odczynniki chemiczne i przeciwciała
kolekcja jadu pszczół
jad został zebrany przy użyciu pracowników lub Królowych z kilku różnych populacji pszczół Apid., Próbki jadu pobrane od pszczół miodnych (Apis mellifera) i trzmieli (Bombus terrestris audax) pochodzą z Perth (Australia), Dublina (Irlandia) i Londynu (Anglia). Jad pszczoły miodnej zebrano od 30 pracowników każdej z trzech różnych kolonii z pasieki lub gospodarstwa, zgodnie z opisem. Jad pszczoły miodnej z Australii został pobrany z pasieki prowadzonej przez Centre for Integrative Bee Research (CIBER) przy University of Western Australia (UWA: -31.980151, 115.817919)., Jad pszczoły miodnej z Irlandii został pobrany z jednej kolonii w pasiece w Trinity College w Dublinie (53.343933, -6.254635), a dwie pozostałe kolonie z farm w pobliżu Glasnevin (53.383245, -6.276333) i Blanchardstown (53.384220, -6.375979). Jad pszczół miodnych i trzmieli z Anglii został zebrany na Royal Holloway University of London (51.425626, -0.562987). Jad trzmieli został zebrany od 20 pracowników z każdej z 2 Kolonii zakupionych komercyjnie, z jednej królowej Bumblebee z każdej z tych dwóch Kolonii używanych do zbierania jadu królowej bumblebee., Niezależne biologiczne mieszanki mistrzowskie zostały przygotowane przez oddzielenie jadu z różnych kolonii, a łącznie zebrano jad 312 pszczół.
jad gruczołowy został pobrany przez ręczne rozwarstwienie. Pszczoły zostały schwytane w pobliżu wejścia do ula dla pszczół miodnych lub bezpośrednio z kolonii dla trzmieli, i znieczulone dwutlenkiem węgla i schłodzone na lodzie. Aparat użądlający został oddzielony od każdego osobnika; następnie usunięto gruczoł jadowy i umieszczono w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS)., Gruczoły zostały Przekłute igłą Terumo (25 g × 5/8) i odwirowane (13 000 g, 10 min, 4 °C), a supernatant zebrany, zawierający jad w ciekłej zawiesinie. Stężenie białka każdej mieszanki wzorcowej oznaczono ilościowo za pomocą testu białka kompatybilnego z detergentem (Bio-Rad), mierzącego absorbancję przy 750 nm za pomocą Millennium Science BioTek PowerWave XS2 (oprogramowanie Gen 5 1.11, Wersja 1.11.5). Każda mieszanka master była następnie aliquoted i przechowywane w temperaturze -80 °C.,
linie komórkowe i warunki hodowli
wszystkie linie komórkowe zostały zakupione z American type Culture Collection (Manassas, VA, USA), z wyjątkiem komórek HEK293FT, które zostały zakupione od Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australia), SUM149 i SUM159, które zostały uzyskane z Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA), oraz komórek T11 I B. 15, które zostały uprzejmie dostarczone przez Charlesa Perou i Lubę Varticovski z University of North Carolina w USA.Chapel Hill i National Institutes of Health, odpowiednio. T11 I B. 15 to bardzo dobrze scharakteryzowane linie komórkowe37,38.,
komórki inkubowano w temperaturze 37 °C i 5% CO2 oraz uzupełniono 1% antybiotykiem–antymikotykiem. Komórki HDFa (normal primary adult human Dermal fibroblast) hodowano w DMEM z 10% surowicą bydlęcą płodu (FBS). MCF 10A i MCF-12A (ludzkie komórki nabłonkowe uwiecznione na sutku, nietransformowane) utrzymywano w DMEM / F-12 z suplementami (5% surowicy końskiej płodu, 20 ng / mL czynnika wzrostu naskórka, 10 µg/µL insuliny, 100 ng/mL toksyny cholery i 500 ng/mL hydrokortyzonu). Komórki NIH/3T3 (mysi embrionalny fibroblast) utrzymywano w DMEM z 10% FBS., Hek293ft (ludzka nerka embrionalna 293 komórki stabilnie wyrażające duży antygen