Den scanning electron microscope i mikrobiologi og diagnose av smittsomme sykdommer

for Å lage en elektrisk ledende overflaten for SEM, biologiske prøver er ofte belagt med tynn film fordamping, eller putrer av karbon eller metall i et vakuum coater, som krever forutgående dehydrering av prøven. Dette belegget prosessen kan skjule fine ultrastructural detaljer, avhengig av tykkelsen på laget avsatt (vanligvis 2-20 nm)., Disse konvensjonelle prosedyrer er vanskelig å gjennomføre på vanlig mikrobiologiske prøver, som vanligvis suspensjoner av små biologiske partikler i vann (<100 nm for de fleste virus, eller i bi-micrometre størrelsen for mange bakterier, sopp og parasitter). Et ytterligere problem er at mikrobene av interesse i pasientprøver eller jordprøver kan være til stede i relativt lave konsentrasjoner, noe som gjør observasjon av dem på en overflate som er vanskelig.,

I denne rapporten beskriver vi metodene for å konsentrere seg mikrobiell suspensjoner for SEM observasjon på pre-belagt filter underlag. Vi viser det, i stedet for å frese-belegg, er en ionisk væske (1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate) fortynnet i vann kan brukes til raskt å infiltrere et mikrobiologisk SEM eksempel, danner et elektron-lucent ledende overflaten, noe som hindrer at prøven lading og gir gode resultater med mikrobiell prøver (Fig. 1)., Ioniske væsker er godt ledende mineraler som forblir i flytende form ved romtemperatur og har en ubetydelig damptrykk (≤5 × 10-9 Torr). Under høyt vakuum forhold til en moderne SEM (≤1 × 10-6 Torr) ioniske væsker forbli i en flytende tilstand, og ikke fordamper under bruk, mens du fremdeles vil være conductive19,20,21,22,23. Den mest nyttige ioniske væsker for bruk i biologiske SEM har en elektrisk ledningsevne av rundt 100 mScm−1, er electrochemically stabil (å ha en elektrokjemisk vinduet på rundt 5.8 V), så vel som å være vannløselig og er lett synthesised24., Ioniske væsker med disse egenskapene har tidligere blitt vist å gi SEM bilde kontrast sammenlignes med bruk av metall og karbon belegg når det brukes med isolerende specimens19,25. De har også blitt brukt for makroskopiske avbildning av biologiske prøver, som for eksempel tang, vev celler dyrket i kultur og kondensert chromosomes20,21,22. Ledende underlag, som f.eks. indium-tin-oksid, aluminiumsfolie, eller metall belagt coverslips har blitt brukt for å forhindre charging20, men disse materialene er uegnet for filtrering for SEM undersøkelser av mikrober., Vi oppdaget det, for optimale resultater ved hjelp av ioniske væsken med subcellular objekter, for eksempel virus eller bakterie flagellae, før påføring av polykarbonat filtre med aluminium eller gull var nødvendig. Vi gjorde ikke oppdage noen prøven drift ved bruk av ioniske væsken farget biologiske prøver, siden de ble godt støttet av conducting membrane brukt under den første filtrering prosessen. SPI-pore polykarbonat filtre er hydrofile og forbli så etter metall belegg, noe som gjør dem til en ideell substrat å jobbe med hydrert biologiske prøver., Ionisk væske flekker kan også være utført innen biologisk sikkerhet kabinett, som gir en rask og trygg alternativ til å frese belegg når du arbeider med smittsomme prøver, siden vakuum belegg utstyr kan føre til aerosoler og er ikke lett contained20,21,22. Vi har elegant løst problemet med å konsentrere seg prøven og forebygge lading, av metall belegg av filteret substrat seg selv før man påfører den biologiske prøven (Fig. 2). I fravær av tynt belegg av prøvene, infiltrasjon med ioniske væsker var også nødvendig for å unngå å lade., Resultatene er sammenlignbare med bruk av SEM med frese belegg og TEM bruke negativ farging teknikk (Fig 1 og 2: Supplerende Fiken S1–S5). Ultra-filtrering er et viktig trinn, siden det bidrar til å fjerne rusk som kan skjule detaljer av virus eller bakterier til stede i biologiske prøver. I denne rapporten viser vi klare avbildning av virus og bakterielle flagellae i ubestrøket SEM prøver, som tidligere krevde dehydrering og frese belegg for å oppnå, og forlenger dermed oppløsning og omfanget av mikrobiell prøver som kan bli undersøkt med SEM.,

