Das Rasterelektronenmikroskop in der Mikrobiologie und Diagnose von Infektionskrankheiten

Um eine elektrisch leitfähige Oberfläche für SEM zu erzeugen, werden biologische Proben häufig mit Dünnschichtverdampfung oder Sputtern von Kohlenstoff oder Metall in einem Vakuumbeschichter beschichtet, was eine vorherige Austrocknung der Probe erfordert. Dieser Beschichtungsprozess kann feine ultrastrukturelle Details verdecken, abhängig von der Dicke der abgeschiedenen Schicht (normalerweise 2-20 nm)., Diese herkömmlichen Verfahren sind bei typischen mikrobiologischen Proben, bei denen es sich üblicherweise um Suspensionen kleiner biologischer Partikel in Wasser handelt, nur schwer durchzuführen (<100 nm für die meisten Viren oder im Submikrometergrößenbereich für viele Bakterien, Pilze und Parasiten). Ein weiteres Problem besteht darin, dass die Mikroben, die für Patientenproben oder Umweltproben von Interesse sind, in relativ geringen Konzentrationen vorhanden sein können, was deren Beobachtung auf einer Oberfläche erschwert.,

In diesem Bericht beschreiben wir Methoden zur Konzentration mikrobieller Suspensionen zur SEM-Beobachtung auf vorbeschichtete Filtersubstrate. Wir zeigen, dass anstelle der Sputterbeschichtung eine in Wasser verdünnte ionische Flüssigkeit (1-Butyl-3-Methylimidazoliumtetrafluoroborat) verwendet werden kann, um eine mikrobiologische SEM-Probe schnell zu infiltrieren und eine elektronenluzent leitende Oberfläche zu bilden, die das Laden von Proben verhindert und bei mikrobiellen Proben gute Ergebnisse liefert (Abb. 1)., Ionische Flüssigkeiten sind hochleitende Salze, die bei Raumtemperatur im flüssigen Zustand verbleiben und einen vernachlässigbaren Dampfdruck (≤5 × 10-9 Torr) aufweisen. Unter den Hochvakuumbedingungen eines modernen SEM (≤1 × 10-6 Torr) bleiben ionische Flüssigkeiten in flüssigem Zustand und verdampfen während des Betriebs nicht, während sie noch leitfähig19,20,21,22,23. Die nützlichsten ionischen Flüssigkeiten für Anwendungen im biologischen SEM haben eine elektrische Leitfähigkeit von rund 100 mScm-1, sind elektrochemisch stabil (mit einem elektrochemischen Fenster von etwa 5,8 V), wasserlöslich und leicht synthetisierbar24., Ionische Flüssigkeiten mit diesen Eigenschaften haben bisher gezeigt, dass sie einen SEM-Bildkontrast ergeben,der mit der Verwendung von Metall-und Kohlenstoffbeschichtung vergleichbar ist, wenn sie mit isolierenden Spezimens19, 25 verwendet werden. Sie wurden auch für die makroskopische Bildgebung biologischer Proben wie Algen, Gewebekulturen und kondensierten Chromosomen20, 21,22 verwendet. Leitfähige Substrate wie Indium-Zinnoxid, Aluminiumfolie oder metallbeschichtete Deckgläser wurden verwendet, um eine Aufladung zu verhindern20, diese Materialien sind jedoch für die Filtration für SEM-Untersuchungen von Mikroben ungeeignet., Wir entdeckten, dass für optimale Ergebnisse bei der Verwendung von Ionenflüssigkeit mit subzellulären Objekten wie Viren oder bakteriellen Flagellen eine vorherige Beschichtung von Polycarbonatfiltern mit Aluminium oder Gold erforderlich war. Wir haben bei der Verwendung von ionenflüssigkeitsgefärbten biologischen Proben keine Probendrift festgestellt, da sie von der leitenden Membran, die während des anfänglichen Filtrationsprozesses verwendet wurde, gut unterstützt wurden. Die SPI-Poren-Polycarbonat-Filter sind hydrophil und bleiben nach der Metallbeschichtung erhalten, was sie zu einem idealen Substrat für die Arbeit mit hydratisierten biologischen Proben macht., Ionische Flüssigkeitsfärbung kann auch innerhalb eines biologischen Sicherheitsschranks durchgeführt werden, was eine schnelle und sichere Alternative zur Sputterbeschichtung bei der Arbeit mit infektiösen Proben bietet,da Vakuumbeschichtungsgeräte Aerosole verursachen können und nicht leicht enthalten sind20,21, 22. Wir haben das Problem der Konzentration der Probe und der Verhinderung der Aufladung elegant gelöst, indem das Filtersubstrat selbst vor dem Auftragen der biologischen Probe metallbeschichtet wurde (Abb. 2). In Ermangelung einer Dünnschichtbeschichtung der Proben war auch eine Infiltration mit ionischen Flüssigkeiten erforderlich, um eine Aufladung zu vermeiden., Die Ergebnisse sind vergleichbar mit der Verwendung von SEM mit Sputterbeschichtung und TEM mit negativer Färbetechnik (Abb.1 und 2: Ergänzende Abb. S1–S5). Die Ultrafiltration ist ein wichtiger Schritt, da sie dazu beiträgt, Ablagerungen zu entfernen, die die Details von Viren oder Bakterien in biologischen Proben verdecken können. Im aktuellen Bericht zeigen wir eine klare Bildgebung von Viren und bakteriellen Flagellen in unbeschichteten SEM-Proben, die zuvor eine Dehydratation und Sputterbeschichtung erforderten, und erweitern so die Auflösung und Reichweite von mikrobiellen Proben, die mit SEM untersucht werden können.,

