ミツバチ毒とメリッチンは、HER2濃縮およびトリプルネガティブ乳癌における成長因子受容体活性化を抑制します

化学試薬および抗体

ハチ毒コレクション

毒は、Apidミツバチのいくつかの異なる集団から労働者または女王を使用して収集されました。, ヨーロッパのミツバチ（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）とバフテールマルハナバチ（Ｂｏｍｂｕｓｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓａｕｄａｘ）から採取した毒サンプルは，パース（オーストラリア），ダブリン（アイルランド），ロンドン（イギリス）から採取した。 ミツバチ毒は、記載されているように養蜂場や農場から三つの異なるコロニーのそれぞれの30人の労働者から収集されました。 オーストラリア産のミツバチ毒は、西オーストラリア大学（UWA：-31.980151、115.817919）にある統合蜂研究センター（CIBER）によって維持された養蜂場から収集された。, アイルランドからのミツバチ毒は、トリニティ-カレッジ-ダブリン（53.343933、-6.254635）の養蜂場の一つのコロニーと、グラスネヴィン（53.383245、-6.276333）とブランチャーズタウン（53.384220、-6.375979）の近くの農場から集められた。 英国からのミツバチおよびマルハナバチ毒は、ロンドンのロイヤルホロウェイ大学（51.425626、-0.562987）で収集された。 マルハナバチ毒は、20人の労働者から2つの商業的に購入されたコロニーのそれぞれから収集され、これら二つのコロニーのそれぞれからの単一のクイーンマルハナバチ毒の収集に使用された。, 独立した生物学的マスターミックスは、異なるコロニーからの毒を別々に保つことによって調製され、合計で収集された312蜂の毒であった。

手動解剖により腺毒を採取した。 ミツバチはミツバチのために巣の入り口近くで捕獲され、マルハナバチのためにコロニーから直接捕獲され、二酸化炭素で麻酔され、氷上で冷やされた。 スティング装置を各個体から解剖し、次いで毒腺を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に入れた。, 腺をテルモ針（25G×5/8）で穿孔し、遠心分離（13,000g、10分、4℃）し、上清を回収し、液体懸濁液中に毒を含んだ。 各マスターミックスのタンパク質濃度を、洗剤適合性タンパク質アッセイ（Bio-Rad）で定量し、750nmの吸光度をMillennium Science BioTek PowerWave XS2（Gen5 1.11ソフトウェア、バージョン1.11.5） 次いで、各マスターミックスをアリコートし、-80℃で保存した。,

細胞株および培養条件

すべての細胞株は、American Type Culture Collection(Manassas,VA,USA)から購入したが、Invitrogen(Thermo Fisher Scientific,Victoria,Australia)から購入したHEK293FT細胞、Asterand Bioscience(Detroit,MI,USA)から入手したSUM149およびSUM159、およびT11およびB.15細胞は、ノースカロライナ大学のチャペルヒルおよび国立研究所のCharles PerouおよびLyuba Varticovskiによって親切に提供されたものを除いて、American Type Culture Collection(Manassas,VA,USA)から購入した。健康、それぞれ。 T11およびB.15は非常によく特徴付けられた細胞株である37,38。,

