aby wytworzyć elektrycznie przewodzącą powierzchnię dla SEM, próbki biologiczne są często powlekane za pomocą cienkowarstwowego parowania lub rozpylania węgla lub metalu w powlekarce próżniowej, co wymaga uprzedniego odwodnienia próbki. Ten proces powlekania może zasłaniać drobne detale ultrastrukturalne, w zależności od grubości osadzonej warstwy (Zwykle 2-20 nm)., Te konwencjonalne procedury są trudne do przeprowadzenia na typowych próbkach mikrobiologicznych, które są zwykle zawiesinami małych cząstek biologicznych w wodzie (<100 nm dla większości wirusów lub w zakresie wielkości poniżej mikrometra dla wielu bakterii, grzybów i pasożytów). Dodatkowym problemem jest to, że drobnoustroje interesujące w próbkach pacjentów lub próbkach środowiskowych mogą być obecne w stosunkowo niskich stężeniach, co utrudnia obserwację ich na powierzchni.,
w niniejszym raporcie opisujemy metody zagęszczania zawiesin drobnoustrojów do obserwacji SEM na powleczonych podłożach filtracyjnych. Pokazujemy, że zamiast rozpylania powłoki, można użyć cieczy jonowej (tetrafluoroboran 1-butylo-3-metyloimidazolium) rozcieńczonej w wodzie do szybkiego infiltrowania mikrobiologicznej próbki SEM, tworząc elektronowo-lucentową powierzchnię przewodzącą, która zapobiega ładowaniu próbek i daje dobre wyniki z próbkami drobnoustrojów (rys. 1)., Ciecze jonowe są wysoko przewodzącymi solami, które pozostają w stanie ciekłym w temperaturze pokojowej i mają znikome ciśnienie pary (≤5 × 10-9 Torr). W warunkach wysokiej próżni współczesnych SEM (≤1 × 10-6 Torr) ciecze jonowe pozostają w stanie ciekłym i nie parują podczas pracy, pozostając jednocześnie przewodzące19,20,21,22,23. Najbardziej przydatne ciecze jonowe do zastosowań w biologicznym SEM mają przewodność elektryczną około 100 mScm−1, są stabilne elektrochemicznie (o oknie elektrochemicznym około 5,8 V), a także są rozpuszczalne w wodzie i łatwo są syntetyzowane24., Wykazano wcześniej,że ciecze jonowe o tych właściwościach dają kontrast obrazu SEM porównywalny z zastosowaniem powłoki metalowej i węglowej w przypadku stosowania z próbkami izolacyjnymi19, 25. Zostały one również wykorzystane do makroskopowego obrazowania próbek biologicznych, takich jak wodorosty, tkanki hodowanych komórek i skondensowanych chromosomów 20, 21,22. Materiały przewodzące, takie jak tlenek indu i cyny, folia aluminiowa lub pokrywy pokryte metalem, zostały użyte w celu zapobiegania ładowania20, jednak materiały te nie nadają się do filtracji w celu badań sem drobnoustrojów., Odkryliśmy, że w celu uzyskania optymalnych rezultatów przy użyciu cieczy jonowej z obiektami subkomórkowymi, takimi jak wirusy lub wici bakteryjne, konieczne jest wcześniejsze powlekanie filtrów poliwęglanowych aluminium lub złotem. Nie wykryliśmy dryfu próbki przy użyciu próbek biologicznych barwionych cieczą jonową, ponieważ były one dobrze wspierane przez membranę przewodzącą używaną podczas wstępnego procesu filtracji. Filtry poliwęglanowe SPI-pore są hydrofilowe i pozostają takie po pokryciu metalem, co czyni je idealnym podłożem do pracy z uwodnionymi próbkami biologicznymi., Barwienie cieczą jonową można również wykonywać w biologicznej szafie bezpieczeństwa, zapewniając szybką i bezpieczną alternatywę dla rozpylania powłok podczas pracy z próbkami zakaźnymi, ponieważ urządzenia do powlekania próżniowego mogą powodować aerozole i nie są łatwo powstrzymywane 20,21,22. Elegancko rozwiązaliśmy problem koncentracji próbki i zapobiegania ładowaniu, poprzez powlekanie metalem samego podłoża filtracyjnego przed nałożeniem próbki biologicznej (rys. 2). W przypadku braku cienkowarstwowej powłoki próbek wymagana była również infiltracja cieczami jonowymi, aby uniknąć ładowania., Wyniki są porównywalne z zastosowaniem SEM z powłoką rozpylającą i TEM z zastosowaniem techniki barwienia negatywnego (Rys. 1 i 2: figi uzupełniające S1–S5). Ultrafiltracja jest ważnym krokiem, ponieważ pomaga usunąć zanieczyszczenia, które mogą zasłonić szczegóły wirusów lub bakterii obecnych w próbkach biologicznych. W bieżącym raporcie pokazujemy wyraźne obrazowanie wirusów i wici bakteryjnych w niepowlekanych próbkach SEM, które wcześniej wymagały odwodnienia i powłoki rozpylającej, rozszerzając w ten sposób rozdzielczość i zakres próbek drobnoustrojów, które mogą być badane za pomocą SEM.,
porównanie konwencjonalnych metod przygotowania próbek metodą rozpylania sem (panele po lewej stronie) z jonową obróbką cieczą (panele środkowe) i konwencjonalnym TEM (panele po prawej stronie-strony) do obserwacji drobnoustrojów: a) Leptospira biflexa, B) salmonella Senftenberg, c) krowianka I d) wirus Ebola. Wizerunki SEM w panelach po lewej stronie były okazami pokrytymi złotem, na zwykłych, niepowlekanych filtrach., Obrazy w panelach środkowych przedstawiały próbki poddane działaniu cieczy jonowej po osadzeniu na powleczonych filtrach aluminiowych. Po prawej stronie obrazy TEM podobnych próbek przygotowane przy użyciu ujemnego barwienia wolframianu metyloaminy.
