de scanning-elektronenmicroscoop in de microbiologie en diagnose van infectieziekten

om een elektrisch geleidend oppervlak voor SEM te produceren, worden biologische specimens vaak gecoat met behulp van dunne-filmverdamping of sputteren van koolstof of metaal in een vacuüm coater, hetgeen voorafgaande dehydratie van het specimen vereist. Dit coatingproces kan fijne ultrastructurele details verduisteren, afhankelijk van de dikte van de laag afgezet (meestal 2-20 nm)., Deze conventionele procedures zijn moeilijk uit te voeren op typische microbiologische specimens, die meestal suspensies zijn van kleine biologische deeltjes in water (<100 nm voor de meeste virussen, of in de submicrometer voor veel bacteriën, schimmels en parasieten). Een bijkomend probleem is dat de microben van belang in geduldige specimens of milieusteekproeven in vrij lage concentraties aanwezig kunnen zijn, makend observatie van hen op een oppervlakte moeilijk.,

in dit rapport beschrijven we methoden voor het concentreren van microbiële suspensies voor sem-observatie op voorgecoate filtersubstraten. Wij tonen aan dat, in plaats van sputtercoating, een ionische vloeistof (1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroboraat), verdund in water, kan worden gebruikt om snel een microbiologisch sem-monster te infiltreren, waardoor een elektron-lucent geleidend oppervlak ontstaat, dat het laden van de monsters voorkomt en goede resultaten geeft met microbiële monsters (Fig. 1)., Ionische vloeistoffen zijn sterk geleidende zouten die bij kamertemperatuur in vloeibare toestand blijven en een verwaarloosbare dampspanning hebben (≤5 × 10-9 Torr). Onder de hoogvacuümomstandigheden van een moderne SEM (≤1 × 10-6 Torr) blijven Ionische vloeistoffen in vloeibare toestand en verdampen ze niet tijdens het bedrijf, terwijl ze nog steeds geleidend zijn19,20,21,22,23. De meest bruikbare Ionische vloeistoffen voor toepassingen in biologische SEM hebben een elektrische geleidbaarheid van ongeveer 100 mScm-1, zijn elektrochemisch stabiel (met een elektrochemisch venster van ongeveer 5,8 V), evenals wateroplosbaar en zijn gemakkelijk gesynthetiseerd24., Ionische vloeistoffen met deze eigenschappen hebben eerder aangetoond dat ze SEM-beeldcontrast geven, vergelijkbaar met het gebruik van metaal en koolstofcoating bij gebruik met isolerende specimen19,25. Zij zijn ook gebruikt voor macroscopische weergave van biologische specimens, zoals zeewier,Weefsel gekweekte cellen en gecondenseerde chromosomen 20,21, 22. Geleidende substraten zoals indium-tin oxide, aluminiumfolie, of metaal met een laag bedekte coverslips zijn gebruikt om charging 20 te verhinderen, echter, zijn deze materialen ongeschikt voor filtratie voor SEM-onderzoeken van microben., We ontdekten dat Voor een optimaal resultaat met ionische vloeistof met subcellulaire objecten zoals virussen of bacteriële flagellae, een voorafgaande coating van polycarbonaatfilters met aluminium of goud noodzakelijk was. Wij hebben geen specimendrift ontdekt bij het gebruik van ionische vloeibare bevlekte biologische specimens, aangezien zij goed door het geleidende membraan werden gesteund dat tijdens het aanvankelijke filtratieproces werd gebruikt. De SPI-pore polycarbonaat filters zijn hydrofiel en blijven zo na metalen coating, waardoor ze een ideaal substraat zijn om te werken met gehydrateerde biologische monsters., Ionische vloeibare kleuring kan ook worden uitgevoerd binnen een biologisch veiligheidskabinet, die een snel en veilig alternatief bieden voor sputtercoating bij het werken met infectieuze monsters,aangezien vacuümcoatingapparatuur aerosolen kan veroorzaken en niet gemakkelijk 20,21, 22 bevat. Wij hebben het probleem van het concentreren van het monster en het voorkomen van opladen elegant opgelost door het filtersubstraat zelf met metaal te coaten alvorens het biologische monster aan te brengen (Fig. 2). Bij afwezigheid van een dunne laag coating van de monsters was infiltratie met ionische vloeistoffen ook nodig om opladen te voorkomen., De resultaten zijn vergelijkbaar met het gebruik van SEM met sputtercoating en tem met negatieve kleuringtechniek (Fig.1 en 2: Aanvullende Fig. S1–S5). De ultrafiltratie is een belangrijke stap aangezien het helpt om puin te verwijderen dat de details van virussen of bacteriën huidig in biologische steekproeven kan verduisteren. In het huidige rapport demonstreren we een heldere beeldvorming van virussen en bacteriële flagellae in ongecoate sem-specimens, die voorheen dehydratie en sputtercoating nodig hadden om te bereiken, waardoor de resolutie en het bereik van microbiële monsters die met SEM kunnen worden onderzocht, werden uitgebreid.,

