le microscope électronique à balayage en microbiologie et diagnostic des maladies infectieuses

pour produire une surface électriquement conductrice pour SEM, les échantillons biologiques sont souvent REVÊTUS À l’aide d’une évaporation de film mince ou d’une pulvérisation de carbone ou de métal dans Ce procédé de revêtement peut masquer de fins détails ultrastructuraux, en fonction de l’épaisseur de la couche déposée (généralement 2-20 nm)., Ces procédures conventionnelles sont difficiles à réaliser sur des échantillons microbiologiques typiques, qui sont généralement des suspensions de petites particules biologiques dans l’eau (<100 nm pour la plupart des virus, ou dans la plage de taille inférieure au micromètre pour de nombreuses bactéries, champignons et parasites). Un autre problème est que les microbes d’intérêt dans les échantillons de patients ou les échantillons environnementaux peuvent être présents à des concentrations relativement faibles, ce qui rend l’observation de ceux-ci sur une surface difficile.,

dans ce rapport, nous décrivons les méthodes de concentration des suspensions microbiennes pour l’observation des MEB sur des substrats filtrants pré-enduits. Nous montrons que, au lieu d’un revêtement par pulvérisation cathodique, un liquide ionique (tétrafluoroborate de 1-butyl-3-méthylimidazolium) dilué dans de l’eau peut être utilisé pour infiltrer rapidement un échantillon de SEM microbiologique, formant une surface conductrice électron-lucente, ce qui empêche la charge de l’échantillon et donne de bons résultats avec des échantillons microbiens (Fig. 1)., Les liquides ioniques sont des sels hautement conducteurs qui restent à l’état liquide à température ambiante et ont une pression de vapeur négligeable (≤5 × 10-9 Torr). Dans les conditions de vide poussé d’un SEM moderne (≤1 × 10-6 Torr), les liquides ioniques restent à l’état liquide et ne s’évaporent pas pendant le fonctionnement,tout en étant conductives19,20,21,22, 23. Les liquides ioniques les plus utiles pour les applications en SEM biologique ont une conductivité électrique d’environ 100 mScm−1, sont électrochimiquement stables (ayant une fenêtre électrochimique d’environ 5,8 V), ainsi que solubles dans l’eau et sont facilement synthétisés24., Il a été précédemment démontré que les liquides ioniques présentant ces propriétés donnent un contraste D’image SEM comparable à l’utilisation d’un revêtement en métal et en carbone lorsqu’ils sont utilisés avec des échantillons isolants19,25. Ils ont également été utilisés pour l’imagerie macroscopique de spécimens biologiques, tels que les algues, les cellules de culture tissulaire et les chromosomes condensés20,21,22. Des substrats conducteurs tels que l’oxyde d’indium-étain, le papier d’aluminium ou les lamelles à revêtement métallique ont été utilisés pour empêcher la charge20, cependant, ces matériaux ne conviennent pas à la filtration pour les enquêtes SEM sur les microbes., Nous avons découvert que, pour des résultats optimaux en utilisant du liquide ionique avec des objets subcellulaires tels que des virus ou des flagelles bactériens, un revêtement préalable des filtres en polycarbonate avec de l’aluminium ou de l’or était nécessaire. Nous n’avons détecté aucune dérive d’échantillon lors de l’utilisation d’échantillons biologiques colorés par un liquide ionique, car ils étaient bien soutenus par la membrane conductrice utilisée lors du processus de filtration initial. Les filtres en polycarbonate SPI-pore sont hydrophiles et le restent après le revêtement métallique, ce qui en fait un substrat idéal pour travailler avec des échantillons biologiques hydratés., La coloration liquide ionique peut également être effectuée dans une armoire de sécurité biologique, offrant une alternative rapide et sûre au revêtement par pulvérisation cathodique lors du travail avec des échantillons infectieux, car l’équipement de revêtement sous vide peut provoquer des aérosols et n’est pas facilement contenu20,21,22. Nous avons élégamment résolu le problème de la concentration de l’échantillon et de la prévention de la charge, par revêtement métallique du substrat filtrant lui-même avant l’application de l’échantillon biologique (Fig. 2). En l’absence de couche mince des échantillons, une infiltration avec des liquides ioniques était également nécessaire pour éviter la charge., Les résultats sont comparables avec L’utilisation de SEM avec revêtement par pulvérisation cathodique et de TEM avec technique de coloration négative (fig. 1 et 2: fig. S1–S5 supplémentaires). L’ultrafiltration est une étape importante car elle permet d’éliminer les débris qui peuvent masquer les détails des virus ou des bactéries présents dans les échantillons biologiques. Dans le présent rapport, nous démontrons une imagerie claire des virus et des flagelles bactériens dans des échantillons SEM non revêtus, ce qui nécessitait auparavant une déshydratation et un revêtement par pulvérisation cathodique pour atteindre, élargissant ainsi la résolution et la gamme d’échantillons microbiens pouvant être étudiés avec SEM.,