T SV40) wyhodowano w DMEM z 10% FBS i suplementami (1% glutaminy i 0,4 mg/mL Genetycyny G418, Gibco). MCF7 (ludzki rak piersi luminal a) utrzymywał się w MEM α z 10% FBS i suplementami (po 1% pirogronianu sodu, wodorowęglanu sodu i zbędnych aminokwasów). T-47D i Zr-75-1 (zarówno ludzki rak piersi luminal a) hodowano w RPMI z 10% FBS. MDA-MB-231 (human-low breast cancer) został wyhodowany w DMEM z 10% FBS., SUM149 (ludzki bazalno-podobny rak piersi) został wyhodowany w F-12 z 10% FBS. W F-12 hodowano 5% FBS i suplementy (5 µg/mL insuliny i 1 µg/mL hydrokortyzonu). MDA-MB-453 (ludzki rak piersi wzbogacony HER2) został wyhodowany w DMEM z 10% FBS. SKBR3 (ludzki rak piersi wzbogacony HER2) hodowano w RPMI z 10% FBS i 1% pirogronianem sodu. p53-T11 (mysi-niski rak piersi) utrzymywano w rpmi 1640 medium z 10% FBS. BRCA-B. 15 (mysi bazalopodobny rak piersi) utrzymywano w rpmi 1640 medium z 10% FBS.,
testy żywotności komórek
żywotność komórek określono za pomocą testu żywotności komórek luminescencyjnych zgodnie z protokołem dostawcy. Komórki platerowano w 96-studziennych płytkach hodowli i inkubowano w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 h. W przypadku testów dawkowo-reakcyjnych pożywki odrzucono i zastąpiono pożywkami zawierającymi wskazane stężenia jadu pszczelego lub peptydu i hodowano przez 24 h., W przypadku żywotności komórek powyżej 60 min, komórki poddawano działaniu IC50 jadu pszczoły miodnej lub melittyny dla każdej linii komórkowej w krótkich odstępach czasu ponad 1 h, a żywotność określano bezpośrednio po zabiegu. W celu określenia żywotności komórki inkubowano za pomocą odczynnika CellTiter-Glo (CTG) 2.0 przez 10 min. Żywotność komórek została określona poprzez pomiar luminescencji za pomocą czytnika wielowarstwowego EnVision 2102 (PerkinElmer). Eksperymenty przeprowadzono na replikatach biologicznych (n = 3).,
produkcja pierwotnego przeciwciała monoklonalnego przeciwko melittin
produkcja przeciwciał została przeprowadzona zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez komitet etyki zwierząt Harry Perkins Institute of Medical Research. Samice myszy A / J zostały uodpornione jadem pszczół miodnych zebranym w Australii. Myszy otrzymały zastrzyki dootrzewnowe zawierające 12 µg jadu w całkowitym Adiuwancie Freunda( Difco), a następnie zwiększenie niekompletnego adiuwantu Freunda w dniu 29 i zwiększenie wodnego stężenia PBS w dawce 7 µg/mysz w dniu 49. Myszy krwawiły w 60. dniu, a surowice testowano metodą ELISA., Najlepszą odpowiedź na leczenie zwiększono 7 µg jadu pszczół miodnych w PBS 4 dni przed fuzją. Komórki śledziony połączono z komórkami szpiczaka Sp2/O zgodnie ze standardowymi procedurami 82. Supernatanty zawierające przeciwciała były badane metodą ELISA. Do dalszych badań wybrano klon Hybridoma 3B9. Przeciwciało zostało wytworzone przez hodowanie komórek hybridoma w bioreaktorach w środowisku wolnym od Hybridoma Serum (Gibco). Przeciwciało oczyszczono za pomocą białkowej chromatografii G-Sefarozowej. Oczyszczone przeciwciało było dializowane w PBS (pH 7,3). Przeciwciało było odtąd określane jako przeciwciało anty-melittin (3B9).,
enzymatyczny test immunosorbentowy (ELISA)