Vergleich konventioneller Methoden zur Herstellung von Sputterbeschichtungen SEM Proben (Platten auf der linken Seite) mit ionischer Flüssigkeitsbehandlung (Mittelplatten) und konventionellem TEM (Platten auf der rechten Seite) zur Beobachtung von Mikroben: (a) Leptospira biflexa, (b) Salmonella Senftenberg, (c) Vaccinia und (d) Ebola-Virus. Die SEM-Bilder in den linken Seitenwänden waren von Proben,die mit Gold überzogen waren, auf einfachen unbeschichteten Filtern., Bilder in den Mittelplatten waren von Proben, die nach Abscheidung auf vorbeschichteten Aluminiumfiltern mit Ionenflüssigkeit behandelt wurden. Auf der rechten Seite, TEM-Bilder von ähnlichen Proben hergestellt mit Methylamin tungstate negative Färbung.

Vorbereitung biologischer Proben für SEM.

(a) Die Komponenten der Filtereinheit werden vor der Montage dargestellt., Das eingesetzte SEM-Bild zeigt einen goldbeschichteten Filter mit hoher Vergrößerung, bevor eine Probe aufgetragen wird. Beachten Sie, dass der Filter sauber ist und die Poren deutlich sichtbar sind. (b) Die Filtereinheit wird nach der Montage und bei Verwendung mit einer Spritzenpumpe in einem Biosicherheitsschrank (c,d) dargestellt. Der blaue Pfeil in (d) zeigt auf die Filtereinheit. (e) Bilder von Filtern, auf denen Metall verdampft ist. Die Dicke des Al beträgt 18 nm und 9 nm und der Au ist 27 nm und 9 nm dick. Für den Filter mit beiden Metallen beträgt die Dicke von Al und Au 18 nm bzw., (f) SEM und (g) die entsprechende Elementarkarte, die durch Röntgenmikroanalyse einer Region erzeugt wird, die der durch das gepunktete Rechteck in (e) hervorgehobenen ähnlich ist. (h–k) SEM-Bilder von Salmonellen, die mit Ionenflüssigkeit gefärbt sind, veranschaulichen die Wirkung verschiedener Metalltypen und die Dicke des verdampften Metalls auf die endgültigen aufgenommenen Bilder (h Al 9 nm, i Au 9 nm, j Al 18 nm, k Au 27 nm). Rote Pfeile zeigen Flagellen an.