Sammenligning av konvensjonell frese belegg SEM klargjøring av metoder (paneler på venstre side) med ionisk væske behandling (sentrum paneler) og konvensjonelle TEM (panelene på høyre side) for observasjon av mikrober: (en) Leptospira biflexa, (b) Salmonella Senftenberg, (c) vaccinia og (d) Ebola-viruset. Den SEM bilder i venstre side paneler var av prøvene som ble frese belagt med gull, på vanlig ubestrøket filtre., Bilder i sentrum panelene ble av prøver behandlet med ionisk væske etter avsetning på pre-belagt aluminium filtre. På høyre side, TEM bilder av lignende prøver utarbeidet ved hjelp av methylamine tungstate negativ farging.

Utarbeidelse av biologiske prøver for SEM.

(a) komponenter av filter-enhet er vist før montering., Inset SEM bildet viser en gull-belagt filter ved høy forstørrelse før en prøve er brukt. Vær oppmerksom på at filteret er rent og porene er tydelig. (b) filter-enheten er vist etter montering, og er i bruk med en sprøyte pumpe i et biosafety kabinett (c,d). Den blå pilen i (d) poeng til filteret enhet. (e) Bilder av filtre som har hatt metallfordampet på dem. Tykkelsen av Al er 18 nm og 9 nm og Au er 27 nm og 9 nm tykk. For filter med både metaller tykkelsen av Al og Au er 18 nm og 27 nm, henholdsvis., (f) SEM og (g) tilsvarende elemental kartet som er generert av X-ray microanalysis av en region som er lik den en markert med stiplede rektangelet i (e). (h–k) SEM bilder av Salmonella farget med ionisk væske som illustrerer effekten av forskjellige typer metall og tykkelse av metallfordampet på den siste bilder som er tatt opp (h Al-9 nm, jeg Au 9 nm, j Al-18 nm, k Au 27 nm). Røde piler indikerer flagellae.

bilder av bakterier farget med ioniske væsken hadde en jevnere overflate topografi enn de som var dehydrert og frese belagt., Størrelse målinger viser at dehydrert prøver krympet med ca 10-20 prosent (Tabell 1). Vi tolke overflaten detaljer på dehydrert, frese belagt bakterier som rynker i celleveggen på grunn av svinn, snarere enn observasjon av flere funksjoner som er til stede i vivo: disse rynker er dermed sannsynlig å være gjenstander som på grunn av tørke. Bakteriell flagellae var også godt synlig med ionisk væske behandling på ledende substrater (Fig. 1, Supplerende Fig. S3). Disse resultatene var sammenlignbare med de vi har observert med SEM-frese belegg og TEM-negativ farging.,

Ionisk væske teknikker kan også trygt brukes med smittsomme patogener, i en biologisk inneholdt SEM skapet, slik at den karakterisering av nye agens i en tilstand nærmere hydrert «naturlig tilstand» enn ved konvensjonell prøveopparbeidelse techniques8. I tilfelle av denne undersøkelsen våre vanlige protokollen involvert dehydrering i etanol-serien, etterfulgt av tørking og metall belegg før SEM bildebehandling., For den ioniske væsken protokollen, den biologiske prøven hadde en nedgang på 2,5% vandig løsning av 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate plassert direkte på det. Etter blotting for å fjerne overflødig væske våte prøven ble deretter plassert direkte i SEM. Når du arbeider med smittsomme prøver, en ekstra aldehyd fiksering trinn som er nødvendig for den vanlige prosedyren for å unngå risikoen for smittsomme aerosoler som kan genereres under frese belegg prosess., Dette fiksering trinnet er ikke nødvendig med den ioniske væsken teknikk, siden prøven kan bli behandlet i en biologisk forurensning hette og deretter plasseres direkte i en SEM i en biologisk inneholdt SEM enclosure8, for bildebehandling i en ikke-fikserte, hydrert staten, som er mye nærmere den opprinnelige tilstanden til organismen. Mikroskopi utfyller vanlige diagnostiske tester som kan gå glipp av romanen eller variant strains3,26,27,28 og kan raskt identifisere hvilken type organisme til stede, guiding utvalg av mer spesifikke tests29., Imidlertid, elektron mikroskopi vanligvis krever et minimum konsentrasjon av partikler for pålitelig identifisering av mikrober. For virus, dette er mellom 105 til 106 virus partikler/mL4,5. Med filtrering teknikker, både TEM og SEM virus kan gjennomføres med så lite som 5000 partikler per sample7.