jadowity i peptydy były platerowane do jasnych 96-studziennych płytek opartych na krzywej w 5 µg / mL w buforze węglanowym i inkubowane w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. ciecz została usunięta, a płytki trzykrotnie przemyte w roztworze 0,05% TWEEN-20 („Tween-20”, Sigma-Aldrich) w PBS. Pierwotne przeciwciała zostały dodane do studzienek z rozcieńczeniami 1: 2 począwszy od 10 µg/mL w rozcieńczalniku (0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS) i inkubowane przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pierwotne przeciwciała zostały usunięte, a płytki myte trzy razy w 0.,05% Tween-20 w PBS. Do studzienek dodano poliklonalne przeciwciało wtórne IgG IgG specyficzne dla łańcucha γ (1: 1000 w rozcieńczalniku) i inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej. Pierwotne przeciwciała zostały usunięte, a płytki myte trzy razy w 0,05% Tween-20 w PBS. Bufor Elisa, roztwór oczyszczonej wody zawierający 10% kwasu cytrynowego (pH 4,2), 2% ABTS i 0,1% H2O2, został dodany do studni, a płytki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut., Absorbancja została zarejestrowana przy 405 nm przy użyciu czytnika płyt VICTOR Light z oprogramowaniem Wallac 1420 Manager (PerkinElmer). KontrolÄ … byĹ 'o mysi monoklonalne przeciwciaĺ' o IgG (28/00 8C1-6) reagujÄ … ce z ludzkim IL-12, nałożone na peptyd melittyny na pĹ ' ytce ELISA. Eksperymenty przeprowadzono na replikatach biologicznych (n = 3).
badania konkurencji przeciwciałami przeciw melittynie
komórki HDFa i SUM159 zostały Platerowane w 96-studziennych płytkach hodowli i inkubowane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny., Wzrastające stężenia przeciwciał anty-melittyny inkubowano z IC50 stężeniem jadu pszczoły miodnej lub melittyny dla każdej linii komórkowej przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie dodawano do komórek przez 24 h. żywotność komórek oznaczono zgodnie z opisem w „testach żywotności komórek”. Eksperymenty przeprowadzono na replikatach biologicznych (n = 3).
komórki Western blot
zostały powleczone na płyty 6-studzienne o gęstości 300 000 komórek / studni i inkubowane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 h., Eksperymenty w hodowli komórkowej przeprowadzono zgodnie z opisem, a następnie zastosowano standardowy protokół Western blot, jak opisano w niniejszym dokumencie. Komórki przemyto zimnym PBS i lized zimnym buforem do lizy białka (2% siarczan dodecylu sodu (SDS), 125 mmol/l Tris-HCl, pH 6,8). Próbki poddano działaniu sonikacji przez 10 s przy 10 mA, a stężenia białka oznaczono ilościowo za pomocą testu białka zgodnego z detergentem (Bio-Rad). Równe ilości białek zmieszano z buforem ładującym (Bufor próbki Laemmli, Bio-Rad) uzupełnionym czynnikiem redukującym ditiotreitol (DTT)., Próbki białka denaturowano przez 5 minut przez gotowanie w temperaturze 95 °C, ładowano do prefabrykowanych żeli Mini PROTEAN (Bio-Rad) i poddawano elektroforezie przy napięciu 100 V, a następnie przenoszono do membran PVDF (Bio-Rad) za pomocą Systemu Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) przez 7 minut. Membrany inkubowano za pomocą TBST (20 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl i 0,1% Tween-20) z 5% mlekiem beztłuszczowym w celu zablokowania niespecyficznego wiązania. Membrany inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C, z przeciwciałami pierwotnymi rozcieńczonymi w 3% BSA i 0,02% azydku sodu., Sygnał został wykryty za pomocą Luminata Crescendo Western HRP substrat (Millipore) z ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) z oprogramowaniem Image Lab (Bio-Rad, Wersja 6). Zachodnie plamy zostały uzyskane z tego samego eksperymentu i przetwarzane równolegle. Nieoczyszczone skany plam Zachodnich są dostarczane w dodatkowych figach. 10–15.