細胞を37℃および5％CO2でインキュベートし、1％抗生物質–抗真菌薬を補充した。 HDFa（正常な原発性成人ヒト皮膚線維芽細胞）細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）とDMEMで培養した。 MCF10AおよびMCF-12A（ヒト乳腺不死化上皮細胞、非変換）は、DMEM/F-12サプリメント（5％胎児馬血清、20ng/mL表皮成長因子、10μg/μlインスリン、100ng/mLコレラ毒素、および500ng/mLヒドロコルチゾン）で維持された。 NIH/3T3（マウス胚性線維芽細胞）細胞は、10％FBSとDMEMで維持された。, HEK293FT（ヒト胚腎293細胞SV40大型T抗原を安定に発現）は、10％FBSおよびサプリメント（1％グルタミンおよび0.4mg/mL G418ジェネチシン、Gibco）とDMEMで培養した。 MCF7（ヒト内腔A乳癌）は、10％のFBSおよびサプリメント（ピルビン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、および非必須アミノ酸のそれぞれ1％）とMEM αで維持された。 T-47DおよびZR-75-1（両方のヒト管腔a乳癌）は、10％FBSとRPMIで培養した。 MDA-MB-231（ヒトクローディン低乳がん）は、10％FBSを有するDMEMで培養した。, SUM149（ヒト基底様乳癌）は、F-12で10％FBSで培養した。 SUM159（ヒトクローディン-低乳癌）は、F-12で5％FBSおよびサプリメント（5μg/mLのインスリンおよび1μg/mLのヒドロコルチゾン）で培養した。 MDA-MB-453（ヒトHER2濃縮乳がん）は、10％FBSとDMEMで培養しました。 SKBR3（ヒトHER2濃縮乳がん）10％FBSと1％ピルビン酸ナトリウムとRPMIで培養しました。 p53-T11（マウスクローディン-低乳癌）は、RPMI1640培地で10％FBSを維持した。 BRCA-B.15（マウス基底様乳癌）は、RPMI1640培地で10％FBSを維持した。,

細胞生存率アッセイ

細胞生存率は、サプライヤーのプロトコルに従って発光細胞生存率アッセイによって決定された。 細胞を96ウェル培養プレートにめっきし、37℃および5％CO2で24時間インキュベートした。用量応答アッセイのために、培地を廃棄し、示された濃度のハチ毒またはペプチドを含む培地に置き換え、24時間培養した。, 60分以上の細胞生存率については、細胞をミツバチ毒またはメリッチンのIC50で各細胞株に対して1時間以上の短い時間間隔で処理し、治療直後 生存率を決定するために、細胞をCellTiter-Glo(CTG)2.0試薬で10分間インキュベートした。 細胞生存率は、EnVision2102Multilabel Reader（PerkinElmer）を用いて発光を測定することによって定量した。 実験は生物学的複製で行った（n=3）。,

メリッチンに対する一次モノクローナル抗体の産生

抗体産生は、Harry Perkins Institute of Medical Researchの動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って 雌のＡ／Ｊマウスをオーストラリアで採取したミツバチ毒で免疫した。 マウスは12μgの毒を完全フロイントアジュバント（Difco）で腹腔内注射し、29日目に不完全フロイントアジュバントをブーストし、7日目に49ΜG/マウスでPBSを水性ブーストした。 マウスを60日目に採血し、血清をELISAによって試験した。, 最高のレスポンダーは、融合の7日前にPBSでミツバチ毒の4μgでブーストされました。 脾臓細胞は、標準的な手順82に従ってSp2/O骨髄腫細胞と融合した。 抗体containing有上清をＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。 ハイブリドーマクローン3B9は、さらなる研究のために選択さ 抗体はハイブリドーマ血清無料培地（Ｇｉｂｃｏ）中のバイオリアクター中のハイブリドーマ細胞を増殖させることにより産生された。 抗体をプロテインＧ-セファロースクロマトグラフィーで精製した。 精製された抗体をpbs（pH7.3）で透析した。 この抗体は、以後、抗メリッチン抗体（3B9）と称された。,

Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)

毒およびペプチドを透明な曲線ベースの96ウェルプレートに炭酸塩緩衝液中で5μg/mLでめっきし、4℃で24時間インキュベートし、液体を除去し、0.05%TWEEN-20(“Tween-20,Sigma-Aldrich)pbs中の溶液中で三回洗浄した。 一次抗体を1:2希釈液中の10μg/mL（pbs中の0.1％ウシ血清アルブミン（BSA））から始まる希釈でウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。 一次抗体を除去し、プレートを0で三回洗浄した。,05%Tween-PBSで20. ポリクローナルヤギ抗マウスIggβ鎖特異的二次抗体をウェル（希釈剤中1：1000）に添加し、室温で1時間インキュベートした。 一次抗体を除去し、プレートを0.05％Tween-20PBSで三回洗浄した。 ELISA現像緩衝液、10％クエン酸（pH4.2）、2％ABTS、および0.1％H2O2を含む精製水の溶液をウェルに加え、プレートを室温で暗所で15分間培養した。, 吸光度を405nmで記録したのは、WALLAC1420Managerソフトウェア（PerkinElmer）を備えたVICTOR Light plate readerを使用したものである。 対照は、マウスモノクローナルIgG抗体（28/00 8C1-6）をヒトIL-12と反応させ、ELISAプレート上のメリッチンペプチドに適用した。 実験は生物学的複製で行った（n=3）。