przygotowanie biologiczne próbki do sem.
(a) komponenty filtra są wyświetlane przed montażem., Wstawka sem obraz pokazuje Filtr pokryty złotem w dużym powiększeniu przed nałożeniem próbki. Należy pamiętać, że filtr jest czysty, a pory są wyraźnie widoczne. b) Jednostka filtracyjna jest pokazana po złożeniu i użytkowaniu z pompą strzykawkową w szafce bezpieczeństwa biologicznego (c,d). Niebieska strzałka w (d) wskazuje jednostkę filtrującą. e) obrazy filtrów, które odparowały na nich metal. Grubość Al wynosi 18 nm i 9 nm, A Au 27 nm i 9 nm. Dla filtra z obu metali grubość Al i Au wynosi odpowiednio 18 nm I 27 nm., (f) SEM i (g) odpowiednią mapę pierwiastkową wygenerowaną przez mikroanalizę rentgenowską obszaru podobnego do tego podświetlonego przez przerywany prostokąt w (e). (h–k) obrazy SEM salmonelli zabarwionej cieczą jonową ilustrujące wpływ różnych rodzajów metali i grubości metalu odparowanego na zarejestrowane obrazy końcowe (h Al 9 nm, i Au 9 nm, j Al 18 nm, k Au 27 nm). Czerwone strzałki oznaczają Biczowanie.
obrazy bakterii zabarwionych cieczą jonową miały gładszą topografię powierzchni niż te, które były odwodnione i powlekane rozpylaczem., Pomiary wielkości pokazują, że odwodnione okazy skurczyły się o około 10-20% (Tabela 1). Interpretujemy szczegóły powierzchni odwodnionych, powlekanych bakteriami sputter jako zmarszczki ściany komórkowej z powodu skurczu, a nie obserwację dodatkowych cech, które są obecne in vivo: te zmarszczki są więc prawdopodobnie artefakty z powodu suszenia. Wić bakteryjna była również wyraźnie widoczna po obróbce jonowym płynem na podłożach przewodzących (rys. 1, Dodatkowe Rys. S3). Wyniki te były porównywalne do tych, które obserwowaliśmy w przypadku powłoki sem-sputter i barwienia TEM-ujemnego.,
techniki cieczy jonowej mogą być również bezpiecznie stosowane z patogenami zakaźnymi, w biologicznie zamkniętej obudowie SEM, pozwalając na charakterystykę nowych czynników zakaźnych w stanie bliższym ich nawodnieniu „natywnemu” niż przy użyciu konwencjonalnych technik przygotowywania próbek 8. W przypadku tego badania nasz konwencjonalny protokół obejmował odwodnienie w serii etanolu, a następnie suszenie powietrzem i powlekanie metali przed obrazowaniem SEM., Dla protokołu cieczy jonowej próbka biologiczna miała kroplę 2,5% wodnego roztworu tetrafluoroboranu 1-butylo-3-metyloimidazolium umieszczoną bezpośrednio na niej. Po wymazaniu w celu usunięcia nadmiaru płynu mokra próbka była następnie umieszczana bezpośrednio w SEM. Podczas postępowania z próbkami zakaźnymi, dodatkowy etap wiązania aldehydów jest potrzebny do konwencjonalnej procedury, aby uniknąć ryzyka wystąpienia zakaźnych aerozoli, które mogłyby zostać wytworzone podczas procesu powlekania rozpylającego., Ten etap utrwalania nie jest wymagany przy użyciu techniki cieczy jonowej, ponieważ próbka może być przetwarzana w biologicznym kapturze przechowawczej, a następnie umieszczana bezpośrednio w SEM w biologicznie zamkniętej Enklawie SEM8, w celu zobrazowania w stanie nieutwardzonym, uwodnionym, który jest znacznie bliższy naturalnemu stanowi organizmu. Mikroskopia uzupełnia konwencjonalne testy diagnostyczne, które mogą ominąć nowe lub wariantowe3,26,27,28 i mogą szybko zidentyfikować rodzaj obecnego organizmu, prowadząc do wyboru bardziej szczegółowych testów29., Jednak mikroskopia elektronowa zwykle wymaga minimalnego stężenia cząstek dla niezawodnej identyfikacji drobnoustrojów. W przypadku wirusów jest to od 105 do 106 cząstek wirusa / mL4, 5. Dzięki technikom filtracji zarówno TEM, jak i SEM wirusów można przeprowadzić przy użyciu zaledwie 5000 cząstek na próbkę7.