cytometria przepływowa
apoptozę i martwicę oceniano za pomocą Annexin V-FITC apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences) zgodnie z protokołem producenta. Komórki SUM159 były Platerowane w 6-studziennych płytkach kulturowych przez 24 h., Pożywki zostały następnie odrzucone i zastąpione pożywkami zawierającymi jad pszczoły miodnej lub melittynę (stężenie IC50) i hodowane przez 60 minut. Komórki zebrano trypsyną i mediami, odwirowano (1000g, 5 min, 24 °C), przemyto zimnym PBS, odwirowano (1000g, 5 min, 24 °C) i ponownie zawieszono w 1× buforze wiążącym. Komórki przygotowano do stężenia 1 miliona komórek / mL w 1× buforze wiążącym. Próbki inkubowano FITC i PI (po 5 µL) w ciemności przez 15 minut., Obecność żywych, martwych, apoptotycznych lub martwiczych komórek oceniano za pomocą CYTOMETRU BD Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, USA) za pomocą oprogramowania BD Accuri C6 i analizowano za pomocą FlowJo™ (Ashland, USA, Windows Version 7). Eksperymenty przeprowadzono na replikatach biologicznych (n = 3). Strategie bramkowania przedstawiono na rysunku uzupełniającym. 16.
mikroskopia żywych komórek
komórki SKBR3 zostały powleczone do szklanego naczynia microwell (10 × 35 mm, MatTek) i inkubowane przez 24 h., Naczynie microwell pozostawiono do równowagi w komorze inkubacyjnej NIKON Eclipse ti confocal microscope stage-Top (37 °C i 5% CO2) przez 20 minut. Obiektyw 20× był używany z wyrównaniem Kohlera, a zdjęcia były robione co minutę od 10 minut przed do 1 godziny po obróbce IC50 jadu pszczół miodnych zebranego w Australii., Autorzy doceniają udogodnienia i pomoc naukową i techniczną oferowaną przez National Imaging Facility, a national Collaborative research Infrastructure Strategy (NCRIS), a także Australian Microscopy & Microanalysis Research Facility, zarówno w Centre for Microscopy, Characterization and Analysis (CMCA), UWA, obiekt finansowany przez Uniwersytet, stan i rządy Commonwealth.,
skaningowa mikroskopia elektronowa
szklane pokrywy (Średnica 12 mm, Menzel, Thermo Fisher Scientific) powlekano bromowodorkiem Poli-L-lizyny (Sigma-Aldrich) przez 20 min, a następnie dwukrotnie przemywano wodą oczyszczoną. Komórki SUM159 zostały powleczone na szklane szkiełka o gęstości 62,500 komórek / studnię i inkubowane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 h. komórki przemyto dwukrotnie PBS, a następnie poddano obróbce nośnikiem lub stężeniem IC50 jadu pszczół miodnych i melittyny przez 1 h., Komórki przemywano dwukrotnie PBS, następnie mocowano 4% formaldehydem w PBS przez 25 min, a następnie ponownie przemywano trzy razy PBS. W ramach przygotowań do mikroskopii próbki zanurzono w 2,5% aldehydu glutarowego i inkubowano w temperaturze 4 °C przez 2 godziny. próbki przemyto wodą dejonizowaną i zanurzono w rosnącym stężeniu etanolu (50%, 70%, 95%, 100%, a następnie 100% absolutnego „suchego” etanolu). Pomiędzy każdym zanurzeniem próbki były odwodnione w specjalistycznej mikrofalówce (PELCO, laboratoryjny System mikrofalowy BioWave 34700)., Proces odwadniania został zakończony za pomocą urządzenia do suszenia punktowego E3000 w celu zastąpienia etanolu w próbce nadkrytycznym CO2. Przetworzone coverslipy były montowane na mocowaniach SEM (ProSciTech) z karbonowymi zaczepami. Próbki zostały pokryte platyną 3 nm, aby uczynić je elektronicznie przewodzącymi przed wizualizacją pod skaningowym mikroskopem elektronowym (Zeiss 1555 VP-FESEM) w CMCA, UWA. Zdjęcia zostały wykonane za pomocą detektora w obiektywie z odległości roboczej 2,6 mm, apertury 30 µm i napięciem przyspieszającym 5 kV., Obrazy były analizowane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu FIJI (ImageJ)83.
