pomiar szybkości wzrostu bakterii jest podstawową techniką mikrobiologiczną i ma szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych, a także w zastosowaniach rolniczych i przemysłowych.
bakterie należą do najliczniejszych form życia na Ziemi, są obecne w każdym ekosystemie, w tym w ludzkim ciele. Niektóre gatunki bakterii są również genetycznie wysoce tractable, i zostały wykorzystane jako modele badawcze lub do produkcji naturalnych lub syntetycznych produktów na skalę przemysłową., Jednak nie wszystkie gatunki bakterii mogą być hodowane w laboratorium. Dla tych, którzy mogą, ważną cechą jest szybkość mnożenia lub „Kinetyka wzrostu”.
pomiar tempa wzrostu bakterii może informować naukowców o ich fizjologicznych i metabolicznych funkcjach, a także jest przydatny do uzyskania dokładnej liczby komórek bakterii do dalszych zastosowań.,
ten film przedstawi zasady analizy szybkości wzrostu bakterii, zademonstruje protokół charakteryzujący tempo wzrostu za pomocą „krzywej wzrostu”, a na koniec omówi kilka zastosowań nauki o środowisku do pomiaru kinetyki wzrostu bakterii.
bakterie rozmnażają się zazwyczaj bezpłciowo, mnożąc się przez proste rozszczepienie binarne, w którym jedna komórka rodzicielska dzieli się na dwie identyczne komórki potomne., W sprzyjających warunkach wzrostu, w których składniki odżywcze są dostępne w obfitości, a parametry środowiskowe, takie jak temperatura, sprzyjają wzrostowi, szybkość rozmnażania znacznie przekracza śmiertelność. Powoduje to wykładniczy wzrost.
mierząc ilość bakterii w hodowli w funkcji czasu można uzyskać krzywą wzrostu. Rosnące bakterie w hodowli płynnej w optymalnych warunkach wytwarzają krzywą wzrostu o charakterystycznym kształcie, którą można podzielić na różne fazy., Krzywa zaczyna się od „fazy opóźnienia”, kiedy wzrost jest powolny, podczas gdy bakterie aklimatyzują się do warunków hodowli. Następnie następuje” log „lub” Faza wykładnicza”, kiedy bakterie doświadczają wykładniczego wzrostu. Wzrost ostatecznie zatrzymuje się, gdy składniki odżywcze zostaną wyczerpane i gromadzą się produkty odpadowe, co prowadzi do”fazy stacjonarnej”. Wreszcie, gdy tempo namnażania jest wyprzedzone przez Tempo śmierci komórki, kultura wchodzi w”fazę śmierci”.,
aby skonstruować krzywą wzrostu, liczby bakterii w kolbie płynnej kultury są liczone w różnych punktach czasowych w określonym okresie hodowli. Liczbę bakterii można uzyskać za pomocą wielu różnych metod. Jedną z powszechnych metod jest pomiar gęstości optycznej – czyli „OD” – 600, czyli absorbancji światła w roztworze bakteryjnym o długości fali 600 nm.
inną metodą jest określenie „CFU”, czyli jednostek tworzących kolonię, na mililitr Kultury., Ze względu na klonalny charakter wzrostu bakterii, jedna bakteria w kulturze może teoretycznie rozwinąć się w jedną obserwowalną kolonię na płycie agarowej. Poprzez poszycie serii rozcieńczeń kultury bakteryjnej w celu osiągnięcia stężenia bakterii, w którym można zaobserwować pojedyncze, dyskretne kolonie, metodą zwaną „poszycie rozcieńczenia seryjnego”, liczba kolonii może być wykorzystana do obliczenia stężenia bakterii w kategoriach CFU na mL.,
teraz, gdy rozumiesz, jak można analizować wzrost bakterii, przejdźmy przez protokół przeprowadzania analizy krzywej wzrostu na czystych kulturach dobrze ugruntowanego modelu bakteryjnego, Escherichia coli, przy użyciu metody seryjnego rozcieńczania poszycia.