抗メリッチン抗体競合実験

HDFaおよびSUM159細胞を96ウェル培養プレートにメッキし、37℃および5％CO2で24時間インキュベートした。, 抗メリッチン抗体の濃度を増加させることにより、IC50濃度のミツバチ毒またはメリッチンを各細胞株に対して室温で1時間インキュベートし、次いで24時間細胞に添加した。 実験は生物学的複製で行った（n=3）。

ウェスタンブロット

細胞は6ウェルプレート上に300,000セル/ウェルの密度でメッキし、37℃および5％CO2で24時間インキュベートした。, 細胞培養実験を記載のとおりに実施し、次いで、標準的なＷｅｓｔｅｒｎｂｒｏｔプロトコルを本明細書に記載のとおりに従った。 細胞を冷たいPBSで洗浄し、冷たいタンパク質溶解緩衝液（2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、125mmol/L Tris-HCl、pH6.8）で溶解した。 サンプルは10mAで10sのために超音波処理し、洗剤適合性タンパク質アッセイ（バイオラッド）で定量タンパク質濃度をしました。 同量の蛋白質を還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加した負荷緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液，Ｂｉｏ-Ｒａｄ）と混合した。, タンパク質サンプルを95℃で5分間沸騰させ、ミニプロテアンプレキャストゲル（Bio-Rad）にロードし、100Vで電気泳動を行い、トランスブロットターボトランスファーシステム（Bio-Rad）でPVDF膜（Bio-Rad）に7分間転送した。 膜は、非特異的結合をブロックするためにTBST（20mM Tris-HCl、pH7.4、150mM NaCl、および0.1％Tween-20）5％無脂肪ミルクとインキュベートしました。 膜を4℃で一晩インキュベートし、一次抗体を3％BSAおよび0.02％アジ化ナトリウムで希釈した。, このシグナルは、Image Labソフトウェア（Bio-Rad、バージョン6）を実行しているChemiDoc MP Imaging System（Bio-Rad）を使用してLuminata Crescendo Western HRP基板（Millipore）で検出しました。 ウェスタンブロットは同じ実験から導出され，並行して処理された。 ウェスタンブロットの未クロップスキャンは、補足図に提供されています。 10–15.

フローサイトメトリー

アポトーシスおよび壊死は、製造業者のプロトコルに従ってAnnexin V-FITCアポトーシス検出キットI（BD Biosciences）を用いて評価した。 SUM159細胞を6ウェル培養プレートに24時間めっきした。, 次いで培地を廃棄し、ミツバチ毒またはメリチン（IC50濃度）を含む培地に置き換え、60分間培養した。 細胞をトリプシンおよび培地で回収し、遠心分離（1000g、5分、24℃）し、冷たいPBSで洗浄し、遠心分離（1000g、5分、24℃）し、1×結合緩衝液中に再懸濁した。 細胞を1×結合緩衝液中で1万細胞/mLの濃度に調製した。 試料を、暗所でFITCおよびPI（各5μl）と共に15分間培養した。, 生細胞、死細胞、アポトーシス細胞または壊死細胞の存在を、BD Accuri C6サイトメーター（BD Biosciences、San Jose、USA）でBD Accuri C6ソフトウェアを用いて評価し、FlowJo（商標）（Ashland、USA、Windowsバージョン7） 実験は生物学的複製で行った（n=3）。 ゲーティング戦略は、補足図に示されています。 16.

