스캐닝 전자 현미경에서 미생물의 진단 및 전염병

을 생산하는 전기로 전도성을 위해 표면 SEM,생물학적 표본들은 종종 코팅을 사용하여 박막 증발 또는 스퍼터링의 탄소 또는 금속에서의 진공터가 필요 이전에는 탈수의 표본이다. 이 코팅 프로세스할 수 있습호 정밀한 초미세 구조,세부 두께에 따라 레이어의 기탁(일반적으로 2-20nm)., 이러한 기존 절차를 수행하기 어렵에는 전형적인 미생물 시편은 일반적으로 현탁액의 작은 생물학적 입자 물(<100nm 대부분은 바이러스,또는 하위 마이크로미터 범위에 대한 많은 박테리아,곰팡이 및 기생충). 추가하는 것이 문제의 미생물에 관심이 환자의 시료나 환경 샘플에 존재할 수 있는 상대적으로 낮은 농도,만들고 관찰하는 그들의 표면에 어렵습니다.,

본 보고서에서 우리는 사전 코팅 된 필터 기판에 sem 관찰을위한 미생물 현탁액을 집중시키는 방법을 기술한다. 우리는 대신 스퍼터 코팅,이온 액상(1-부틸-3-methylimidazolium tetrafluoroborate)희석에서는 물 사용할 수 있습을 빠르게 침투 미생물 SEM 샘플을 형성하고,전자-lucent 전도성,표면에 방지하는 표본을 위탁하고 좋은 결과를 얻을 미생물 시편(Fig. 1)., 이온성 액체는 전도성이 높은 소금에 남아 있는 액체 상태에서 실온으로 무시할 수증기 압력(≤5×10-9Torr). 아래에 고진공의 조건에 현대적인 SEM(≤1×10-6Torr)이온성 액체에 남아 있는 액체 상태가 증발되지 않습하는 동안 작동하는 동안,아직 conductive19,20,21,22,23. 가장 유용한 이온성 액체에 대한 응용 프로그램에서는 생물학적 SEM 있는 전기 전도도의 약 100mScm−1,화학적 안정(는 전기화학의 창의 주위에 5.8V),뿐만 아니라 물에 녹이고 있다 쉽게 synthesised24., 이온성 액체와 이러한 속성이 이전에 시연하게 SEM 이미지에 대조는 비교하고 탄소 코팅을 사용할 때 절연 specimens19,25. 그들은 또한 해조류,조직 배양 세포 및 응축 된 염색체와 같은 생물학적 표본의 거시적 이미징에 사용되었습니다 20,21,22. 전도성 기판 등으로 인듐 주석 산화물,알루미늄 호일,또는 금속을 입히는 coverslips 되었을 방지하기 위해 사용 charging20,그러나,이러한 자료가 부적합에 대한 여과를 위한 SEM 사의 미생물., 우리가 발견한 즉,최적의 결과를 위해 사용하는 이온성 액체와 subcellular 체와 같은 바이러스 또는 세균성 flagellae 기 전 코팅의 폴 리카 보 네이트 필터와 함께 알루미늄 또는 금이 필요했다. 우리는 탐지되지 않는 모든 시편의 표류 할 때 사용하는 이온성 액체가 얼룩 생물학적 표본이었기 때문에 잘에서 지원하는 전도성 막는 데 사용하는 동안 처음 여과 공정을 거치고 있습니다. SPI-공 폴 리카 보 네이트 필터는 친수성하고 유지한 후 그래서 금속 코팅,그들을 만드는 이상적인 기판하는 작업이 수화물 샘플입니다., 이온성 액체 염색을 수행할 수도 있습니다 내 생물학적 안전 캐비닛 제공,신속하고 안전한 대안을 sputter 코팅 작업을 할 때 감염 샘플을,이후 코팅 진공 장비를 일으킬 수 있는 에어로졸고 쉽게 contained20,21,22. 우리는 우아하게 문제를 해결하의 집중하고 샘플을 방지하는 위탁에 의하여,금속 코팅 필터의 자체 기판에 적용하기 전에 생물학적 샘플의(그림. 2). 샘플의 박막 코팅이없는 경우,충전을 피하기 위해 이온 성 액체와의 침투가 또한 요구되었다., 결과는 네거티브 염색 기술(그림 1 및 2:보충 그림 S1–S5)을 사용하여 스퍼터 코팅 및 TEM 을 사용한 SEM 의 사용과 비교할 수 있습니다. 초과 중요한 단계부터 도움이 파편을 제거할 수 있는 모호한의 세부사항 바이러스나 박테리아에 존재하는 생물 샘플입니다. 에서는 현재 보고서,우리가 보여 명확한 영상의 바이러스와 세균 flagellae 에 uncoated SEM 표본,이전에 필요한 탈수 및 스퍼터 코팅을 달성하기 위해,따라서 연장은 해상도와 범위의 미생물 샘플을 조사할 수 있습으로 SEM.,