na jeden dzień przed pobraniem punktu czasowego zaszczepić 20 mL wstępnie sterylizowanego bulionu sojowego trypticase lub TSB, medium w kolbie o pojemności 50 mL z pojedynczą kolonią E. coli.
inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C wstrząsając. W przypadku E. coli wynikałoby to z populacji fazy stacjonarnej wynoszącej około 109 CFU / mL.,
następnego dnia zaszczepić 100 µL posiewu nocnego do 250 mL TSB w kolbie o pojemności 500 mL. Dokładnie wymieszać. W ten sposób powstaje rozcieńczona kultura o wartości około 4 x 105 CFU / mL. Przechowywać 5 mL tej rozcieńczonej Kultury w probówce. Jest to podliquot z punktu czasowego 0 lub T0. Przechowywać w lodówce natychmiast w temperaturze 4 °C.
inkubować pozostałą objętość Kultury w temperaturze 37 °C wstrząsając. Następnie co godzinę przez 8 godzin zbieraj 5-mL alikwotów z kultury. Oznacz te próbki od T1 do T8 i przechowuj je wszystkie w temperaturze 4 °C do czasu użycia.,
w dniu eksperymentu wyjmij podwielokrotności punktów czasowych E. coli z lodówki i trzymaj je w lodzie. Stosować sterylne probówki z mikrofugą, każda z 900 µL jałowej soli fizjologicznej, aby ustawić serię rozcieńczeń dla każdej podwielokrotności zgodnie z poniższą tabelą.
dobrze wymieszać kulturę T0 poprzez delikatne wirowanie, a następnie dodać 100 µL do probówki A Serii rozcieńczeń, tworząc rozcieńczenie 1 w 10 lub 10-1. Rurka wirowa A do wymieszania i przy użyciu świeżej końcówki pipety dodać 100 µL rurki a do rurki B, tworząc rozcieńczenie 1 w 100 lub 10-2.,
powtórz proces dla każdej podwielokrotności hodowli i wykonaj odpowiednią serię rozcieńczeń zgodnie z tabelą 2. Po wykonaniu serii rozcieńczeń dla wszystkich próbek punktu czasowego należy przygotować odpowiednią liczbę sterylnych płytek agaru sojowego trypticase do powlekania bakteryjnego.
3 rozcieńczenia każdej kultury punktu czasowego zostaną Platerowane w trzech egzemplarzach zgodnie z poniższą tabelą. Odpowiednio oznakować płyty. Następnie pipetą 100 µL każdej odpowiednio rozcieńczonej kultury na środek odpowiedniej płytki agarowej., Płomień-wysterylizować pręt szklany w kształcie litery „L”, schłodzić dotykając pręta agaru z dala od inokulum i natychmiast rozprowadzić ciecz na powierzchni agaru. Należy pamiętać, że opóźnienie w rozprzestrzenianiu może spowodować przerost bakterii w miejscu szczepienia.
Kontynuuj powlekanie każdej serii rozcieńczania dla wszystkich 9 kultur punktów czasowych, sterylizując płomieniem pręt szklany między każdą serią rozcieńczania.
po pozostawieniu płytek do wyschnięcia na kilka minut, odwrócić i umieścić je w inkubatorze o temperaturze 37 °C na noc. Po tym okresie wzrostu płyty można przechowywać w temperaturze 4 °C.,
po nocnej inkubacji płyt rozcieńczających należy zbadać je pod kątem zanieczyszczenia i jednorodności Kolonii. Dla każdej kultury punktu czasowego wybierz rozcieńczenie, dla którego istnieje między 30-300 kolonii na płytkę. Policz liczbę kolonii na każdej z płytek potrójnych dla tego rozcieńczenia.
wykorzystując średnią liczbę kolonii dla każdego rozcieńczenia i współczynnik rozcieńczenia, obliczyć stężenie bakterii w pierwotnej hodowli w każdym punkcie czasowym w CFU / mL. Na przykład, jeśli jest średnio 30 kolonii z potrójnego zestawu płyt otrzymanego od 0.,1 mL rozcieńczenia 10-4 lub 1 na 10 000, wtedy byłoby 30 podzielone przez 0,1 mL pomnożone przez 10 000 lub 3 miliony CFU / mL.