div côté main) pour l’observation des microbes: (a) Leptospira biflexa, (B) Salmonella Senftenberg, (c) vaccinia et (d) virus Ebola. Les images SEM dans les panneaux latéraux de gauche étaient des spécimens qui ont été aspergés d’or, sur des filtres simples non enduits., Les images dans les panneaux centraux étaient des échantillons traités avec du liquide ionique après dépôt sur des filtres en aluminium pré-revêtus. Sur le côté droit, images TEM de spécimens similaires préparés en utilisant la coloration négative du tungstate de méthylamine.

la Préparation d’échantillons biologiques pour la SEM.

(a) les composants de l’Unité de filtrage sont présentés avant l’assemblage., L’image de Sem d’encart montre un filtre enduit d’or à fort grossissement avant qu’un spécimen soit appliqué. Notez que le filtre est propre et que les pores sont évidents. (b) l’Unité de filtration est représentée après assemblage et en cours d’utilisation avec une pompe à seringue dans une armoire de biosécurité (c,d). La flèche bleue en (d) pointe vers l’Unité de filtrage. e) Images de filtres sur lesquels du métal s & apos; est évaporé. L’épaisseur de l’Al est de 18 nm 9 nm et l’Ua est de 27 nm 9 nm d’épaisseur. Pour le filtre avec les deux métaux l’épaisseur de l’Al et de l’Ua sont 18 nm et 27 nm, respectivement., (f) SEM et (g) la carte élémentaire correspondante générée par microanalyse aux rayons X d’une région similaire à celle mise en évidence par le rectangle pointillé en (e). (H-k) images SEM de salmonelles colorées avec un liquide ionique illustrant l’effet de différents types de métaux et l’épaisseur du métal évaporé sur les images finales enregistrées (h Al 9 nm, I Au 9 nm, j Al 18 nm, k Au 27 nm). Les flèches rouges indiquent flagellae.

Les images de bactéries colorées avec du liquide ionique avaient une topographie de surface plus lisse que celles qui étaient déshydratées et recouvertes de gicleurs., Les mesures de taille montrent que les échantillons déshydratés ont diminué d & apos; environ 10 à 20% (Tableau 1). Nous interprétons le détail de la surface sur les bactéries déshydratées et recouvertes de sputter comme un plissement de la paroi cellulaire dû au rétrécissement, plutôt que l’observation de caractéristiques supplémentaires présentes in vivo: ces rides sont donc susceptibles d’être des artefacts dus au séchage. Les flagelles bactériens étaient également clairement visibles avec un traitement liquide ionique sur les substrats conducteurs (Fig. 1, Fig. Supplémentaire. S3). Ces résultats étaient comparables à ceux que nous avons observés avec un revêtement SEM-sputter et une coloration TEM-négative.,

Les techniques de liquide ionique peuvent également être utilisées en toute sécurité avec des agents pathogènes infectieux, dans une enceinte SEM biologiquement contenue, permettant la caractérisation de nouveaux agents infectieux dans un état plus proche de leur” état natif  » hydraté que par les techniques conventionnelles de préparation d’échantillons8. Dans le cas de cette enquête, notre protocole conventionnel impliquait la déshydratation dans les séries d’éthanol, suivie d’un séchage à l’air et d’un revêtement métallique avant l’imagerie SEM., Pour le protocole liquide ionique, l’échantillon biologique avait une goutte d’une solution aqueuse à 2,5% de tétrafluoroborate de 1-butyl-3-méthylimidazolium placée directement sur celui-ci. Après buvardage pour éliminer l’excès de liquide, l’échantillon humide a ensuite été placé directement dans le SEM. Lorsqu’il s’agit d’échantillons infectieux, une étape supplémentaire de fixation de l’aldéhyde est nécessaire pour la procédure conventionnelle afin d’éviter le risque d’aérosols infectieux qui pourraient être générés pendant le processus de revêtement par pulvérisation cathodique., Cette étape de fixation n’est pas nécessaire avec la technique du liquide ionique, puisque l’échantillon peut être traité dans une hotte de confinement biologique et ensuite être placé directement dans un MEB dans une enceinte MEB biologiquement contenue8, pour l’imagerie dans un état non fixé, hydraté, qui est beaucoup plus proche de l’état natif de l’organisme. La microscopie complète les tests de diagnostic classiques qui peuvent manquer des souches nouvelles ou variantes3,26,27,28 et permet d’identifier rapidement le type d’organisme présent, guidant la sélection de tests plus spécifiques29., Cependant, la microscopie électronique nécessite généralement une concentration minimale de particules pour une identification fiable des microbes. Pour les virus, c’est entre 105 et 106 particules virales/mL4,5. Avec les techniques de filtration, les TEM et les SEM des virus peuvent être réalisés avec aussi peu que 5000 particules par échantillon7.