Immunofluorescencja
szklane pokrywy (o średnicy 12 mm, Menzel, Thermo Fisher Scientific) umieszczano w płytkach 24-studziennych i powlekano Poli-L-lizyną (Sigma-Aldrich) przez 20 min, a następnie dwukrotnie przemywano wodą oczyszczoną. Komórki SUM159 zostały powleczone na szklane szkiełka i inkubowane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 h. komórki były traktowane przez 30 min nośnikiem lub IC50 jadu pszczół miodnych, melittyny, rgd1-melittyny i równoważnym stężeniem molowym jak melittyna dla DEDE-melittyny., Komórki przemyto dwukrotnie PBS, następnie mocowano 4% paraformaldehydem w PBS przez 25 minut, a następnie ponownie przemyto trzy razy PBS. Niespecyficzne Wiązanie przeciwciał zostało zablokowane przy użyciu 5% normalnej surowicy Koziej (Thermo Fisher Scientific) w PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej. Do komórek dodano przeciwciała pierwotne, w tym monoklonalne przeciwciało przeciw melittynie (5 µg/mL) i 1: 500 przeciw EGFR (Abcam). Próbki inkubowano z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C przez noc., Komórki przemyto trzykrotnie PBS, a następnie inkubowano 1:500 z przeciwciałem wtórnym Alexa Fluor 488 goat Anti-Mouse, 1: 500 z przeciwciałem wtórnym Alexa Fluor 594 goat Anti-rabbit, oraz Hoechst (1:5000) w PBS w temperaturze pokojowej przez 1 h. próbki przemyto trzykrotnie PBS i zamontowano na szklanych pokrywach za pomocą oprawy przeciwgrzybiczej Slowfade Diamond (Thermo Fisher Scientific). Szkiełka były obrazowane przy użyciu mikroskopu inwersyjnego Nikon ti-E z fluorescencją konfokalną. Zdjęcia wykonano przy użyciu obiektywu 20× air (NA 0.,75) oraz sekwencyjne wzbudzenie przy użyciu fal o długości fali 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (przeciwciało wtórne Alexa Fluor 488) i 561 nm (przeciwciało wtórne Alexa Fluor 594). Obrazy zostały zebrane za pomocą oprogramowania NIS-C Elements i przetworzone za pomocą Fidżi (ImageJ) w cmca83.
Bioluminescence resonance energy transfer (BRET)
interakcje Receptor–ligand oceniano za pomocą BRET, stosując metodę podobną do opisanej poprzednio 84,85., BRET polega na nieradiacyjnym transferze energii (dipol-dipol–pomiędzy dwoma białkami lub cząsteczkami oznaczonymi lucyferazą dawczą lub fluoroforem akceptującym po utlenianiu substratu przez lucyferazę i późniejszej emisji światła54. Znaczniki FITC zostały sprzężone z końcem N melittyny (FITC-melittin) i DEDE-melittin (FITC–DEDE-melittin). Komórki hek293 stabilnie wyrażające duży antygen T SV40 (HEK293FT) były platerowane na płytkach 6-studziennych o gęstości 550 000 komórek/odwiert przez 24 h., Komórki HEK293FT zostały przetransferowane plazmidami zawierającymi cDNA dla NanoLuc-EGFR za pomocą Fugenu. Krótko, plazmid cDNA inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą mieszaniny odczynnika do transfekcji i wolnego od surowicy DMEM w stosunku 10 ng / µL NanoLuc-EGFR: 4 µL Fugenu: 100 µL SFM. Mieszankę dodano do komórek HEK293FT w końcowym stężeniu 10 ng / µL NanoLuc-EGFR na studzienkę płytki 6-studziennej, a komórki inkubowano przez 24 godziny. komórki przemyto PBS i odłączono trypsyną, a następnie zebrano w mediach zawierających 5% surowicę płodową cieląt w wolnym od czerwieni fenolowej DMEM., Komórki platerowano na 50.000 komórek / studni w poly-L-lizyny pokryte 96-dobrze białe płytki i inkubowane przez 24 h. zarówno nasycenia i kinetycznych Bret assays, dwa filtry były używane do jednoczesnego pomiaru krótko-i długofalowej luminescencji odpowiadającej długości fali emisji cząsteczek donora i akceptora, odpowiednio.