de Vergelijking van conventionele sputteren coating SEM bereiding van het monster methoden (panelen aan de linkerkant) met ionische vloeistof behandeling (centrum panelen) en conventionele TEM (panelen aan de rechterkant) voor de waarneming van microben: (a) Leptospira biflexa, (b) Salmonella Senftenberg, (c) vaccinia en (d) Ebola-virus. De SEM beelden in de linker zijpanelen waren van exemplaren die waren sputter gecoat met goud, op gewone ongecoate filters., Beelden in de middenpanelen waren van monsters die met ionische vloeistof werden behandeld na afzetting op voorgecoate aluminiumfilters. Aan de rechterkant, TEM beelden van soortgelijke monsters bereid met behulp van methylamine tungstate negatieve kleuring.

bereiding van biologische monsters voor SEM.

(a) de onderdelen van de filtereenheid worden vóór de montage getoond., De inset SEM afbeelding toont een goud gecoat filter bij hoge vergroting voordat een specimen wordt toegepast. Merk op dat het filter schoon is en de poriën duidelijk zichtbaar zijn. b) de filtereenheid wordt getoond na montage en in gebruik met een spuitpomp in een bioveiligheidskast (c,d). De blauwe pijl in (d) wijst naar de filtereenheid. e) afbeeldingen van filters waarbij metaal is verdampt. De dikte van de Al is 18 nm en 9 nm en de Au is 27 nm en 9 nm dik. Voor het filter met beide metalen is de dikte van de Al en Au respectievelijk 18 nm en 27 nm., f) SEM en g) de overeenkomstige elementaire kaart die door röntgenmicroanalyse wordt gegenereerd van een gebied dat vergelijkbaar is met het gebied dat wordt gemarkeerd door de gestippelde rechthoek onder e). (h–k) SEM-beelden van Salmonella gekleurd met ionische vloeistof, die het effect van verschillende soorten metaal en de dikte van het metaal verdampt op de uiteindelijke opgenomen beelden illustreren (h al 9 nm, I Au 9 nm, j al 18 nm, k Au 27 nm). Rode pijlen geven flagellae aan.

De beelden van bacteriën die gekleurd zijn met ionische vloeistof hadden een gladdere oppervlaktetopografie dan die welke gedehydrateerd en met sputteren bedekt waren., Uit groottemetingen blijkt dat de gedehydrateerde monsters met ongeveer 10-20% zijn gekrompen (Tabel 1). We interpreteren de oppervlaktedetail op de uitgedroogde, met sputtercoating bedekte bacteriën als rimpels van de celwand door krimp, in plaats van observatie van extra functies die in vivo aanwezig zijn: deze rimpels zijn dus waarschijnlijk artefacten als gevolg van drogen. Bacteriële flagellae waren ook duidelijk zichtbaar bij Ionische vloeistofbehandeling op de geleidende substraten (Fig. 1, Aanvullende Fig. S3). Deze resultaten waren vergelijkbaar met die we waargenomen met SEM-sputter coating en tem-negatieve kleuring.,

Ionische vloeistoftechnieken kunnen ook veilig worden gebruikt met infectieuze pathogenen, in een biologisch gesloten sem-behuizing, waardoor nieuwe infectieuze agentia kunnen worden gekarakteriseerd in een toestand die dichter bij hun gehydrateerde “native state” ligt dan met conventionele monstervoorbereidingstechniek8. In het geval van dit onderzoek omvatte ons conventionele protocol dehydratie in ethanolseries, gevolgd door luchtdroging en metaalcoating vóór sem imaging., Voor het ionisch vloeibaar protocol werd in het biologische monster een druppel van een 2,5% waterige oplossing van 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluorboraat direct op het monster geplaatst. Na het bevlekken om overtollig vocht te verwijderen werd het natte Monster vervolgens direct in de SEM geplaatst. Bij de behandeling van infectieuze monsters is een aanvullende aldehydefixatiestap nodig voor de conventionele procedure om het risico van infectieuze aërosolen te vermijden die tijdens het sputtercoatingproces kunnen worden gegenereerd., Deze fixatiestap is niet vereist met de Ionische vloeibare techniek, aangezien het monster in een biologische insluitingskap kan worden verwerkt en vervolgens direct in een sem in een biologisch ingesloten sem-enclosure8 kan worden geplaatst, voor weergave in een ongefixeerde, gehydrateerde staat, die veel dichter bij de oorspronkelijke staat van het organisme is. De microscopie vult conventionele diagnostische tests aan die nieuwe of variant strains3,26,27,28 kunnen missen en het type organisme dat aanwezig is snel kunnen identificeren, die de selectie van specifiekere tests29 leiden., Nochtans, vereist de elektronenmicroscopie gewoonlijk een minimumconcentratie van deeltjes voor betrouwbare identificatie van microben. Voor virussen ligt dit tussen 105 en 106 virusdeeltjes/mL4,5. Met filtratietechnieken kunnen zowel tem als SEM van virussen worden uitgevoerd met slechts 5000 deeltjes per monster7.

