微生物学および感染症の診断における走査型電子顕微鏡

SEM用の導電性表面を作製するために、生体試料は、多くの場合、真空コーター中で炭素または金属の薄膜蒸発またはスパッタリングを用いてコーティングされ、試料の事前脱水が必要である。 このコーティングプロセスは、堆積した層の厚さ（通常は2-20nm）に応じて、微細な超微細構造詳細を不明瞭にする可能性があります。, これらの従来の手順は、通常、水中の小さな生物学的粒子の懸濁液である典型的な微生物学的標本（<ほとんどのウイルスでは100nm、または多くの細菌、真菌および寄生虫ではサブマイクロメートルサイズの範囲）で実行することが困難である。 さらなる問題は、患者標本または環境試料中の関心のある微生物が比較的低い濃度で存在し、表面上でのそれらの観察を困難にすることである。,

ここでは、プレコートフィルター基板上にＳＥＭ観察のための微生物懸濁液を濃縮するための方法について説明します。 我々は、代わりにスパッタコーティングの、イオン液体（1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸）水に希釈し、急速に試料充電を防止し、微生物試料（図）で良好な結果を与える電子ルーセント導電性表面を形成し、微生物学的SEMサンプルに浸透するために使用することができることを示している。 1)., イオン液体は、室温で液体状態にとどまり、無視できる蒸気圧（≤5×10-9Torr）を有する高導電性塩である。 現代のSEM（≤1×10-6Torr）の高真空条件下では、イオン液体は液体状態のままであり、運転中に蒸発しないが、19、20、21、22、23である。 生物学的SEMの適用のための最も有用なイオン液体におよそ100mScm−1の電気伝導率があり、電気化学的に安定しています（およそ5.8vの電気化学の窓を持っています）、また水溶性であり、そして容易に総合されます24。, これらの特性を有するイオン液体は、絶縁試料と共に使用する場合、金属および炭素コーティングの使用に匹敵するSEM画像コントラストを与えること それらはまた海藻、ティッシュ培養された細胞および凝縮させた染色体20、21、22のような生物的標本の巨視的なイメージ投射のために、使用されました。 インジウム錫酸化物、アルミホイル、または金属によって塗られるカバースリップのような伝導性の基質が帯電を防ぐのに使用されていました20しかし、これらの材料は微生物のSEMの調査のためのろ過に不適当です。, ウイルスや細菌の鞭毛などの細胞内物体を有するイオン液体を用いて最適な結果を得るためには、ポリカーボネートフィルターにアルミニウムまたは金 イオン液体染色生物試料を用いた場合，初期ろ過プロセス中に用いた導電膜によってよく支持されているため，試料ドリフトは検出されなかった。 SPI気孔のポリカーボネートフィルターは親水性、それらに水和させた生物的サンプルを使用するために理想的な基質をする金属のコーティングの後でそう, イオン液体染色は生物学的安全キャビネット内でも行うことができ、真空コーティング装置はエアロゾルを引き起こす可能性があり、20、21、22を容易に 生体試料を塗布する前にフィルタ基板自体を金属コーティングすることにより、試料を濃縮し、帯電を防止するという問題を優雅に解決しました（図。 2). 試料の薄膜コーティングがない場合，帯電を避けるためにイオン液体による浸潤も必要であった。, 結果は否定的な汚損の技術を使用して放出させるコーティングおよびTEMのSEMの使用と対等である（イチジク1および2:補足のイチジクS1-S5）。 超ろ過は生物的サンプルで現在のウイルスまたは細菌の細部を不明瞭にすることができる残骸を取除くのを助けるので重要なステップです。 現在のレポートでは、我々はこのように解像度とSEMで調べることができる微生物サンプルの範囲を拡張し、以前に達成するために脱水とスパッタコーティ,

微生物観察のための従来のスパッタコーティングSEM試料調製法（左側のパネル）とイオン液体処理（中央のパネル）と従来のTEM（右側のパネル）の比較：(a)レプトスピラｂｉｆｌｅｘａ、（ｂ）ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ、（ｃ）ワクシニアおよび（ｄ）エボラウイルス。 左側のパネルのＳＥＭ像は，金でコーティングされたスパッタ試料であった。, 画像のセンターパネルの試料処理とイオン液体膜前アルミニウム塗装する事が出来ます。 右側には、タングステン酸メチルアミン陰性染色を用いて調製した同様の試料のTEM画像があります。