의 비교 기존 스퍼터 코팅 SEM 샘플 준비 방법(위원회에서 왼쪽)와 이온 액체 치료(센터 패널)및 기존의 TEM(위원회에서 오른쪽)에 대한 관찰 미생물의: (a)Leptospira biflexa,(b)살모넬라 젠프텐베르크,(c)vaccinia 그리고(d)에볼라 바이러스입니다. 왼쪽 측면 패널의 SEM 이미지는 일반 코팅되지 않은 필터에 금으로 스퍼터 코팅 된 표본이었습니다., 센터 패널의 이미지는 사전 코팅 된 알루미늄 필터에 증착 된 후 이온 성 액체로 처리 된 시편이었다. 오른쪽에서,메틸 아민 텅스텐 산염 음성 염색을 사용하여 제조 된 유사한 표본의 tem 이미지.

준비의 생물 샘플에 대한 SEM.

(a)필터 유닛의 구성 요소는 조립 전에 표시됩니다., 삽입 된 SEM 이미지는 시편이 적용되기 전에 고배율로 금 코팅 된 필터를 보여줍니다. 필터가 깨끗하고 모공이 분명히 분명하다는 점에 유의하십시오. (b)필터 유닛은 조립 후 biosafety 캐비닛(c,d)의 주사기 펌프와 함께 사용 중에 표시됩니다. (D)의 파란색 화살표는 필터 유닛을 가리 킵니다. (이자형)그들에 증발 금속이 있었다 필터의 이미지. Al 의 두께는 18nm 및 9nm 이고 Au 는 27nm 및 9nm 두께입니다. 두 금속을 갖는 필터의 경우 Al 및 Au 의 두께는 각각 18nm 및 27nm 이다., (f)SEM 및(g)(e)에서 점선 사각형으로 강조 표시된 것과 유사한 영역의 X 선 미세 분석에 의해 생성 된 해당 원소 맵. (h–k)SEM 이미지의 살모넬라 스테인드와 함께 이온 액체 보여주는 효과가 서로 다른 금속 종류와 두께의 금속 증발 최종 기록된 이미지(h Al9nm,i Au9nm,j Al18nm,k Au27nm). 빨간색 화살표는 편모를 나타냅니다.

의 이미지를 박테리아로 얼룩진 이온 액체했고 매끄러운 표면 지형이 그들보다는 탈수 및 스퍼터 코팅입니다., 크기 측정 결과 탈수 된 표본이 약 10-20%감소한 것으로 나타났습니다(표 1). 우리는 해석 표면의 세부 사항에서 탈수,스퍼터 코팅으로 박테리아의 주름지기 때문에 세포벽을 수축보다는 관측이의 추가적인 기능에 존재하는 생체:이러한 주름은 따라서 가능성을 유물로 인해 건조. 세균성 편모는 또한 전도 기질상의 이온 성 액체 처리로 명확하게 볼 수 있었다(도 1). 1,보충 그림. S3). 이러한 결과는 우리가 SEM-스퍼터 코팅 및 TEM-음성 염색으로 관찰 한 것과 비교되었다.,

이온 액체 기술을 사용할 수도 있습으로 안전하게 전염성의 병원에서는 생물학적으로 포함되어 SEM 인클로저를 허용,특성 분석의 소설 감염 상태에서 가까운 그들의 수화”native”상태보다는 기존의 샘플 준비 techniques8. 의 경우에는 이 조사를 우리는 기존 프로토콜 참여 탈수에서 에탄올 시리즈에 의해 다음,공기 건조 및 금속 코팅기 전에 SEM imaging., 이온 성 액체 프로토콜의 경우,생물학적 시료는 1-부틸-3-메틸이 미다 졸륨 테트라 플루오로 보레이트의 2.5%수용액을 직접 그 위에 놓았다. 과량의 유체를 제거하기 위해 블로 팅 한 후 젖은 샘플을 그 다음 SEM 에 직접 놓았다. 다룰 때는 감염성,샘플이 추가 알데히드 수리 단계에 필요한 기존 절차의 위험을 방지하기 위해 전염성 에어로졸을 생성할 수 있는 동안에는 스퍼터 코팅 과정입니다., 이 수리 단계가 필요하지 않습을 가진 이온 액체,기술부터 샘플을 처리할 수 있습에서 생물학의 격리 후드와 그 위치에서 직접 SEM 에서 생물학적으로 포함되어 SEM enclosure8,이미징에 고정되지 않은,수산화 상태로 훨씬 더 가까이어의 상태는 유기체입니다. 현미경을 보완 기존의 진단할 수 있는 테스트를 놓치는 소설 또는 변 strains3,26,27,28 할 수 있는 빠르게 식별 형식을 유기체의 존재,인도의 선택을 더 특정 tests29., 그러나 전자 현미경 검사는 일반적으로 미생물의 신뢰성있는 식별을 위해 입자의 최소 농도가 필요합니다. 바이러스의 경우 105~106 개의 바이러스 입자/mL4,5 입니다. 여과 기술로,바이러스의 TEM 그리고 SEM 둘 다 sample7 당 적은 5000 의 입자로 실행될 수 있습니다.