w przypadku eksperymentów kinetyki wiązań ligandów w czasie rzeczywistym, media usuwano z komórek, które następnie inkubowano z 50 µL/studni substratu nanoluc furimazyny do końcowego stężenia 10 µM rozcieńczonego w zrównoważonym roztworze soli (HBSS)., Następnie komórki były equilibrowane w czytniku płyt CLARIOstar (BMG Labtech, Australia) przez 5 minut, aby zapisać odczyty bazalne. Ligandy (TAMRA-EGF, FITC-melittin i FITC–Dede-melittin) zostały następnie dodane do zakresu prawidłowych stężeń końcowych, a nagrania Nanobretowe wykonywane co 90 s przez 60 min w temperaturze 37 °C. W przypadku eksperymentów nasycenia Media zostały usunięte z komórek, a zakres stężeń TAMRA-EGF, FITC-melittin i FITC–Dede-melittin dodano w obecności lub braku konkurencyjnego stężenia (1 µM) nieoznakowanego EGF i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 60 min W ciemności., Furimazyna została dodana w końcowym stężeniu 10 µM. Nagrań dokonano przy użyciu lumistar Omega (BMG Labtech, Australia). Dane są prezentowane jako „raw Bret ratio”, Pochodzące ze stosunku emisji o długiej długości fali (akceptora) nad emisją o krótkiej długości fali (dawcy). Eksperymenty przeprowadzono na replikatach biologicznych (n = 3).
Analiza skojarzonego działania leku
jadu pszczoły miodnej lub melittyny podawano w skojarzeniu z docetakselem i podawano w stężeniach wskazanych w niestałym stosunku w komórkach T11 przez 24 godziny., Żywotność komórek oceniono za pomocą CellTiter-Glo, jak wspomniano wcześniej. Łączne działanie jadu pszczoły miodnej lub melittyny z docetakselem oceniano metodą mediany dawki z zastosowaniem oprogramowania CompuSyn (ComboSyn). Metoda ta określa CI na podstawie efektu połączenia dwóch czynników (gdzie CI < 1 jest synergistyczny, CI > 1 jest antagonistyczny, a CI = 1 jest addytywny)56. Eksperymenty przeprowadzono na replikatach biologicznych (n = 3).,
model i zabiegi na zwierzętach
te doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez komitet etyki zwierząt UWA. Aby symulować zaawansowany model raka piersi o niskiej zawartości Klaudyny, 2,5 × 105 komórek T11 zawieszono w mediach wolnych od surowicy i matrycy BD o wysokim stężeniu (BD Bioscience) w stosunku 1:1 do całkowitej objętości 100 µL i wstrzyknięto podskórnie do boków 5-tygodniowych samic BALB/cJ (Animal Resources Centre, WA, Australia) za pomocą igły 26 G., Zastosowane komórki T11 były lentivirally transducted z strukturą ZsGreen-luciferase i posortowane trzy razy w celu osiągnięcia wzbogacenia przewyższającego 99% komórek luciferase-dodatnich. Melittin zawieszono w wodzie Milli-Q + 5% dekstrozy. Docetaksel (w proszku) był zawieszony w 25% roztworze TWEEN 80 (Sigma-Aldrich) i 75% mieszaniny 15,25:84,75 (v/v) roztworu etanolu absolutnego i wody oczyszczonej i przechowywany w temperaturze -20 °C. bezpośrednio przed rozpoczęciem leczenia docetaksel został świeżo rozcieńczony w wodzie Milli-Q + 5% dekstrozy w wymaganym stężeniu końcowym., Trzy dni po wytworzeniu guzów T11(~ 50 mm3), myszy randomizowano do 4 grup (n = 12 myszy/Grupa). Zabiegi były wstrzykiwane donatumoralnie w dniach 3, 5, 7, 9, 11, 13, i 15 po zaszczepieniu komórek T11 nośnikiem, melittyną (5 mg/kg mc.), docetakselem (7 mg/kg mc.) lub połączeniem melittyny (5 mg/kg mc.) i docetakselem (7 mg/kg mc.). Zwierzęta były monitorowane pod kątem wielkości guza co 2 dni i objętości obliczonych według zmodyfikowanego wzoru elipsoidy (objętość = szerokość 2 × Długość/2). Zwierzęta składano w ofierze po ludzku, gdy guzy osiągnęły 800 mm3.,