生細胞顕微鏡

SKBR3細胞をガラス底のマイクロウェル皿（10×35mm、MatTek）にめっきし、24時間インキュベートした。, マイクロウェル皿は、NIKON Eclipse Ti共焦点顕微鏡ステージトップインキュベーションチャンバー（37℃および5％CO2）で20分間平衡するために残されました。 20×対物レンズをコーラーアライメントで使用し、オーストラリアで採取したミツバチ毒のIC50で処理した後、10分前から1時間ごとに画像を撮影した。, 著者らは、国立イメージング施設、国立共同研究インフラストラクチャ戦略（NCRIS）機能、およびオーストラリア顕微鏡&顕微鏡特性分析センター（CMCA）、Uwa、大学、州および英連邦政府によって資金提供される施設の両方で提供される施設および科学技術援助を認めている。,

走査型電子顕微鏡

ガラスカバースリップ（直径12mm、Menzel、Thermo Fisher Scientific）をポリ-l-リジン臭化水素化合物（Sigma-Aldrich）で20分間塗装し、精製水で二回洗浄した。 SUM159細胞を62,500細胞/ウェルの密度でガラススライド上にめっきし、37℃および5％CO2で24時間インキュベートした。細胞をPBSで二回洗浄し、次いでビヒクルまたはIC50濃度のミツバチ毒およびメリチンで1時間処理した。, 細胞をpbsで二回洗浄し、次いでPBS中の4％ホルムアルデヒドで25分間固定した後、pbsで再び三回洗浄した。 顕微鏡検査の準備として、サンプルを2.5％グルタルアルデヒドに浸漬し、4℃で2時間インキュベートした。(50%, 70%, 95%, 100%, そして、100％絶対”乾燥”エタノール）。 各浸漬の間に、サンプルを特殊なマイクロ波（PELCO、BioWave34700実験室マイクロ波システム）で脱水した。, 脱水プロセスは、臨界点乾燥装置E3000で完了し、試料中のエタノールを超臨界CO2に置き換えました。 の加工coverslips装SEMマウント(ProSciTech)カーボン機能です。 試料を3nmの白金でコーティングして、それらを電子的に導電性にした後、CMCA、UWAの走査型電子顕微鏡（Zeiss1555VP-FESEM）下で可視化した。 画像は、2.6mmの作動距離、30μmの開口、および5kVの加速電圧でレンズ内検出器で撮影されました。, 画像は、画像解析ソフトウェアFIJI(ImageJ)83を用いて解析した。

免疫蛍光

ガラスカバースリップ（直径12mm、Menzel、Thermo Fisher Scientific）を24ウェルプレートに入れ、ポリ-l-リジン（Sigma-Aldrich）で20分間塗布した後、精製水で二回洗浄した。 SUM159細胞は、ガラススライド上にメッキし、37℃と5％CO2で24時間インキュベートしました。細胞は、車両、またはミツバチ毒、メリッチン、RGD1-メリッチン、およびデデ-メリッチンのメリッチンとして同等のモル濃度で30分間処理しました。, 細胞をpbsで二回洗浄し、次いでPBS中の4％パラホルムアルデヒドで25分間固定した後、pbsで再び三回洗浄した。 非特異的抗体結合は、室温で5％正常ヤギ血清（サーモフィッシャー科学）PBSで1時間を使用してブロックされました。 モノクローナル抗メリッチン抗体（5μg/mL）および抗EGFR（Abcam）の1：500を含む一次抗体を細胞に添加した。 サンプルを4℃で一晩穏やかにロッキングしてインキュベートした。, 細胞をPBSで三回洗浄した後、1:500のAlexa Fluor488ヤギ抗マウス二次抗体、1:500のAlexa Fluor594ヤギ抗ウサギ二次抗体、およびHoechst(1:5000)を室温でPBSで1時間インキュベートした。 共焦点蛍光Ｎｉｃｏｎ Ｔｉ-Ｅ倒立顕微鏡を用いてスライドを撮像した。 画像は20×air対物レンズを用いて撮影した(NA0.,75)、および405nm(Hoechst34580)、488nm(Alexa Fluor488二次抗体)、および561nm(Alexa Fluor594二次抗体)の波長を用いた逐次励起を行うことができる。 画像は、NIS-C Elementsソフトウェアを使用して収集し、CMCA83のFIJI(ImageJ)を使用して処理した。