이온 액체에서 염색 pre-코팅 필터를 널리 적용되는 모든 생물 샘플에서 혜택을 받을 수 있는 여과 집중하는 입자의 관심입니다., 의 사용을 금속을 입히는 필터 하나 이상의 코팅의 유형에 다른 지역 선택할 수 있도록 중의 이러한 코팅에게 최적의 결과를 관찰하는 특정 시편 또는 특정 기능과 시간을 절약하는 데 도움이됩니다(그림. 2a,e–k). 예를 들어,이온성 액체가 얼룩 세균 flagellae 등장 밝은에 대해 알 코팅,기판에 Au-입히는 지역의 필터링하는 반면이 반전되고 flagellae 등장 어두운(Fig. 2h-k)., 마찬가지로 이미지의 에볼라 바이러스 및 Leptospira biflexa 보여주는 좋은 품질의 지형 세부사항을 때 이미지와 함께 알루미늄 입히는 필터이지만,생물학적 재료보다 더 세부사항과 같이 등장 어두운 편평한 실루엣을 때 몇 군데에서 골드 코팅 필터(보조 무화과 S4,S5). 우리는 이것이 Al 과 비교하여 Au 로부터의 더 높은 2 차 전자 방출 신호에 기인한다고 제안한다. 이 조사는 수집 SEM 이미지와 함께 이차 전자 전기,가장 일반적으로 사용되는 일상적인 이미징과 생물학적 표본이 있습니다., SEM 에서 2 차 전자 방출 계수(δ)는 원자 번호에 관계없이 상대적으로 일정합니다. 그러나 au 는 예외이며,δ 는 al 과 다른 많은 요소의 거의 두 배입니다. Δ 의 값은 또한 빔 에너지에 의해 영향을 받는다:20kV 에서 δ 는 Al 의 경우 0.1 이고 au30 의 경우 0.2 이다. 동일한 이미지에서 al 과 Au 를 모두 가진 4kV 에서 촬영 한 2 차 전자 이미지에서 강도를 측정함으로써(그림 1). 2f),우리는 au 로부터의 신호를 al 의 2.1 배 강도로 계산했는데,이는 이론적으로 예상되는 것과 가깝습니다., 으로 기록된 이미지를 표본의 골드 코팅 필터를,우리는 결과를 해석으로 생산하는 너무 많은 반면에서 배경 기질,경향이 모호하게 잘 세부 정보 등 flagellae 로 나타나는”실루엣”에 밝은 배경입니다. 그러나,이온성 액체 침투 미생물 알루미늄 입히는 필터에 비슷한 방출 계수를 따라서 대조은 주로 인해 지형보다는 차이점에서 물질 구성할 수 있도록,더 많은 좋은 정보를 볼 수 있습니다.,

전 코팅의 필터와 금속에 영향을 미치지 않았다 구멍 크기,또는 여과 용량의 필터(Fig. 2). 전체 이온 액체 염색 프로토콜을 실시할 수 있는 표준 실험실에서 약 15 분에 맞는 내부 biosafety 캐비닛(Fig. 2c,디). 에는 스퍼터 코팅 SEM,너무 얇은 층의 원인이 가난한 전도하고,충전하는 동안 너무 두께의 층을 가린다는 것입니다., 두께 사용에 대한 사전 코팅 기판할 수 있습이 훨씬 더 큰 것보다는 스퍼터 코팅으로 사용한 생물학적 표본을 보장하기 위해,좋은 전도도,이렇게 긴 필터로 모공을 차단되지 않습니다. (그림. 2e-k,보충도. S2).