Die Bilder von Bakterien, die mit Ionenflüssigkeit befleckt waren, hatten eine glattere Oberflächentopographie als diejenigen, die dehydriert und sputterbeschichtet waren., Größenmessungen zeigen, dass die dehydrierten Proben um etwa 10-20 Prozent schrumpften (Tabelle 1). Wir interpretieren das Oberflächendetail der dehydrierten, mit Sputter beschichteten Bakterien als Faltenbildung der Zellwand aufgrund von Schrumpfung, anstatt Beobachtung zusätzlicher Merkmale, die in vivo vorhanden sind: Diese Falten sind daher wahrscheinlich Artefakte aufgrund von Trocknung. Bakterielle Flagellen waren auch bei ionischer Flüssigkeitsbehandlung auf den leitenden Substraten deutlich sichtbar (Abb. 1, Ergänzende Abb. S3). Diese Ergebnisse waren vergleichbar mit denen, die wir mit SEM-Sputter-Beschichtung und TEM-negativer Färbung beobachteten.,

Ionische Flüssigkeitstechniken können auch sicher mit infektiösen Krankheitserregern in einem biologisch enthaltenen SEM-Gehäuse verwendet werden, um die Charakterisierung neuartiger Infektionserreger in einem Zustand zu ermöglichen, der näher an ihrem hydratisierten“ nativen Zustand “ liegt als durch herkömmliche Probenpräparationstechniken8. Im Falle dieser Untersuchung umfasste unser herkömmliches Protokoll die Dehydrierung in Ethanol-Serien, gefolgt von Lufttrocknung und Metallbeschichtung vor der SEM-Bildgebung., Für das ionische Flüssigkeitsprotokoll wurde der biologischen Probe ein Tropfen einer 2,5% igen wässrigen Lösung von 1-Butyl-3-Methylimidazoliumtetrafluoroborat direkt darauf gegeben. Nach dem Abtupfen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, wurde die nasse Probe dann direkt in das SEM gegeben. Beim Umgang mit infektiösen Proben ist für das herkömmliche Verfahren ein zusätzlicher Aldehydfixierungsschritt erforderlich, um das Risiko infektiöser Aerosole zu vermeiden, die während des Sputterbeschichtungsprozesses erzeugt werden könnten., Dieser Fixierungsschritt ist bei der ionischen Flüssigkeitstechnik nicht erforderlich, da die Probe in einer biologischen Behälterhaube verarbeitet und dann direkt in einem SEM in einer biologisch enthaltenen SEM-Enclosure8 platziert werden kann, um in einem unfixierten, hydratisierten Zustand, der dem nativen Zustand des Organismus viel näher ist, abgebildet zu werden. Die Mikroskopie ergänzt herkömmliche diagnostische Tests,die neuartige oder variantenreiche Belastungen übersehen können3,26,27, 28 und kann die Art des vorhandenen Organismus schnell identifizieren und die Auswahl spezifischerer Tests leiten29., Die Elektronenmikroskopie erfordert jedoch normalerweise eine minimale Partikelkonzentration zur zuverlässigen Identifizierung von Mikroben. Bei Viren liegt dieser zwischen 105 und 106 Viruspartikeln / mL4, 5. Mit Filtrationstechniken können sowohl TEM als auch SEM von Viren mit nur 5000 Partikeln pro Probe durchgeführt werden7.