wykorzystując stężenie bakterii obliczone dla każdego punktu czasowego, wykreśl Wykres bazowy-10 log stężeń bakterii, w CFU / mL, w stosunku do czasu w godzinach. Na wykresie należy określić fazę logowania wzrostu oryginalnej kultury bakteryjnej i wybrać dwa punkty czasowe w fazie logowania, oznaczając pierwszy z tych punktów jako t = 0., Oblicz średni czas generacji za pomocą równania x równa się 2 potędze N pomnożonej przez X0, gdzie X jest stężeniem bakterii w czasie t, X0 jest stężeniem początkowym w t = 0, a n jest liczbą pokoleń, która upłynęła między dwoma punktami czasowymi.
Załóżmy na przykład, że X0 wynosi 1000 CFU / mL,a przy t = 6 h stężenie wynosi 16 000 CFU / mL. Korzystając z równania, otrzymujemy, że 4 generacje wystąpiły w ciągu 6 h, co daje czas generacji 6 podzielony przez 4 lub 1,5 h na pokolenie.,
pomiar kinetyki wzrostu bakterii ma zasadnicze znaczenie dla wielu zastosowań w badaniach, rolnictwie lub bioinżynierii.
jednym ze sposobów na poznanie szybkości wzrostu bakterii jest umożliwienie uzyskania dokładnej ilości kultury bakteryjnej w celu zaszczepienia innej kultury lub pożywki. Na przykład niektóre rośliny, takie jak rośliny strączkowe, muszą być uprawiane z symbiotycznymi bakteriami znanymi jako rhizobia, które kolonizują korzenie roślin, tworząc guzki i” fix ” azotu-przekształcając azot atmosferyczny w amoniak, który może być wykorzystywany przez roślinę., W zastosowaniach rolniczych znana ilość rhizobii jest dodawana do podłoża węglowego na bazie torfu, który jest następnie używany do zaszczepienia nasion roślin strączkowych w celu ustalenia symbiozy roślinno-bakteryjnej.
analiza wzrostu może być również wykorzystana do identyfikacji gatunków bakterii, które mogą degradować odpady przemysłowe i ewentualnie generować cenne produkty uboczne. W tym przykładzie naukowcy zbadali, w jaki sposób media wzrostu uzupełnione ługiem czarnym, produktem odpadowym z roztwarzania drewna i produkcji papieru, wpłynęły na wzrost izolatu mikrobiologicznego środowiska.,
bakterie nie tylko wykazywały zwiększony wzrost z czarnym alkoholem, ale także wykazywały „difazowy” wzór wzrostu, wskazujący na obecność więcej niż jednego źródła węgla w czarnym alkoholu, które bakterie mogą metabolizować. Poszczególne składniki czarnego trunku można następnie wyodrębnić w celu bardziej szczegółowej analizy wzrostu.
wreszcie, pomiary szybkości wzrostu są również przydatne do scharakteryzowania bakterii, które zostały zaprojektowane do określonych celów przemysłowych, na przykład do remediacji zanieczyszczeń olejami., Tutaj naukowcy stworzyli genetycznie zmodyfikowane szczepy bakterii, które zawierają enzymy do degradacji składników węglowodorowych ropy naftowej. Na przykład przeprowadzono analizę wzrostu, aby sprawdzić, czy zmodyfikowane bakterie mają zwiększone tempo wzrostu niż normalne bakterie w obecności toksycznych węglowodorów, co wskazuje na lepszą tolerancję, która pozwoli inżynierowanym bakteriom wykonywać ich funkcję oczyszczania zanieczyszczeń.
właśnie oglądałeś film JoVE ' a na temat analizy szybkości wzrostu bakterii z krzywymi wzrostu., Powinieneś teraz zrozumieć różne fazy wzrostu kultur bakteryjnych, jak wykonać eksperyment w celu uzyskania krzywej wzrostu za pomocą zbierania punktów czasowych i seryjnego rozcieńczania poszycia, i jak analiza wzrostu może być stosowana do celów badawczych i przemysłowych. Jak zawsze, dzięki za oglądanie!
Leave a Reply