la coloration liquide ionique sur les filtres pré-enduits est largement applicable à tout échantillon biologique pouvant bénéficier d’une filtration pour concentrer les particules d’intérêt., L’utilisation de filtres revêtus de métal avec plus d’un type de revêtement sur différentes zones permet de sélectionner celui de ces revêtements qui donne les résultats optimaux pour l’observation d’un spécimen particulier ou de caractéristiques spécifiques et permet de gagner du temps (Fig. 2 bis, e-k). Par exemple, après coloration liquide ionique, les flagelles bactériens sont apparus plus brillants contre le substrat revêtu D’Al, tandis que sur la zone revêtue D’Au du filtre, le contraste est inversé et les flagelles sont apparus plus foncés (Fig. 2h-k)., De même, les images du virus Ebola et de Leptospira biflexa montraient des détails topographiques de bonne qualité lorsqu’elles étaient imagées avec un filtre revêtu d’aluminium, mais le matériel biologique avait moins de détails et apparaissait sous la forme d’une silhouette plate sombre lorsqu’elles étaient imagées sur des filtres revêtus d’or (Figs supplémentaires S4 et S5). Nous proposons que cela soit dû au signal d’émission d’électrons secondaires plus élevé de L’Au par rapport à L’Al. Dans cette enquête, nous avons recueilli des images SEM avec le détecteur d’électrons secondaires, qui est le plus couramment utilisé pour l’imagerie de routine avec des échantillons biologiques., En SEM, le coefficient d’émission d’électrons secondaires (δ) est relativement constant quel que soit le numéro atomique. Cependant, une exception est avec Au, pour lequel δ est presque le double de Al et de nombreux autres éléments. La valeur de δ est également affectée par l’énergie du faisceau: à 20 kV, δ est 0,1 pour Al et 0,2 pour Au30. En mesurant l’intensité dans des images d’électrons secondaires prises à 4 kV avec Al et Au dans la même image (Fig. 2f), nous avons calculé que le signal de L’UA était 2,1 fois l’intensité de L’Al, qui est proche de celle attendue théoriquement., Avec les images enregistrées de spécimens sur les filtres dorés, nous interprétons les résultats comme produisant trop de contraste à partir du substrat de fond, qui avait tendance à masquer les détails fins tels que les flagelles qui apparaissent comme des « silhouettes” sur un fond lumineux. Cependant, les microbes infiltrés par le liquide ionique et le filtre revêtu d’aluminium ont des coefficients d’émission similaires, de sorte que le contraste est largement dû à la topographie plutôt qu’aux différences de composition du matériau, ce qui permet de voir des détails plus fins.,

Le Pré-revêtement des filtres avec du métal n’a pas affecté la taille des pores, ni la capacité de filtration des filtres (Fig. 2). L’ensemble du protocole de coloration liquide ionique peut être effectué sur un banc de laboratoire standard en environ 15 minutes et s’insère dans une armoire de biosécurité (Fig. 2c, d). Dans le revêtement par pulvérisation cathodique pour SEM, une couche trop mince provoque une mauvaise conduction et une mauvaise charge, tandis qu’une couche trop épaisse obscurcit les détails fins., L’épaisseur utilisée pour pré-enduire les substrats peut être beaucoup plus grande que les revêtements de pulvérisation généralement utilisés pour les spécimens biologiques, pour assurer une bonne conductivité, tant que les pores du filtre ne sont pas bloqués. (Figue. 2e–k, Complémentaire Fig. S2).