barwienie cieczą jonową na filtrach powleczonych jest szeroko stosowane do każdej próbki biologicznej, która może skorzystać z filtracji w celu skoncentrowania interesujących cząstek., Zastosowanie filtrów z powłoką metalową z więcej niż jednym rodzajem powłoki na różnych obszarach pozwala na wybór dowolnej z tych powłok daje optymalne wyniki obserwacji konkretnej próbki lub określonych cech i pomaga zaoszczędzić czas (rys. 2a, e-k). Na przykład, po barwieniu cieczą jonową flagelki bakteryjne pojawiły się jaśniejsze w stosunku do podłoża powlekanego Al, podczas gdy na obszarze pokrytym Au filtr kontrast jest odwrócony ,a flagelki pojawiły się ciemniejsze (rys. 2h-k)., Podobnie obrazy wirusa Ebola i Leptospira biflexa wykazały dobrą jakość topograficznych szczegółów, gdy obrazowane z filtrem powlekanym aluminium, ale materiał biologiczny miał mniej szczegółów i pojawił się jako ciemna płaska sylwetka, gdy obrazowane na filtrach pokrytych złotem (dodatkowe figi S4 i S5). Proponujemy, że jest to spowodowane wyższym wtórnym sygnałem emisji elektronów z Au w porównaniu do Al. W tym badaniu zebraliśmy obrazy SEM z wtórnym detektorem elektronów, który jest najczęściej używany do rutynowego obrazowania z próbkami biologicznymi., W SEM współczynnik emisji elektronów wtórnych (δ) jest względnie stały niezależnie od liczby atomowej. Wyjątkiem jest jednak Au, dla którego δ jest prawie dwukrotnie większa od Al i wielu innych pierwiastków. Na wartość δ wpływa również energia wiązki: przy 20 kV δ wynosi 0,1 dla Al i 0,2 dla Au30. Poprzez pomiar natężenia w wtórnych obrazach elektronów wykonanych przy 4 kV z Al I Au na tym samym obrazie (rys. 2F), obliczyliśmy, że sygnał z Au jest 2,1 razy intensywniejszy od Al, który jest zbliżony do spodziewanego teoretycznie., W przypadku obrazów zarejestrowanych okazów na filtrach pokrytych złotem interpretujemy wyniki jako generujące zbyt duży kontrast z podłożem tła, co miało tendencję do zaciemniania drobnych szczegółów, takich jak wici, które pojawiają się jako „sylwetki” na jasnym tle. Jednak mikroby infiltrowane cieczą jonową i filtr powlekany aluminium mają podobne współczynniki emisji, dlatego kontrast jest w dużej mierze spowodowany topografią, a nie różnicami w składzie materiału, dzięki czemu można zobaczyć więcej drobnych szczegółów.,
wstępne powlekanie filtrów metalem nie miało wpływu na rozmiary porów ani zdolność filtracji filtrów (rys. 2). Cały protokół barwienia płynem jonowym może być przeprowadzony na standardowym stanowisku laboratoryjnym w około 15 minut i mieści się w szafce bezpieczeństwa biologicznego (rys. 2c, d). W sputter coatingu dla SEM zbyt cienka warstwa powoduje słabe przewodzenie i ładowanie, podczas gdy zbyt gruba warstwa zasłania drobne szczegóły., Grubość zastosowana do wstępnego powlekania podłoży może być znacznie większa niż powłoki rozpylające zwykle stosowane do próbek biologicznych, aby zapewnić dobrą przewodność, o ile pory filtra nie są zablokowane. (Rys. 2e-k, rys. uzupełniający S2).