Ionische vloeistofkleuring op voorgecoate filters is algemeen toepasbaar op elk biologisch monster dat baat kan hebben bij filtratie om belangrijke deeltjes te concentreren., Het gebruik van met metaal beklede filters met meer dan één soort coating op verschillende gebieden maakt de keuze mogelijk van welke van deze coatings de optimale resultaten oplevert voor het observeren van een bepaald specimen of specifieke kenmerken en helpt tijd te besparen (Fig. 2a, e-k). Bijvoorbeeld, na ionische vloeistof kleuring bacteriële flagellae bleek helderder tegen de al-coated substraat, terwijl op de Au-coated gebied van het filter het contrast wordt omgekeerd en de flagellae bleek donkerder (Fig. 2h-k)., Ook de beelden van Ebola virus en Leptospira biflexa toonden goede kwaliteit topografische detail wanneer afgebeeld met een aluminium gecoate filter, maar het biologische materiaal had minder detail en verscheen als een donker plat silhouet wanneer afgebeeld op goud gecoate filters (aanvullende vijgen S4 en S5). Wij stellen voor dat dit te wijten is aan het hogere secundaire elektronenemissiesignaal van Au in vergelijking met Al. In dit onderzoek hebben we SEM-beelden verzameld met de secundaire elektronendetector, die het meest wordt gebruikt voor routinematige beeldvorming met biologische specimens., In SEM is de secundaire elektronenemissiecoëfficiënt (δ) relatief constant, ongeacht het atoomnummer. Een uitzondering is echter voor ae, waarvoor δ bijna tweemaal zo groot is als voor Al en vele andere elementen. De waarde δ wordt ook beïnvloed door de stralingsenergie: bij 20 kV is δ 0,1 voor Al en 0,2 voor Au30. Door het meten van de intensiteit in secundaire elektronenbeelden genomen bij 4 kV met zowel Al als Au in hetzelfde beeld (Fig. 2f), hebben we berekend dat het signaal van de Au 2,1 keer de intensiteit van de Al is, wat dicht bij de theoretisch verwachte intensiteit ligt., Met de beelden van specimens op de met goud beklede filters, interpreteren we de resultaten als het produceren van te veel contrast van de achtergrond substraat, die de neiging om fijne details zoals flagellae die verschijnen als een “silhouetten” op een heldere achtergrond te verduisteren. Nochtans, hebben de ionische vloeistof geïnfiltreerde microben en het aluminium met een laag bedekte filter, gelijkaardige emissiecoëfficiënten, dus is het contrast grotendeels toe te schrijven aan de topografie eerder dan de verschillen in materiaalsamenstelling, toestaand meer fijne details om te worden gezien.,

Voorcoating van de filters met metaal had geen invloed op de poriegrootte of de filtratiecapaciteit van de filters (Fig. 2). Het volledige Ionische vloeibare het bevlekken protocol kan op een standaardlaboratoriumbank in ongeveer 15 minuten worden uitgevoerd en past binnen een biosafety kabinet (Fig. 2c, d). Bij sputtercoating voor SEM veroorzaakt een te dunne laag slechte geleiding en opladen, terwijl een te dikke laag fijne details verduistert., De dikte die wordt gebruikt voor het voorcoaten van de substraten kan veel groter zijn dan sputtercoatings die typisch worden gebruikt voor biologische specimens, om een goede geleidbaarheid te garanderen, zolang de filterporiën niet worden geblokkeerd. (Fig. 2e-k, aanvullende Fig. S2).

