scanning elektron mikroskop i mikrobiologi og diagnostik af infektionssygdomme

til At producere et elektrisk ledende overflade for SEM, biologiske prøver er ofte belagt hjælp af tynde film fordampning eller spruttende af carbon eller metal i et vakuum, coater, som kræver forudgående tørring af prøven. Denne belægningsproces kan skjule fine ultrastrukturelle detaljer afhængigt af tykkelsen af det aflejrede lag (normalt 2-20 nm)., Disse konventionelle procedurer er vanskelige at udføre på typisk mikrobiologiske prøver, der normalt suspensioner af små biologiske partikler i vand (<100 nm for de fleste vira, eller i sub-mm størrelsesområde for mange bakterier, svampe og parasitter). Et yderligere problem er, at mikroberne af interesse i patientprøver eller miljøprøver kan være til stede i relativt lave koncentrationer, hvilket gør observation af dem på en overflade vanskelig.,

i denne rapport beskriver vi metoder til koncentration af mikrobielle suspensioner til SEM-observation på forbelagte filtersubstrater. Vi viser, at vi i stedet for sputter-belægning, en ionisk væske (1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate) fortyndet i vand, kan bruges til hurtigt at infiltrere en mikrobiologisk SEM prøve at danne et elektron-lucent ledende overflade, som forhindrer, at prøven opladning og giver gode resultater med mikrobielle prøver (Fig. 1)., Ioniske væsker er stærkt ledende salte, der forbliver i flydende tilstand ved stuetemperatur og har et ubetydeligt damptryk (5 5 10 10-9 Torr). Under de høje vakuumforhold i en moderne sem (1 1 10 10-6 Torr) forbliver Ioniske væsker i flydende tilstand og fordampes ikke under drift, mens de stadig er ledende 19,20,21,22,23. Den mest nyttige ioniske væsker, til anvendelse i den biologiske SEM har en elektrisk ledningsevne på omkring 100 mScm−1, er elektrokemisk stabil (har en elektrokemiske vindue på omkring 5.8 V), samt at det er vandopløseligt, og er let synthesised24., Ioniske væsker med disse egenskaber har tidligere vist sig at give SEM billede kontrast sammenlignes med brugen af metal og carbon coating, når de anvendes med isolerende specimens19,25. De er også blevet brugt til makroskopisk billeddannelse af biologiske prøver, såsom tang, vævsdyrkede celler og kondenserede kromosomer20,21,22. Ledende substrater såsom indium-tin-oxid, aluminiumsfolie, eller af metal belagt coverslips har været brugt til at forhindre charging20, men disse materialer er uegnede til filtrering for SEM-undersøgelser af mikrober., Vi opdagede, at for optimale resultater ved anvendelse af ionvæske med subcellulære genstande såsom vira eller bakterielle flageller, var forudgående belægning af polykarbonatfiltre med aluminium eller guld nødvendig. Vi registrerede ikke nogen prøvedrift ved anvendelse af Ioniske væskefarvede biologiske prøver, da de blev godt understøttet af den ledende membran, der blev anvendt under den indledende filtreringsproces. SPI-pore polycarbonatfiltre er hydrofile og forbliver det efter metalbelægning, hvilket gør dem til et ideelt substrat til at arbejde med hydratiserede biologiske prøver., Ionvæskefarvning kan også udføres i et biologisk sikkerhedsskab, hvilket giver et hurtigt og sikkert alternativ til sputterbelægning ved arbejde med infektiøse prøver, da vakuumbelægningsudstyr kan forårsage aerosoler og ikke let indeholdes20,21,22. Vi har elegant løst problemet med at koncentrere prøven og forhindre opladning ved metalbelægning af selve filtersubstratet inden påføring af den biologiske prøve (fig. 2). I fravær af tynd filmcoating af prøverne var infiltration med ioniske væsker også påkrævet for at undgå opladning., Resultaterne er sammenlignelige med brugen af SEM med sputter coating og TEM ved hjælp af negativ farvningsteknik (fig 1 og 2: supplerende Fig S1–S5). Ultrafiltrering er et vigtigt skridt, da det hjælper med at fjerne snavs, der kan skjule detaljerne om vira eller bakterier, der findes i biologiske prøver. I den aktuelle rapport demonstrerer vi klar billeddannelse af vira og bakterielle flageller i ubelagte sem-prøver, som tidligere krævede dehydrering og sputter-belægning for at opnå, hvilket udvider opløsningen og rækkevidden af mikrobielle prøver, der kan undersøges med sem.,