Analiza Immunohistochemiczna guzów
tkanki nowotworowe zostały ustalone w 4% paraformaldehydu, myte trzy razy w PBS, A pozostawione w 70% etanolu. Guzy osadzono w parafinie i przygotowano sekcje 5-µm. W przypadku barwienia hematoksyliną/eozyną, szkiełka były odparafinowane, uwodnione przy użyciu zmniejszającego się Banku roztworu etanolu, barwione hematoksyliną Gilla, odwodnione przy użyciu 70% etanolu, barwione eozyną, dalej odwodnione przy użyciu 100% etanolu, oczyszczone przy użyciu toluenu i zamontowane w coverslips za pomocą acrymount IHC mounting media (StatLab)., Apoptozę komórek nowotworowych oznaczano w sekcjach tkankowych metodą TUNELA (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche).
obrazowanie bioluminescencyjne
aby dokładnie śledzić zmiany wzrostu guza in vivo za pomocą zabiegów, wykonaliśmy analizę bioluminescencyjną przy użyciu systemu obrazowania Caliper IVIS Lumina II w CMCA, UWA. Analizy przeprowadzono co 2 dni po wytworzeniu nowotworu. Myszy wstrzyknięto dootrzewnowo 200 µL D-Lucyferyny (Cayman Chemical) w końcowym stężeniu 150 mg/kg rozpuszczonego w PBS przed znieczuleniem w 4% izofluranu., Po znieczuleniu myszy umieszczano w nagrzanej komorze aparatu bioluminescencyjnego i obrazowano 7-12 minut po wstrzyknięciu, poniżej 2% izofluranu, aż intensywność sygnału bioluminescencyjnego osiągnęła stan stacjonarny.
Analiza statystyczna
wszystkie dane pochodzą z wielu eksperymentów przeprowadzonych przynajmniej w trzech egzemplarzach. Analizy statystyczne wykonano za pomocą oprogramowania GraphPad Prism v8 (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft) oraz SPSS Predictive Analytics Software (IBM, Wersja 26)., W przypadku testów żywotności komórek dane zostały znormalizowane do średniej luminescencji stanu pojazdu, która została uznana za 100% żywotności, z IC50s uzyskanym w GraphPad Prism. Dla immunohistochemii w leczonych guzach T11 w celu wykrycia p-HER2 (Tyr1248) i P-EGFR (Tyr1068), pojazd znormalizowano do 100%., W stosownych przypadkach i jak wskazano w tekście głównym, statystyczna istotność została określona za pomocą nieparowanych dwuogoniastych testów studenta T, nieparowanych jednokierunkowej ANOVA z Tukey 's HSD post hoc testu korygującego dla wielokrotnych porównań, dwukierunkowej ANOVA z powtarzającymi się miarami, a następnie Sidak 's lub Tukey' s test wielokrotnego porównania, lub uogólniony model liniowy (GLM). We wszystkich testach różnice uznano za istotne przy p <0,05 (*), p<0,01 ( * * ) i p< 0,001 (***).,
Podsumowanie Raportu
Więcej informacji na temat projektu badawczego można znaleźć w podsumowaniu raportu raportu z badań przyrodniczych powiązanym z tym artykułem.
Leave a Reply