Ionisk væske flekker på pre-belagt filtre er allment gjeldende til enhver biologisk prøve som kan dra nytte av filtrering for å konsentrere seg partikler av interesse., Bruk av metall belagt filtre med mer enn én type belegg på ulike områder gjør at utvalget av hvilken av disse beleggene som gir optimale resultater for å observere en bestemt prøve eller bestemte funksjoner, og bidrar til å spare tid (Fig. 2a,e–k). For eksempel, etter ionisk væske farging bakteriell flagellae dukket opp lysere mot Al-belagt substrat, mens på Au-belagt området for filter kontrasten er reversert og flagellae dukket opp mørkere (Fig. 2h–k)., På samme måte kan det bilder av Ebola-viruset og Leptospira biflexa viste god kvalitet topografiske detaljer når avbildes med en aluminium belagt filter, men biologisk materiale hadde mindre detalj, og viste seg som en mørk flatskjerm silhouette når avbildes på gull belagt filtre (Supplerende Fiken S4 og S5). Vi foreslår at dette er på grunn av høyere sekundær electron utslipp signal fra Au i forhold til Al. I denne undersøkelsen har vi samlet SEM bilder med den sekundære electron detektor, som er mest brukt for rutinemessige bildebehandling med biologiske prøver., I SEM, sekundær electron utslipp koeffisient (δ) er relativt konstant uavhengig av atomnummer. Men et unntak er med Au, der δ er nesten det dobbelte av Al og mange andre elementer. Verdien av δ er også påvirket av stråle-energi: på 20 kV, δ er 0,1 for Al og 0,2 for Au30. Ved å måle intensiteten i videregående electron bilder tatt på 4 kV med både Al og Au i det samme bildet (Fig. 2f), har vi beregnet signalet fra Au til å være 2.1 ganger intensiteten av Al, som er nær det forventede teoretisk., Med bilder som er tatt av prøver på gull belagt filtre, kan vi tolke resultatene som produserer for mye kontrast i bakgrunnen, substrat, som hadde en tendens til å skjule fine detaljer som flagellae som vises som en «silhuetter» på en lys bakgrunn. Men den ioniske væsken infiltrert mikrober og aluminium belagt filter, har lignende utslipp koeffisienter, og dermed kontrasten er stor grad på grunn av topografien snarere enn forskjeller i materielle sammensetning, slik at flere fine detaljer å bli sett.,

Pre-belegg av filtre med metall ikke påvirker pore størrelser, eller filtrering kapasitet filtre (Fig. 2). Hele ionisk væske-farging-protokollen kan gjennomføres på en standard laboratorium benken i ca 15 minutter og passer inni en biosafety kabinett (Fig. 2c,d). I frese belegg for SEM, for tynne et lag fører til dårlig gjennomføring og lading, mens for tykk et lag tilslører fine detaljer., Tykkelsen brukes til pre-belegg underlag kan være mye større enn frese belegg som vanligvis brukes for biologiske prøver, for å sikre god ledeevne, så lenge filter porene blokkeres ikke. (Fig. 2e–k, Supplerende Fig. S2).