Die ionische Flüssigkeitsfärbung auf vorbeschichteten Filtern ist weit verbreitet für jede biologische Probe, die von der Filtration profitieren kann, um interessierende Partikel zu konzentrieren., Die Verwendung von metallbeschichteten Filtern mit mehr als einer Art von Beschichtung auf verschiedenen Bereichen ermöglicht die Auswahl, welche dieser Beschichtungen die optimalen Ergebnisse für die Beobachtung einer bestimmten Probe oder bestimmter Merkmale liefert und hilft, Zeit zu sparen (Abb. 2a,e–k). Zum Beispiel erschienen bakterielle Flagellen nach der ionischen Flüssigkeitsfärbung heller gegen das Al-beschichtete Substrat, während auf dem Au-beschichteten Bereich des Filters der Kontrast umgekehrt wurde und die Flagellen dunkler erschienen (Abb. 2h–k)., In ähnlicher Weise zeigten die Bilder von Ebola-Virus und Leptospira biflexa eine gute topografische Detailqualität, wenn sie mit einem aluminiumbeschichteten Filter abgebildet wurden, aber das biologische Material hatte weniger Details und erschien als dunkle flache Silhouette, wenn es auf goldbeschichteten Filtern abgebildet wurde (Ergänzende Feigen S4 und S5). Wir schlagen vor, dass dies auf das höhere sekundäre Elektronenemissionssignal von Au im Vergleich zu Al zurückzuführen ist. In dieser Untersuchung haben wir SEM-Bilder mit dem sekundären Elektronendetektor gesammelt, der am häufigsten für die routinemäßige Bildgebung mit biologischen Proben verwendet wird., In SEM ist der sekundäre Elektronenemissionskoeffizient (δ) unabhängig von der Ordnungszahl relativ konstant. Eine Ausnahme bildet jedoch Au, für das δ fast doppelt so hoch ist wie Al und viele andere Elemente. Der Wert von δ wird auch durch die Strahlenergie beeinflusst: Bei 20 kV beträgt δ 0,1 für Al und 0,2 für Au30. Durch Messung der Intensität in sekundären Elektronenbildern, die bei 4 kV mit Al und Au im selben Bild aufgenommen wurden (Abb. 2f), berechneten wir das Signal von der Au auf das 2,1-fache der Intensität der Al, was theoretisch nahe an der erwarteten liegt., Mit den Bildern, die von Proben auf den goldbeschichteten Filtern aufgenommen wurden, interpretieren wir die Ergebnisse so, dass sie zu viel Kontrast vom Hintergrundsubstrat erzeugen, was dazu neigte, feine Details wie Flagellen zu verdecken, die als „Silhouetten“ auf hellem Hintergrund erscheinen. Die infiltrierten Ionenflüssigkeitsmikroben und der aluminiumbeschichtete Filter weisen jedoch ähnliche Emissionskoeffizienten auf, so dass der Kontrast weitgehend auf die Topographie und nicht auf die Unterschiede in der Materialzusammensetzung zurückzuführen ist, so dass feinere Details zu sehen sind.,

Die Vorbeschichtung der Filter mit Metall beeinflusste weder die Porengröße noch die Filtrationskapazität der Filter (Abb. 2). Das gesamte ionische Flüssigkeitsfärbungsprotokoll kann in etwa 15 Minuten auf einer Standardlaborbank durchgeführt werden und passt in einen Biosicherheitsschrank (Abb. 2c,d). Bei der Sputterbeschichtung für SEM verursacht eine zu dünne Schicht eine schlechte Leitung und Aufladung, während eine zu dicke Schicht feine Details verdeckt., Die Dicke, die für die Vorbeschichtung der Substrate verwendet wird, kann viel größer sein als Sputterbeschichtungen, die typischerweise für biologische Proben verwendet werden, um eine gute Leitfähigkeit zu gewährleisten, solange die Filterporen nicht verstopft sind. (Abb. 2e–k, Ergänzende Abb. S2).

Bei dieser Untersuchung verwendeten wir Beschichtungen von 18 bzw. 27 nm für Al bzw. Au, da diese Dicken im Vergleich zu unbeschichteten Filtern als ausreichend befunden wurden, um eine Aufladung zu verhindern (Ergänzende Abb. S2). Substrate mit diesen minimalen Dicken waren leicht zu wählen, da sie als glänzende metallische Beschichtung sichtbar waren., Wenn Beschichtungen von weniger als 27 nm für Au oder 18 nm für die Al vorhanden waren, hatten sie ein undurchsichtiges oder flachweißes Aussehen (Abb. 2). Mit der ionischen Flüssigkeitsfärbung unter Verwendung dieser metallbeschichteten Filter konnten wir die feinen strukturellen Details von Bakterien, wie die Flagellen von Salmonellen mit einem Durchmesser von 20 nm, durch SEM visualisieren (Abb. 2j,k, Ergänzende Abb. S3).,