w niniejszym badaniu zastosowaliśmy powłoki 18 i 27 nm odpowiednio dla Al i Au, ponieważ stwierdzono, że te grubości są wystarczające, aby zapobiec ładowaniu, w porównaniu do filtrów niepowlekanych (rys. S2). Podłoża o tych minimalnych grubościach były łatwo wybierane, ponieważ były widoczne jako błyszcząca powłoka metaliczna., Gdy powłoki o długości mniejszej niż 27 nm dla Au lub 18 nm Dla Al były obecne, miały one nieprzezroczysty lub płasko-biały wygląd (rys. 2). Dzięki barwieniu cieczą jonową za pomocą tych metalowych filtrów byliśmy w stanie wizualizować drobne szczegóły strukturalne bakterii, takie jak wici salmonelli o średnicy 20 nm, za pomocą SEM (rys. 2j, k, rys. uzupełniający S3).,
wyniki uzyskane za pomocą filtracji i prostej jonowej infiltracji cieczy dla SEM są bardzo porównywalne pod względem jakości z wynikami konwencjonalnej powłoki rozpylającej w SEM i ujemnego barwienia w TEM dla różnych próbek bakterii i wirusów, w tym Leptospira, Salmonella, wirus krowianki i wirus Ebola (rys. 1, Dodatkowe Rys. S3-S5) 7,16,31,32. Okazało się, że było znacznie mniej skurcz cieczy jonowej infiltracji bakterii i wirusów w porównaniu zarówno do odwodnionych sputter powlekane preparaty SEM i negatyw tem barwione obrazy (Tabela 1)., We wszystkich przypadkach wymiary suszonych drobnoustrojów tem pokrytych sputterem SEM i barwionych ujemnie były od 9,9% do 18,9% mniejsze niż próbki poddane działaniu cieczy jonowej (Tabela 1). W poprzednim badaniu obrazowaliśmy zamrożonego zeszklonego wirusa Ebola za pomocą mikroskopii krioelektronowej średnicę wirusa Ebola mierzono jako 96-98 nm16, co jest bardzo podobne do wartości 98,5 ± 10,2 nm dla średnicy mierzonej tych samych próbek leczonych cieczą jonową w niniejszym badaniu., Ponadto dowodzi to, że objętości cieczy jonowej naciekanych próbek są porównywalne z objętościami mierzonymi w zamrożonych warunkach uwodnionych i ściśle odzwierciedlają w pełni uwodniony natywny stan wirusa Ebola. W przypadku struktury prątków zmniejszenie wymiarów o 10% jest równoważne zmniejszeniu objętości o 27% z powodu odwodnienia, chociaż zapadanie się i spłaszczenie cylindrycznego kształtu oznaczałoby jeszcze większy stopień utraty wody., Jest oczywiste, że to spłaszczenie i zapadnięcie z powodu odwodnienia jest obecne w pewnym stopniu we wszystkich obrazach wirusów i bakterii z powłoką rozpylającą (rys. 1).
chociaż obrazy wydają się stosunkowo podobne, złota powłoka rozpylająca wydaje się dawać nieco większy kontrast niż ciecz jonowa. Inną zauważalną różnicą jest mniejsza chropowatość powierzchni ścian komórkowych bakterii w obrazach barwionych cieczą jonową. Można to zobaczyć na zdjęciach salmonelli (rys. 1, Dodatkowe Rys. S3)., Na tych zdjęciach jest wyraźny teksturowany i pomarszczony wygląd na powierzchni sputter powleczonych komórek bakteryjnych i gładki wygląd na ścianach komórkowych jonowych preparatów naciekowych. Proponujemy, że ta obserwowana różnica jest w dużej mierze wynikiem utraty turgoru komórkowego z powodu odwodnienia i utraty objętości w próbkach pokrytych sputterem, a zatem zmarszczki mogą być artefaktem lub cechą, która jest podkreślona przez odwodnienie., Dowodem na to jest fakt, że inne drobne struktury, takie jak wiciowce, są wyraźnie widoczne (i o podobnym wyglądzie) zarówno w próbkach pokrytych sputterem, jak i w próbkach poddanych działaniu cieczy jonowej. W związku z tym, wyniki poprzednich badań z użyciem powłoki rozpylającej bakterii mogą być ostrożnie ponownie interpretowane w świetle możliwych skutków odwodnienia.
przedstawiona w niniejszym badaniu procedura cieczy jonowej jest szybka i powtarzalna, ponieważ filtry próbkowe można przygotować z wyprzedzeniem., Ponieważ ciecz jonowa ma bardzo niskie ciśnienie pary, dodatkową korzyścią jest to, że unika się artefaktów suszenia, takich jak skurcz, marszczenie lub pękanie, które mogą wystąpić podczas obserwacji SEM (Tabela 1, dodatkowe rys. S3). W przyszłości przewidujemy rozwój różnych rodzajów powłok filtracyjnych w celu dalszej poprawy technik SEM z wykorzystaniem barwienia jonowego w płynie dla próbek biologicznych w zakresie wielkości nanometrów.
Leave a Reply