dans cette étude, nous avons utilisé des revêtements de 18 et 27 nm pour Al et Au respectivement, car ces épaisseurs se sont avérées suffisantes pour empêcher la charge, par rapport aux filtres non enduits (fig. supplémentaire. S2). Les substrats avec ces épaisseurs minimales ont été facilement sélectionnés car ils étaient visibles sous la forme d’un revêtement métallique brillant., Lorsque des revêtements de moins de 27 nm pour L’Au ou de 18 nm pour L’Al étaient présents, ils avaient un aspect opaque ou blanc plat (fig. 2). Avec la coloration liquide ionique à l’aide de ces filtres revêtus de métal, nous avons pu visualiser les détails structurels fins des bactéries, tels que les flagelles de Salmonella, qui ont un diamètre de 20 nm, par SEM (Fig. 2j, k, fig. supplémentaire. S3).,

les résultats obtenus avec la filtration et l’infiltration de liquide ionique simple pour SEM sont très comparables en qualité avec ceux du revêtement par pulvérisation cathodique conventionnel dans SEM et de la coloration négative dans TEM pour une variété d’échantillons bactériens et viraux, y compris Leptospira, Salmonella, virus de la vaccine et virus Ebola (Fig. 1, Fig. Supplémentaire. S3-S5) 7,16,31,32. Nous avons constaté qu’il y avait beaucoup moins de rétrécissement des bactéries et des virus infiltrés dans le liquide ionique que par rapport aux préparations SEM recouvertes de pulvérisation déshydratée et aux images tem colorées négatives (Tableau 1)., Dans tous les cas, les dimensions des microbes TEM déshydratés revêtus par pulvérisation cathodique et teintés négativement étaient de 9,9% à 18,9% plus petites que celles des échantillons traités par liquide ionique (Tableau 1). Dans une étude précédente, nous avons imagé le virus Ebola congelé-vitrifié par cryo-microscopie électronique, le diamètre du virus Ebola a été mesuré à 96-98 nm16, ce qui est très similaire à la valeur de 98,5 ± 10,2 nm pour le diamètre mesuré des mêmes échantillons traités avec du liquide ionique dans la présente étude., Cela démontre en outre que les volumes des échantillons infiltrés de liquide ionique sont comparables à ceux mesurés dans des conditions hydratées congelées et reflètent étroitement l’état natif entièrement hydraté du virus Ebola. Pour une structure bacilliforme, une réduction de 10% des dimensions équivaut à une réduction de 27% du volume due à la déshydratation, bien que l’effondrement et l’aplatissement de la forme cylindrique impliqueraient un degré encore plus élevé de perte d’eau., Il ressort clairement que cet aplatissement et cet effondrement dus à la déshydratation sont présents dans une certaine mesure dans toutes les images de virus et de bactéries enrobés de sputter (Fig. 1).

bien que les images semblent relativement similaires, le revêtement de pulvérisation d’or semble donner un peu plus de contraste que le liquide ionique. Une autre différence observable est moins de rugosité de surface des parois cellulaires bactériennes dans les images colorées par le liquide ionique. Cela peut être vu dans les images de Salmonella (Fig. 1, Fig. Supplémentaire. S3)., Dans ces images, il y a un aspect texturé et ridé clair à la surface des cellules bactériennes recouvertes de gouttelettes et un aspect lisse sur les parois cellulaires des préparations infiltrées de liquide ionique. Nous proposons que cette différence observée est en grande partie le résultat de la perte de turgescence cellulaire due à la déshydratation et à la perte de volume dans les échantillons enrobés de pulvérisation cathodique et que les rides peuvent donc être un artefact ou une caractéristique accentuée par la déshydratation., La preuve à l’appui vient du fait que d’autres structures fines, telles que les flagelles, sont clairement visibles (et d’apparence similaire) dans les échantillons traités par pulvérisation cathodique et par liquide ionique. Ainsi, les résultats d’études antérieures utilisant le revêtement par pulvérisation cathodique de bactéries peuvent devoir être réinterprétés avec prudence à la lumière d’éventuels effets de déshydratation.

la procédure de liquide ionique présentée dans cette étude est rapide et reproductible puisque les filtres d’échantillons peuvent être préparés à l’avance., Comme le liquide ionique a une pression de vapeur très faible, un avantage supplémentaire est que les artefacts de séchage tels que le retrait, le froissement ou la fissuration qui peuvent se produire pendant L’observation SEM sont évités (Tableau 1, fig. supplémentaire. S3). À l’avenir, nous prévoyons le développement d’une variété de différents types de revêtements filtrants pour améliorer encore les techniques de MEB utilisant la coloration liquide ionique pour les échantillons biologiques dans la gamme de taille nanométrique.