in dit onderzoek hebben we coatings van 18 en 27 nm gebruikt voor respectievelijk Al en Au, omdat deze diktes voldoende bleken te zijn om het laden te voorkomen, in vergelijking met ongecoate filters (aanvullende Fig. S2). Substraten met deze minimale diktes konden gemakkelijk worden geselecteerd omdat ze zichtbaar waren als een glanzende metallic coating., Wanneer coatings van minder dan 27 nm Voor ae of 18 nm voor de Al aanwezig waren, hadden ze een ondoorzichtig of vlakwit uiterlijk (Fig. 2). Met ionische vloeibare kleuring met behulp van deze met metaal beklede filters, waren we in staat om de fijne structurele details van bacteriën, zoals de flagellae van Salmonella, die 20 nm in diameter, door SEM visualiseren (Fig . 2j, k, aanvullende Fig. S3).,

de resultaten verkregen met filtratie en eenvoudige Ionische vloeistofinfiltratie voor SEM zijn qua kwaliteit zeer vergelijkbaar met die van conventionele sputtercoating in SEM en negatieve kleuring in TEM voor een verscheidenheid aan bacteriële en virale specimens, waaronder Leptospira, Salmonella, vacciniavirus en ebolavirus (Fig. 1, Aanvullende Fig. S3–S5) 7,16,31,32. We vonden dat er veel minder krimp van de ionische vloeistof geïnfiltreerd bacteriën en virussen in vergelijking met zowel de gedehydrateerde sputter gecoate sem preparaten en de tem negatief gekleurde beelden (Tabel 1)., In alle gevallen waren de afmetingen van de gedehydrateerde SEM-microben met sputteren en negatief gekleurde TEM-microben van 9,9% tot 18,9% kleiner dan de met ionische vloeistof behandelde monsters (Tabel 1). In een eerder onderzoek hebben we met behulp van cryo-elektronenmicroscopie de diameter van het ebolavirus gemeten als 96-98 nm16, wat sterk lijkt op de waarde van 98,5 ± 10,2 nm voor de diameter gemeten bij dezelfde monsters die in dit onderzoek met ionische vloeistof zijn behandeld., Dit toont verder aan dat de volumes van de door ionische vloeistof geïnfiltreerde monsters vergelijkbaar zijn met de volumes gemeten onder bevroren gehydrateerde omstandigheden en nauw aansluiten bij de volledig gehydrateerde oorspronkelijke toestand van het ebolavirus. Voor een bacilliforme structuur is een vermindering van 10% in afmetingen gelijk aan een vermindering van 27% in volume als gevolg van dehydratatie, hoewel ineenstorting en afvlakking van de cilindrische vorm een nog grotere mate van waterverlies zou impliceren., Het is duidelijk uit dat deze afvlakking en ineenstorting als gevolg van uitdroging tot op zekere hoogte aanwezig is in alle beelden van sputter gecoate virussen en bacteriën (Fig. 1).

hoewel de afbeeldingen relatief vergelijkbaar lijken, lijkt de goudsputtercoating iets meer contrast te geven dan de ionische vloeistof. Een ander waarneembaar verschil is minder oppervlakteruwheid van de bacteriële celwanden in de ionische vloeistof bevlekte beelden. Dit is te zien in de beelden van Salmonella (Fig. 1, Aanvullende Fig. S3)., In deze beelden is er een duidelijk gestructureerd en gerimpeld uiterlijk op het oppervlak van de sputter gecoate bacteriële cellen en een glad uiterlijk op de celwanden van de ionische vloeistof geïnfiltreerde preparaten. Wij stellen voor dat dit waargenomen verschil grotendeels het resultaat is van verlies van cel turgor toe te schrijven aan uitdroging en volumeverlies in de sputter-met een laag bedekte specimens en zo kunnen de rimpels eigenlijk een artefact of functie zijn die door uitdroging wordt geaccentueerd., Dit wordt onderbouwd door het feit dat andere fijne structuren, zoals flagellae, duidelijk zichtbaar zijn (en er vergelijkbaar uitzien) in zowel de met sputteren beklede als de met ionische vloeistof behandelde monsters. Daarom kunnen de resultaten van eerdere studies met sputtercoating van bacteriën met voorzichtigheid opnieuw moeten worden geïnterpreteerd in het licht van mogelijke dehydratie-effecten.

de Ionische vloeistofprocedure die in dit onderzoek wordt beschreven, is snel en reproduceerbaar, aangezien preparaatfilters vooraf kunnen worden bereid., Aangezien de ionische vloeistof een zeer lage dampspanning heeft, is een bijkomend voordeel dat het drogen van artefacten zoals krimp, rimpels of scheuren die tijdens sem-observatie kunnen optreden, wordt vermeden (Tabel 1, Aanvullende Fig. S3). In de toekomst anticiperen we op de ontwikkeling van een verscheidenheid aan verschillende soorten filtercoatings om SEM-technieken verder te verbeteren met behulp van ionische vloeistofkleuring voor biologische specimens in het nanometerbereik.