Sammenligning af konventionelle sputter-belægning SEM prøve forberedelse metoder (paneler på venstre side) med ionisk væske behandling (center paneler) og konventionelle TEM (paneler på højre side) til observation af mikrober: (a) Leptospira biflexa, (b) Salmonella Senftenberg, (c) vaccinia og (d) Ebola-virus. SEM-billederne i venstre sidepaneler var af prøver, der var sputter belagt med guld, på almindelige ubelagte filtre., Billeder i midterpanelerne var af prøver behandlet med ionvæske efter deponering på forbelagte aluminiumsfiltre. På højre side, tem billeder af lignende prøver fremstillet under anvendelse methylamin tunolframat negativ farvning.

Forberedelse af biologiske prøver til SEM.

(a) komponenterne i filterenheden vises før montering., Det indsatte sem-billede viser et guldbelagt filter ved høj forstørrelse, før en prøve påføres. Bemærk, at filteret er rent, og at porerne er tydelige. b) filterenheden vises efter montering og brug sammen med en sprøjtepumpe i et biosikkerhedsskab (c,d). Den blå pil i (d) peger på filterenheden. (e) billeder af filtre, der har haft metal fordampet på dem. Tykkelsen af Al er 18 nm og 9 nm og Au er 27 nm og 9 nm tyk. For filteret med begge metaller er tykkelsen af Al og Au henholdsvis 18 nm og 27 nm., f) SEM og g) det tilsvarende grundstofkort, der er frembragt ved Røntgenmikroanalyse af et område svarende til det, der er fremhævet med det stiplede rektangel i litra e). (h–k) sem-billeder af Salmonella farvet med ionvæske, der illustrerer virkningen af forskellige metaltyper og tykkelse af metal inddampet på de endelige billeder (h al 9 nm, i Au 9 nm, j Al 18 nm, K Au 27 nm). Røde pile angiver flageller.

billederne af bakterier farvet med ionvæske havde en glattere overfladetopografi end dem, der blev dehydreret og sputter belagt., Størrelsesmålinger viser, at de dehydrerede prøver er krympet med ca.10-20% (tabel 1). Vi fortolker overfladedetaljerne på de dehydrerede, sputterbelagte bakterier som rynkning af cellevæggen på grund af krympning snarere end observation af yderligere funktioner, der er til stede in vivo: disse rynker er således sandsynligvis genstande på grund af tørring. Bakterielle flageller var også tydeligt synlige med ionisk væskebehandling på de ledende substrater (fig. 1, Supplerende Fig. S3). Disse resultater var sammenlignelige med dem, vi observerede med sem-sputter belægning og TEM-negativ farvning.,

Ionisk væske teknikker kan også bruges sikkert med smitsomme patogener, i en biologisk indeholdt SEM kabinettet, hvilket giver en karakterisering af nye smitstoffer i en tilstand, tættere på deres hydreret “oprindelige tilstand” end ved konventionel prøve forberedelse techniques8. I tilfælde af denne undersøgelse involverede vores konventionelle protokol dehydrering i ethanolserier, efterfulgt af lufttørring og metalcoating før sem-billeddannelse., For den ioniske væske-protokollen, den biologiske prøve havde et fald på 2,5% vandig opløsning af 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate placeres direkte på det. Efter blotting for at fjerne overskydende væske blev den våde prøve derefter anbragt direkte i SEM. Ved håndtering af infektiøse prøver er der behov for et yderligere aldehydfikseringstrin til den konventionelle procedure for at undgå risikoen for infektiøse aerosoler, der kan genereres under sputterbelægningsprocessen., Denne fiksering trin er ikke påkrævet med den ioniske væske teknik, da stikprøven kan blive behandlet i et biologisk indeslutning hood og derefter placeres direkte i en SEM i en biologisk indeholdt SEM enclosure8, for billeddannelse i en løs, hydreret tilstand, som er meget tættere på den oprindelige tilstand af organismen. Mikroskopi supplerer konventionelle diagnostiske tests, der kan gå glip af nye eller variant belastninger3, 26,27, 28 og kan hurtigt identificere den type organisme til stede, vejlede udvælgelsen af mere specifikke test29., Imidlertid kræver elektronmikroskopi normalt en minimumskoncentration af partikler til pålidelig identifikation af mikrober. For vira er dette mellem 105 til 106 viruspartikler / mL4,5. Med filtreringsteknikker kan både tem og SEM af vira udføres med så lidt som 5000 partikler pr.prøvea7.