生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）

受容体–リガンド相互作用は、previously84、85に記載されているものと同様の方法を用いて、BRETで評価した。, BRETは、ルシフェラーゼによる基質酸化およびそれに続く光の放出の後、ドナールシフェラーゼまたはアクセプターフルオロフォアのいずれかで標識された二つのタンパク質または目的の分子間のエネルギー（双極子–双極子）の非放射的な移動を含む54。 ＦＩＴＣタグをｍｅｌｉｔｔｉｎ（ＦＩＴＣ-ｍｅｌｉｔｔｉｎ）およびＤＥＤＥ-ｍｅｌｉｔｔｉｎ（ＦＩＴＣ–ＤＥＤＥ-ｍｅｌｉｔｔｉｎ）のＮ末端にコンジュゲートした。 HEK293細胞は安定してSV40大きなT抗原（HEK293FT）を発現し、6ウェルプレート上に550,000細胞/ウェルの密度で24時間メッキした。, HEK293FT細胞は、フーゲンを用いてNanoLuc-EGFRのcDNAを含むプラスミドをトランスフェクトした。 簡単に言えば、プラスミドcDNAを室温で10分間、トランスフェクション試薬と無血清DMEMを混合し、10ng/μl NanoLuc-EGFR:4μlのFuGENE:100μlのSFMの比でインキュベートした。 混合物をHEK293FT細胞に10ng/μl NanoLuc-EGFRの最終濃度で6ウェルプレートのウェル当たり加え、24時間インキュベートした細胞をPBSで洗浄し、トリプシンで分離し、次いでフェノールレッドフリーdmem中の5%ウシ胎児血清を含む培地中で回収した。, セルは50,000セル/よくポリl-リジンコーティング96ウェル白板にメッキし、24時間インキュベートしました。

リアルタイムリガンド会合速度論実験のために、培地を細胞から除去し、次いで、NanoLuc基質フリマジンの50μl/ウェルでインキュベートし、Hank’S Balanced Salt Solution（HBSS）で希釈した最終濃度10μmまでインキュベートした。, 次いで、細胞をCLARIOstarプレートリーダー（BMG Labtech、Australia）で5分間平衡して、基礎測定値を記録した。 リガンド（TAMRA-EGF、FITC-melittin、およびFITC–DEDE-melittin）を正しい最終濃度の範囲に加え、NanoBRET記録を90秒ごとに60分37℃で飽和実験のために、培地を細胞から除去し、TAMRA-EGF、FITC-melittin、およびFITC–DEDE-melittinの濃度の範囲を標識されていないEGFの競合濃度（1μm）の存在または非存在下で添加し、37℃で60℃でインキュベートした。暗闇の中で分。, フリマジンを10μmの最終濃度で添加した。 記録は、Ｌｕｍｉｓｔａｒオメガ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて行った。 データは、短波長放出（ドナー）に対する長波長放出（アクセプター）の比から導かれた”生のBRET比”として提示される。 実験は生物学的複製で行った（n=3）。

併用薬物効果の分析

ミツバチ毒またはメリチンをドセタキセルと組み合わせ、T11細胞において24時間非定数比で示された濃度で投与した。, 細胞生存率は、前述したように、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ-Ｇｌｏを使用して評価した。 ミツバチ毒またはメリチンとドセタキセルとの併用効果を、CompuSynソフトウェア（ComboSyn）を用いた中央値の用量効果法によって評価した。 この方法は、二つの薬剤間の組み合わせの効果に基づいてCIを決定する（ここで、CI<1は相乗的であり、CI>1は拮抗的であり、CI=1は相加的である）56。 実験は生物学的複製で行った（n=3）。,