SEMのための生物学的試料の調製。

（a）フィルターユニットの部品はアセンブリの前に示されています。, 差込みSEMのイメージは標本が応用である前に高い拡大で金によって塗られるフィルターを示す。 このフィルターはクリーンの孔が明確である。 (b)フィルタユニットは組み立て後、利用シリンジポンプバイオセーフティキャビネット(c,d)。 （D）の青い矢印は、フィルタユニットを指します。 (e)金属が蒸発したフィルターの画像。 Alの厚さは18nmおよび9nmであり、Auは27nmおよび9nmの厚さである。 両方の金属が付いているフィルターのためにAlおよびAuの厚さはそれぞれ18nmおよび27nmである。, （ｆ）ＳＥＭおよび（ｇ）（ｅ）における点線の矩形によって強調表示されたものと同様の領域のＸ線微小分析によって生成された対応する元素マップ。 （h–k）イオン液体で染色されたサルモネラのSEM画像は、記録された最終画像（h Al9nm、I Au9nm、j Al18nm、k Au27nm）に蒸発した金属の異なる金属タイプ 赤い矢印は鞭毛を示します。

イオン液体で染色された細菌の画像は、脱水およびスパッタコーティングされたものよりも滑らかな表面トポグラフィーを有していた。, サイズ測定により、脱水試料は約10-20パーセント縮小したことが示されています（表1）。 我々は、脱水されたスパッタコーティングされた細菌の表面の詳細を、in vivoに存在する追加の特徴の観察ではなく、収縮による細胞壁のしわと解釈します。 また、導電性基板上にイオン液体処理を施すことにより、細菌の鞭毛もはっきりと見えた（Fig. 図1に示す補足図。 S3）。 これらの結果はＳＥＭスパッタコーティングおよびＴＥＭ陰性染色で観察した結果と同等であった。,

イオン液体技術は、生物学的に含まれるSEMエンクロージャ内の感染性病原体にも安全に使用でき、従来の試料調製技術8よりも水和した”ネイティブ状態”に近い状態で新しい感染性病原体の特性を特徴付けることができる。 この調査の場合，従来のプロトコルはエタノールシリーズでの脱水，その後の空気乾燥とＳＥＭイメージング前の金属コーティングであった。, イオン液体プロトコルのために、生物学的試料は、その上に直接置かれた2.5％の1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の水溶液の滴 過剰な流体を除去するためにブロッティングした後、湿ったサンプルをＳＥＭに直接置いた。 感染性サンプルを扱う場合、スパッタコーティングプロセス中に発生する可能性のある感染性エアロゾルのリスクを回避するために、従来の手順では、追加のアルデヒド固定ステップが必要です。, この固定ステップはイオン液体の技術とサンプルが生物的封じ込めのフードで処理することができ、次に生物学的に含まれていたSEM enclosure8のSEMに直接置くことができるので、有機体の本来の状態に大いにより近い固定されていない、水和させた状態のイメージ投射のために要求されない。 顕微鏡検査は新しいか変形のstrains3、26、27、28を逃すことができ、急速に特定のtests29の選択を導く有機体のタイプを識別できる慣習的な診断試験を補足, しかしながら、電子顕微鏡は、通常、微生物の信頼できる同定のために粒子の最小濃度を必要とする。 ウイルスの場合、これは105から106のウイルス粒子/mL4,5の間である。 ろ過技術を使うと、ウイルスのTEMそしてSEMは両方試料ごとの5000の粒子少しによって遂行することができます7。プレコートフィルター上のイオン液体染色は、関心のある粒子を濃縮するために濾過から利益を得ることができる任意の生物学的試料に広く適用可能, 異なる領域に複数のタイプのコーティングを施した金属コーティングフィルターを使用することにより、これらのコーティングのいずれかを選択すること 2a、e-k）。 例えば、イオン液体染色後、細菌の鞭毛はAl被覆基質に対して明るく現れ、フィルターのAu被覆領域ではコントラストが逆転し、鞭毛はより暗く現れた（Fig. 2h-k）。, 同様に、エボラウイルスとLeptospira biflexaの画像は、アルミニウムコーティングされたフィルターで画像化すると良質の地形の詳細を示したが、生物学的材料はあまり これはＡｌに比べてＡｕからのより高い二次電子放出信号によるものであることを提案した。 本研究では，生体試料を用いたルーチンイメージングに最も一般的に使用される二次電子検出器を用いてＳＥＭ画像を収集した。, ＳＥＭでは、二次電子放出係数（δ）は原子番号に関係なく比較的一定である。 しかし、Auの場合は例外であり、δはAlおよび他の多くの元素のほぼ倍である。 Δの値はビームエネルギーによっても影響されます：20kVでは、δはAlで0.1、Auで0.2です30。 AlとAuの両方を同じ画像にして4kVで撮影した二次電子像の強度を測定することにより（Fig. 2f)では、Auからの信号をalの2.1倍の強度と計算しましたが、これは理論的に予想されるものに近いものです。, 金コーティングされたフィルタ上に標本の画像を記録したところ，結果は背景substrateからあまりにも多くのコントラストを生成していると解釈され，明るい背景に”シルエット”として現れる鞭毛のような細かい細部を不明瞭にする傾向があった。 しかし、イオン液体浸潤微生物とアルミニウムコーティングフィルターは、同様の放出係数を有するため、コントラストは材料組成の違いではなく地形によるものであり、より細かい細部を見ることができる。,