Ionvæskefarvning på forbelagte filtre er bredt anvendelig til enhver biologisk prøve, der kan drage fordel af filtrering for at koncentrere partikler af interesse., Anvendelsen af metalbelagte filtre med mere end coatingn type belægning på forskellige områder gør det muligt at vælge, hvilken af disse belægninger, der giver de optimale resultater for at observere en bestemt prøve eller specifikke funktioner og hjælper med at spare tid (fig. 2a, e-k). For eksempel viste bakterielle flageller efter ionvæskefarvning lysere mod det al-belagte substrat, mens kontrasten på det Au-belagte område af filteret vendes, og flagellerne optrådte mørkere (fig. 2h-k)., Tilsvarende billeder af Ebola-virus og Leptospira biflexa viste god kvalitet topografiske detaljer, når afbildet med en aluminium-coated filter, men det biologiske materiale havde mindre detalje, og viste sig som en mørk fladskærms silhuet, når der er optaget på guld belagt filtre (Supplerende Figner, S4 og S5). Vi foreslår, at dette skyldes det højere sekundære elektronemissionssignal fra Au sammenlignet med Al. I denne undersøgelse indsamlede vi sem-billeder med den sekundære elektrondetektor, som oftest bruges til rutinemæssig billeddannelse med biologiske prøver., I SEM er den sekundære elektronemissionskoefficient ()) relativt konstant uanset atomnummer. Men en undtagelse er med Au, for hvilke is er næsten det dobbelte af Al og mange andre elementer. Værdien af δ påvirkes også af stråleenergi: ved 20 kV er 0.1 0,1 for Al og 0,2 for Au30. Ved at måle intensiteten i sekundære elektronbilleder taget ved 4 kV med både Al og Au i samme billede (Fig. 2f), beregnede vi signalet fra Au til at være 2,1 gange intensiteten af Al, hvilket er tæt på det forventede teoretisk., Med billederne optaget af prøver på de guldbelagte filtre fortolker vi resultaterne som at producere for meget kontrast fra baggrundssubstratet, som havde tendens til at skjule fine detaljer såsom flageller, der fremstår som en “silhuetter” på en lys baggrund. Imidlertid har den ioniske væske infiltrerede mikrober og det aluminiumbelagte filter lignende emissionskoefficienter, således at kontrasten i vid udstrækning skyldes topografien snarere end forskellene i materialesammensætning, hvilket gør det muligt at se flere fine detaljer.,

forbelægning af filtre med metal påvirkede ikke porestørrelserne eller filtreringskapaciteten (fig. 2). Hele ionvæskefarvningsprotokollen kan udføres på en standard laboratoriebænk på cirka 15 minutter og passer ind i et biosikkerhedsskab (fig. 2c, d). Ved sputterbelægning til SEM forårsager et for tyndt lag dårlig ledning og opladning, mens et for tykt lag skjuler fine detaljer., Tykkelsen, der anvendes til forbelægning af substraterne, kan være meget større end sputterbelægninger, der typisk anvendes til biologiske prøver, for at sikre god ledningsevne, så længe filterporerne ikke er blokeret. (Fig. 2e-k, supplerende Fig. S2).

