrací a jednoduché iontové kapaliny infiltrace pro SEM jsou velmi srovnatelné kvalitou s těmi z běžných prskat povlak v SEM a negativní barvení v TEM pro různé bakteriální a virové vzorky, včetně Leptospira, Salmonely, virus vakcínie a Ebola (Obr. 1, Doplňkový Obr. S3-S5) 7,16,31,32. Zjistili jsme, že tam bylo mnohem méně smrštění iontové kapaliny infiltrovali viry a bakterie se tak ve srovnání s oběma dehydrované prskat potažené SEM přípravy a TEM negativní barevné obrázky (Tabulka 1)., Ve všech případech byly rozměry dehydratovaných SEM rozprašovacích a záporně zbarvených tem mikrobů od 9, 9% do 18, 9% menší než vzorky ošetřené iontovou kapalinou (Tabulka 1). V předchozím šetření jsme segmentu frozen-glazované Ebola pomocí kryo-elektronové mikroskopie průměr Ebola byla měřena jako 96-98 nm16 což je velmi podobná hodnota 98,5 ± 10.2 nm v průměru měří stejné vzorky ošetřené iontové kapaliny v této studii., To dále ukazuje, že objem iontové kapaliny infiltroval vzorky jsou srovnatelné s těmi, které měří pod zmrazené hydratované podmínek a úzce odrážet plně hydratovaná rodném státě Ebola. Pro bacilliform struktura, 10% snížení v rozměry odpovídá 27% snížení objemu v důsledku dehydratace, i když kolaps a zploštění válcového tvaru by znamenalo ještě větší ztrátu vody., Z toho je zřejmé, že toto zploštění a zhroucení způsobené dehydratací je do jisté míry přítomno ve všech obrazech virů a bakterií potažených rozprašováním (obr. 1).

i když se obrázky zdají být relativně podobné, zdá se, že povlak Gold sputter poskytuje o něco větší kontrast než iontová kapalina. Dalším pozorovatelným rozdílem je menší drsnost povrchu bakteriálních buněčných stěn v iontových tekutých obarvených obrazech. To lze vidět na obrázcích salmonely(obr. 1, Doplňkový Obr. Galaxie)., Na těchto obrázcích je na povrchu bakteriálních buněk potažených rozprašováním jasný texturovaný a vrásčitý vzhled a hladký vzhled na buněčných stěnách iontových kapalných infiltrovaných přípravků. Navrhujeme, že tento pozorovaný rozdíl je do značné míry důsledkem ztráty buněčný turgor v důsledku dehydratace a ztráta objemu v prskat potažené vzorky, a tak vrásky ve skutečnosti může být artefakt nebo funkci, která je zvýrazněna dehydratace., Důkazy pro toto vychází ze skutečnosti, že jiné jemné struktury, jako jsou flagellae, jsou jasně viditelné (a podobný vzhled) v obou prskat-potažené a iontové kapaliny ošetřených vzorků. Výsledky předchozích studií s použitím rozprašovacího povlaku bakterií tak mohou být opatrně re-interpretovány s ohledem na možné dehydratační účinky.

postup iontové kapaliny uvedený v tomto šetření je rychlý a reprodukovatelný, protože vzorkové filtry lze připravit předem., Jako iontová kapalina má velmi nízký tlak par, další výhodou je, že sušení artefakty, jako je smršťování, tvorbě vrásek nebo praskání, které se mohou objevit v průběhu SEM pozorování se vyhnout (Tabulka 1, Doplňkový Obr. Galaxie). V budoucnu předpokládáme vývoj různých typů filtračních povlaků pro další zlepšení technik SEM pomocí iontového barvení kapalin pro biologické vzorky v rozsahu velikostí nanometrů.