金属によるフィルターのプレコーティングは、フィルターの孔径または濾過能力に影響を与えなかった（図。 2). イオン液体染色プロトコル全体は、標準的な実験室ベンチで約15分で実施することができ、バイオセーフティキャビネット内に収まる（Fig. 2c、d）。 ＳＥＭ用スパッタコーティングでは，層が薄すぎると伝導および帯電が悪くなり，層が厚すぎると細部が不明瞭になる。, 基材のプレコーティングに使用される厚さは、フィルター孔が塞がれていない限り、良好な導電性を確保するために、生物学的試料に通常使用されるスパ （図。 2e-k、補足図。 S2）。

この調査では、これらの厚さがコーティングされていないフィルターと比較して充電を防止するのに十分であることが判明したため、AlおよびAuにそれぞれ18および27nmのコーティングを使用した（補足図）。 S2）。 これらの最小厚さを有する基板は、光沢のある金属コーティングとして見えるので、容易に選択された。, Auでは27nm未満、Alでは18nm未満のコーティングが存在する場合、それらは不透明または平らな白色の外観を有していた（図。 2). これらの金属コーティングフィルターを用いたイオン液体染色により、直径20nmのサルモネラ菌の鞭毛などの細かい構造の詳細をSEMにより可視化することができた(Fig. 2j、k、補足図。 S3）。,

SEMのろ過および単純なイオン液体浸潤によって得られた結果は、レプトスピラ、サルモネラ、ワクシニアウイルスおよびエボラウイルスを含む様々な細菌およびウイルス標本について、SEMにおける従来のスパッタコーティングおよびTEMにおける陰性染色から得られた結果と品質において非常に匹敵する。 図1に示す補足図。 S3-S5)7,16,31,32. 脱水スパッタコーティングSEM製剤とTEMネガ染色画像の両方に比べて、イオン液体浸潤細菌およびウイルスの収縮がはるかに少ないことがわかった（表1）。, すべての場合において、脱水SEMスパッタコーティングおよびネガティブ染色TEM微生物の寸法は、イオン液体処理試料よりも9.9％から18.9％小さかった（表1）。 以前の調査では、エボラウイルスの直径は96-98nm16として測定され、本研究ではイオン液体で処理した同じ試料の直径の98.5±10.2nmの値と非常に, これはさらに，イオン液体浸潤試料の体積が凍結水和条件下で測定されたものと同等であり，エボラウイルスの完全水和ネイティブ状態を密接に反映していることを示している。 Bacilliform構造の場合、寸法の10％の減少は、脱水による体積の27％の減少と同等であるが、円筒形の崩壊および平tening化は、さらに大きな程度の水損失を意味する。, この脱水による平tening化および崩壊は、スパッタ被覆ウイルスおよび細菌のすべての画像にある程度存在することから明らかである（Fig. 1).

画像は比較的類似しているが、金スパッタコーティングはイオン液体よりもわずかにコントラストを与えるように見える。 別の観察可能な違いは、イオン液体染色画像における細菌細胞壁の表面roughnessさの少ないことである。 これは、サルモネラ菌の画像で見ることができます（Fig. 図1に示す補足図。 S3）。, これらの画像では、スパッタコーティングされた細菌細胞の表面に明確なテクスチャとしわの外観があり、イオン液体浸潤製剤の細胞壁に滑らかな この違いは，スパッタ被覆試料における脱水による細胞の膨圧の損失と体積損失の結果であり，しわは実際に脱水によって強調されるアーチファクトまたは特徴であることを提案した。, これを裏付ける証拠は、鞭毛などの他の微細構造が、スパッタコーティングおよびイオン液体処理試料の両方においてはっきりと見える（および同様の外観）という事実から来ている。 したがって、細菌のスパッタコーティングを用いた以前の研究の結果は、可能な脱水効果に照らして慎重に再解釈されなければならないかもしれない。

この調査で提示されたイオン液体法は、試料フィルターを事前に調製することができるので、迅速かつ再現性があります。, イオン液体は蒸気圧が非常に低いため、SEM観察中に発生する収縮、しわ、割れなどの乾燥アーチファクトが回避されるという利点があります（表1、補足図。 S3）。 将来的には、ナノメートルサイズの生体試料に対するイオン液体染色を用いたSEM技術をさらに改善するために、さまざまな種類のフィルターコーティングの開発が期待されている。