i denne undersøgelse anvendte vi belægninger på henholdsvis 18 og 27 nm for al og Au, da disse tykkelser viste sig at være tilstrækkelige til at forhindre opladning sammenlignet med ubelagte filtre (supplerende fig. S2). Substrater med disse mindste tykkelser blev let valgt, da de var synlige som en skinnende metallisk belægning., Når belægninger på mindre end 27 nm for Au eller 18 nm for Al var til Stede, havde de et uigennemsigtigt eller fladhvidt udseende (fig. 2). Med ionvæskefarvning ved hjælp af disse metalbelagte filtre var vi i stand til at visualisere de fine strukturelle detaljer af bakterier, såsom Salmonellas flageller, som er 20 nm i diameter, af SEM (fig. 2j, k, supplerende Fig. S3).,

De resultater, der er opnået med filtrering og enkel ionisk væske infiltration for SEM er meget sammenlignelig kvalitet med dem fra konventionelle sputter-belægning i SEM og negativ farvning i TEM for en bred vifte af bakterielle og virale prøver, herunder Leptospira, Salmonella, vaccinia virus og Ebola-virus (Fig. 1, Supplerende Fig. S3–S5)7,16,31,32. Vi fandt ud af, at der var meget mindre krympning af den ioniske væske infiltrerede bakterier og vira sammenlignet med både de dehydrerede sputter-coatede SEM-præparater og de tem negative farvede billeder (tabel 1)., I alle tilfælde dimensioner af dehydreret SEM sputter-belægning og negative-farvet TEM mikrober var fra 9,9% til 18,9% mindre end den ioniske væske behandlede prøver (Tabel 1). I en tidligere undersøgelse, vi filmede frosne-forglasset Ebola-virus ved cryo-elektron mikroskopi diameteren af Ebola-virus blev målt som 96-98 nm16, som er meget lig den værdi 98,5 ± 10.2 nm i diameter, der måles i de samme enheder, der er behandlet med ionisk væske i den foreliggende undersøgelse., Dette viser endvidere, at mængderne af de ioniske væskeinfiltrerede prøver er sammenlignelige med dem, der måles under frosne hydratiserede betingelser og nøje afspejler den fuldt hydratiserede native tilstand af Ebolavirus. For en bacilliform struktur, en 10 pct. reduktion i dimensioner svarer til en 27% reduktion i volumen på grund af dehydrering, selvom sammenbrud og udfladning af den cylindriske form, ville indebære en endnu større grad af vand tab., Det fremgår klart af, at denne udfladning og sammenbrud på grund af dehydrering til en vis grad er til stede i alle billeder af sputter-coatede vira og bakterier (fig. 1).

selvom billederne forekommer relativt ens, ser guldsputter belægning ud til at give lidt mere kontrast end ionisk væske. En anden observerbar forskel er mindre overfladeruhed af bakteriecellevæggene i de ioniske flydende farvede billeder. Dette kan ses på billederne af Salmonella (Fig. 1, Supplerende Fig. S3)., I disse billeder er der et klart struktureret og rynket udseende på overfladen af de sputterbelagte bakterieceller og et glat udseende på cellevæggene i den ioniske væske infiltrerede præparater. Vi foreslår, at denne observerede forskel stort set er resultatet af tab af celleturgor på grund af dehydrering og volumentab i de sputter-coatede prøver, og at rynkerne således faktisk kan være en artefakt eller funktion, der fremhæves af dehydrering., Understøttende bevis for dette kommer fra det faktum, at andre fine strukturer, såsom flageller, er tydeligt synlige (og af lignende udseende) i både de sputter-coatede og Ioniske væskebehandlede prøver. Således kan resultaterne af tidligere undersøgelser, der anvender sputter coating af bakterier, være nødt til at fortolkes forsigtigt i lyset af mulige dehydreringseffekter.

den ioniske væskeprocedure, der præsenteres i denne undersøgelse, er hurtig og reproducerbar, da prøvefiltre kan fremstilles på forhånd., Da den ioniske væske har et meget lavt damptryk, er en ekstra fordel, at tørringsgenstande såsom krympning, rynker eller revner, der kan forekomme under sem-observation, undgås (tabel 1, supplerende fig. S3). I fremtiden forventer vi udviklingen af en række forskellige typer filterbelægninger for yderligere at forbedre SEM-teknikker ved hjælp af ionvæskefarvning til biologiske prøver i nanometerstørrelsesområdet.