動物モデルおよび治療

これらの動物実験は、UWAの動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って行われた。 クローディン低乳がんの高度なモデルをシミュレートするために、2.5×105T11細胞は、無血清培地とBDマトリゲルマトリックス高濃度（BDバイオサイエンス）1：1 100μlの総容積に懸濁し、5週齢BALB/cJ女性（動物資源センター、WA、オーストラリア）の側面に皮下注射26グラムの針を使用して。, 使用されたT11細胞は、zsgreen-ルシフェラーゼ構築物でlentivirally形質導入し、ルシフェラーゼ陽性細胞の99％よりも優れた濃縮を達成するために三回ソートされました。 メリチンをMilli-Q水+5%デキストロースに懸濁した。 ドセタキセル（粉末中）を25％TWEEN80（Sigma-Aldrich）に懸濁し、75％の混合物を15.25：84.75（v/v）溶液の絶対エタノールおよび精製水に懸濁し、-20℃に保った。処理の直前に、ドセタキセルをMilli-Q水+5％デキストロースで必要な最終濃度で新たに希釈した。, T11腫瘍（-50mm3）の生成後三日、マウスを4群（n=12マウス/群）に無作為化した。 処置は日にintratumorally注入されました3, 5, 7, 9, 11, 13, および15t11細胞の接種後、ビヒクル、メリッチン（5mg/kg）、ドセタキセル（7mg/kg）、またはメリッチン（5mg/kg）およびドセタキセル（7mg/kg）の組み合わせを用いた。 動物を2日ごとに腫瘍の大きさについてモニターし、体積を修正された楕円体式（体積＝幅2×長さ／2）によって計算した。 腫瘍が800mm3に達したとき、動物は人道的に犠牲にされた。,

腫瘍の免疫組織化学的分析

腫瘍組織は、4％パラホルムアルデヒドに固定され、PBSで三回洗浄し、70％エタノールに残した。 腫瘍はパラフィンに埋め込まれ、5μ mセクションを調製した。 ヘマトキシリン/エオシン染色では、スライドを脱ろうし、エタノールの減少溶液バンクを用いて水和し、Gill’s hematoxylinで染色し、70％エタノールを用いて脱水し、エオシンで染色し、さらに100％エタノールを用いて脱水し、トルエンを用いてクリアし、Acrymount IHCマウンティングメディア（StatLab）を用いてカバースリップに取り付けた。, Ｔｕｎｅｌアッセイ（Ｉｎｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ）によって組織切片中の腫瘍細胞アポトーシスを決定した。

生物発光イメージング

治療によるin vivo腫瘍増殖の変化を正確に追跡するために、我々はCMCA、UWAのCaliper IVIS Lumina IIイメージングシステムを用いて生物発光 分析は、腫瘍の発生後2日ごとに行われた。 マウスは、200μlのD-ルシフェリン（ケイマン化学）をpbsに溶解した150mg/kgの最終濃度で腹腔内に注入し、4％イソフルランで麻酔した。, 麻酔をかけると、マウスを生物発光イメージャーの予温室の中に入れ、注射後7-12分、2％イソフルランの下で、生物発光シグナル強度が定常状態に達するまで

統計分析

すべてのデータは、少なくとも三重に実施された複数の実験から導出された。 統計解析は、GraphPad Prism v8(GraphPad Software Inc.Office Excel365(Microsoft)、およびSPSS予測分析ソフトウェア(IBM、バージョン26)。, 細胞生存率アッセイのために、データは、GraphPad Prismで導出されたIC50sで、100％の生存率と考えられていたビヒクル状態の平均発光に正規化されました。 処置されたT11腫瘍における免疫組織化学について、p-HER2（Tyr1248）およびp-EGFR（Tyr1068）を検出するために、ビヒクルを100％に正規化した。, 適切かつ本文に示されているように、統計的有意性は、対になっていない両側学生のt検定、多重比較のためのtukeyのHSD事後検定補正を伴う対になっていない一方向ANOVA、SidakまたはTukeyの多重比較検定に続く反復測定を伴う双方向ANOVA、または一般化線形モデル（GLM）を用いて決定された。 すべてのテストで、差はp<0.05(*)、p<0.01(**)、およびp<0.001(***)で有意であるとみなされました。,

レポートの概要

研究デザインに関するさらなる情報は、この記事にリンクされているNature Researchレポートの概要を参照してください。