I denne undersøkelsen har vi brukt belegg på 18 og 27 nm for Al og Au henholdsvis, siden disse tykkelser ble funnet å være tilstrekkelig til å hindre lading, som i forhold til ubestrøket filtre (Supplerende Fig. S2). Underlag med disse minste tykkelser var lett valgt fordi de var synlig som en skinnende metallisk belegg., Når belegg av mindre enn 27 nm for Au eller 18 nm for Al var til stede, og de hadde en ugjennomsiktig eller flatskjerm-hvit utseende (Fig. 2). Med ionisk væske farging ved hjelp av disse metall belagt filtre, vi var i stand til å visualisere den fine strukturelle detaljer av bakterier, slik som flagellae av Salmonella, som er 20 nm i diameter, ved SEM (Fig. 2j,k, Supplerende Fig. S3).,

resultatene som oppnås med filtrering og enkel ionisk væske infiltrasjon for SEM er svært sammenlignbare i kvalitet med de fra konvensjonelle frese belegg i SEM og negativ farging i TEM for en rekke bakterielle og virale eksemplarer, inkludert Leptospira, Salmonella, vaccinia virus og Ebola-viruset (Fig. 1, Supplerende Fig. S3–S5)7,16,31,32. Vi fant ut at det var mye mindre krymping av den ioniske væsken infiltrert bakterier og virus i forhold til både dehydrert frese belagt SEM forberedelser og TEM negative farget bilder (Tabell 1)., I alle tilfeller dimensjoner av dehydrert SEM frese-belagt og negative-farget TEM mikrober var fra 9.9% til 18,9% mindre enn den ioniske væsken behandlet prøvene (Tabell 1). I en tidligere undersøkelse vi avbildes frosne vitrified Ebola virus av cryo-elektron mikroskopi diameteren av Ebola-viruset ble målt 96 til 98 nm16 som er svært lik verdien av 98.5 ± 10.2 nm for diameteren måles på de samme prøvene som er behandlet med ionisk væske i den foreliggende studien., Dette nærmere, viser at volumene av den ioniske væsken infiltrert prøvene er sammenlignbare med de som er målt under frosne hydrert forhold og tett reflektere fullt hydrert naturlig tilstand av Ebola-viruset. For en bacilliform struktur, en 10 prosent reduksjon i mål tilsvarer 27% reduksjon i volum på grunn av dehydrering, selv om kollaps og utflating av den sylindriske formen ville innebære en enda større grad av vann tap., Det er klart fra at dette utflating og kollapse på grunn av dehydrering er til stede til en viss grad i alle de bilder av frese belagt virus og bakterier (Fig. 1).

Selv om bildene ser relativt lik, gull frese belegg ser ut til å gi litt mer kontrast enn ionisk væske. En annen observerbar forskjell er mindre av overflateruhet av bakterier cellevegger i den ioniske væsken farget bilder. Dette kan sees i bildene av Salmonella (Fig. 1, Supplerende Fig. S3)., I disse bildene er det et klart strukturert og rynkete utseende på overflaten av frese belagt bakteriell celler og et glatt utseende på cellen vegger av den ioniske væsken infiltrert forberedelser. Vi foreslår at denne observerte forskjellen er i stor grad et resultat av tap av cellen turgor på grunn av dehydrering og volum tap i frese-belagt prøver og dermed rynker kan faktisk være en artefakt eller funksjon som er fremhevet av dehydrering., Støttende bevis for dette kommer fra det faktum at andre fine strukturer, slik som flagellae, er godt synlig (og lignende utseende) i både frese-belagt og ionisk væske behandlet prøver. Dermed er resultatene av tidligere studier med frese belegg av bakterier kan ha til å være forsiktig re-fortolkes i lys av mulige dehydrering effekter.

Den ioniske væsken prosedyren som er presentert i denne undersøkelsen er rask og reproduserbar siden prøven filtre kan være utarbeidet på forhånd., Som den ioniske væsken har et svært lavt damptrykk, en ekstra fordel er at tørking artefakter som svinn, rynker eller sprekker som kan oppstå i løpet av SEM observasjon unngås (Tabell 1, Supplerende Fig. S3). I fremtiden regner vi med utvikling av en rekke forskjellige typer filter belegg for å ytterligere forbedre SEM teknikker ved hjelp av ioniske væsken farging av biologiske prøver i nanometer størrelsen.