이 조사에서는 우리가 사용하의 코팅 18 27nm 알고 Au 각각 때문에 이러한 두께는 것을 발견 했을 방지하기에 충분한 위탁에 비해 코팅 필터(보충 Fig. S2). 이러한 최소 두께를 갖는 기판은 반짝이는 금속 코팅으로 볼 수 있기 때문에 쉽게 선택되었다., 면 코팅의 미만 27nm Au 또는 18nm 에 대해 알 존재,그들은 불투명한 또는 평면색 외관(Fig. 2). 을 가진 이온 액체 염색을 사용하여 이러한 금속을 입히는 필터를,우리가 할 수 있었다 시각화하는 미세 구조적 정보의 박테리아 같은 flagellae 의 살모넬라에는 20nm 직경,SEM(Fig. 2j,k,보충도. S3).,

얻은 결과로 여과하고 간단한 이온성 액체의 침투를 위해 SEM 주에 비해 품질에서 기존 스퍼터 코팅에 SEM 및 부정적인 염색 TEM 의 다양한 세균 및 바이러스의 표본을 포함 Leptospira,살모넬라,vaccinia 바이러스와 에볼라 바이러스(Fig. 1,보충 그림. S3-S5)7,16,31,32. 우리가 발견되었다는 훨씬 적은 수축량의 이온성 액체 침투 박테리아와 바이러스에 비해 두 탈수 sputter 코팅 SEM 준비 및 TEM 묻은 부정적인 이미지(표 1)., 모든 경우에 탈수 된 SEM 스퍼터 코팅 및 음성 염색 TEM 미생물의 치수는 이온 성 액체 처리 된 표본보다 9.9%내지 18.9%작았다(표 1). 이전에 조사를 우리가 이미지 frozen-유리화 에볼라 바이러스에 의해 cryo-전자 현미경의 직경의 에볼라 바이러스로 측정되었다 96-98nm16 와 매우 유사하의 가치 98.5±10.2nm 직경 측정의 동일한 표본 처리와 이온 액체에 존재하는 연구이다., 이는 그의 볼륨이온성 액체 침투 샘플은 그 비교 측정에서 냉동 수산화 조건과 밀접하게 반영하는 완전히 수화한 기본 상태의 에볼라 바이러스입니다. 에 대한 bacilliform 구조,10%가 감소하는 차원에서 동일 27%감소에서의 볼륨으로 탈수,하지만 축소하고 평탄화의 원통 모양의 것이 의미하는 심지어 더 높은 수준의 물 손실이다., 그것은 명확한에서는 이것을 평평하게 하고 붕괴로 인한 탈수가 존재하는 어느 정도에서 모든 이미지의 sputter 입히는 바이러스와 박테리아(Fig. 1).

이미지가 비교적 유사하게 보이지만 금 스퍼터 코팅은 이온 성 액체보다 약간 더 많은 대비를 제공하는 것으로 보입니다. 관찰 가능한 또 다른 차이점은 이온 성 액체 염색 이미지에서 박테리아 세포벽의 표면 거칠기가 적다는 것입니다. 이것은 살모넬라 균의 이미지에서 볼 수 있습니다(그림 1). 1,보충 그림. S3)., 에서 이러한 이미지는 명확한 질감과를 주름 모양의 표면에 박막을 코팅 세균성 세포와 부드러운 모양에 세포벽의 이온성 액체 침투 준비를 하고 있습니다. 우리가 제안하는 것이 관찰된 차이점은 주로 결과의 손실의 세포 팽 탈수로 인해 볼륨 및 손실에는 스퍼터-코팅 및 표본 따라서 주름을 수 있습니다 실제로 유물이 될 것 또는 기능을 강조해줍니다., 원에 대한 증거이 온다는 사실에서 기타 미세 구조와 같은 flagellae,명확하게 볼 수 있(와 유사한 모양)모두에서 스퍼터-코팅 이온 액체 취급의 표본이 아니다. 따라서,결과의 이전 연구를 사용하여 스퍼터 코팅의 박테리아야 할 수 있습니다 조심스럽게 다시 해석의 빛에 가능한 탈수 효과.

본 조사에서 제시된 이온 성 액체 절차는 시편 필터를 미리 준비 할 수 있기 때문에 신속하고 재현성이 있습니다., 으로 이온 액체에는 매우 낮은 수증기 압력,추가 이점은 건물과 같은 수축량,주름지거나 부수되는 동안 발생할 수 있습 SEM 관찰을 피할 수 있다(표 1,충 Fig. S3). 미래에 우리가 예상의 개발의 다양한 종류의 필터 코팅을 더욱 향상 SEM 기술을 사용하여 이온 액체 염색에 대한 생물학적 표본들로서 나노미터 크기의 범위에 있습니다.피>