Die Ergebnisse, die mit Filtration und einfacher ionischer Flüssigkeitsinfiltration für SEM erzielt wurden,sind in ihrer Qualität sehr vergleichbar mit denen aus herkömmlicher Sputterbeschichtung in SEM und negativer Färbung in TEM für eine Vielzahl von bakteriellen und viralen Proben, einschließlich Leptospira, Salmonellen, Vaccinia-Virus und Ebola-Virus (Abb. 1, Ergänzende Abb. S3–S5)7,16,31,32. Wir fanden heraus, dass die infiltrierten Bakterien und Viren der ionischen Flüssigkeit im Vergleich zu den dehydrierten sputterbeschichteten SEM-Präparaten und den TEM-negativ gefärbten Bildern viel weniger schrumpften (Tabelle 1)., In allen Fällen waren die Abmessungen der dehydrierten SEM-sputterbeschichteten und negativ gefärbten TEM-Mikroben von 9,9% bis 18,9% kleiner als die mit Ionenflüssigkeit behandelten Proben (Tabelle 1). In einer früheren Untersuchung haben wir das eingefrorene-verglaste Ebola-Virus mittels Kryoelektronenmikroskopie abgebildet Der Durchmesser des Ebola-Virus wurde als 96-98 nm gemessen, was dem Wert von 98,5 ± 10,2 nm für den Durchmesser sehr ähnlich ist, der von denselben Proben gemessen wurde, die in der vorliegenden Studie mit Ionenflüssigkeit behandelt wurden., Dies zeigt weiter, dass die Volumina der infiltrierten Proben der ionischen Flüssigkeit mit denen vergleichbar sind, die unter gefrorenen hydratisierten Bedingungen gemessen wurden, und den vollständig hydratisierten nativen Zustand des Ebola-Virus genau widerspiegeln. Bei einer bacilliformen Struktur entspricht eine Verringerung der Abmessungen um 10% einer Volumenreduzierung um 27% aufgrund von Dehydratation, obwohl ein Zusammenbruch und eine Abflachung der zylindrischen Form einen noch größeren Wasserverlust bedeuten würden., Es ist klar, dass diese Abflachung und Kollaps aufgrund von Austrocknung in gewissem Maße in allen Bildern von Sputter beschichteten Viren und Bakterien vorhanden ist (Abb. 1).

Obwohl die Bilder relativ ähnlich erscheinen, scheint Goldsputterbeschichtung etwas mehr Kontrast als ionische Flüssigkeit zu geben. Ein weiterer beobachtbarer Unterschied ist weniger die Oberflächenrauheit der Bakterienzellwände in den ionischen flüssigkeitsgefärbten Bildern. Dies ist auf den Bildern von Salmonellen zu sehen (Abb. 1, Ergänzende Abb. S3)., In diesen Bildern gibt es ein klares strukturiertes und faltiges Aussehen auf der Oberfläche der mit Sputter beschichteten Bakterienzellen und ein glattes Aussehen an den Zellwänden der ionischen Flüssigkeit infiltrierten Präparate. Wir schlagen vor, dass dieser beobachtete Unterschied größtenteils auf den Verlust von Zellturgor aufgrund von Dehydration und Volumenverlust in den mit Sputter beschichteten Proben zurückzuführen ist, und daher können die Falten tatsächlich ein Artefakt oder ein Merkmal sein, das durch Dehydration akzentuiert wird., Ein Beleg dafür ist die Tatsache, dass andere feine Strukturen, wie Flagellen, sowohl in den mit Sputter beschichteten als auch mit Ionenflüssigkeit behandelten Proben deutlich sichtbar (und von ähnlichem Aussehen) sind. Daher müssen die Ergebnisse früherer Studien mit Sputterbeschichtung von Bakterien im Lichte möglicher Dehydratisierungseffekte möglicherweise vorsichtig neu interpretiert werden.

Das in dieser Untersuchung vorgestellte ionische Flüssigkeitsverfahren ist schnell und reproduzierbar, da Probenfilter im Voraus vorbereitet werden können., Da die ionische Flüssigkeit einen sehr niedrigen Dampfdruck aufweist, besteht ein zusätzlicher Vorteil darin, dass Trocknungsartefakte wie Schrumpfung, Faltenbildung oder Rissbildung, die während der SEM-Beobachtung auftreten können, vermieden werden (Tabelle 1, ergänzende Abb. S3). In Zukunft erwarten wir die Entwicklung einer Vielzahl verschiedener Arten von Filterbeschichtungen, um die SEM-Techniken unter Verwendung der ionischen Flüssigkeitsfärbung für biologische Proben im Nanometergrößenbereich weiter zu verbessern.