Måler veksten av bakterier er en grunnleggende mikrobiologiske teknikk, og har utstrakt bruk i grunnleggende forskning, så vel som i jordbruk og industrielle applikasjoner.
Bakterier er blant de mest tallrike livsformer på Jorden, å være til stede i ethvert økosystem, inkludert den menneskelige kroppen. Enkelte bakterielle arter er også genetisk svært føyelig, og har vært brukt som forskning modeller eller for å produsere naturlige eller syntetiske produkter til industriell skala., Imidlertid, ikke alle bakteriearter kan være dyrket i laboratoriet. For de som kan, en viktig egenskap er frekvensen av multiplikasjon, eller «vekst kinetikk».
Måler en bakteriekultur er veksten kan informere forskere om deres fysiologiske og metabolske funksjoner, og er også nyttig for å få en nøyaktig celle nummer av bakterier for nedstrøms programmer.,
i Denne videoen vil innføre prinsippene bak bakteriell vekst analyse, viser en protokoll for å karakterisere vekst med en «vekstkurve», og til slutt, utforske flere environmental science programmer for måling av bakteriell vekst kinetikk.
Bakterier generelt reprodusere asexually, multiplisere med enkel binær fisjon hvor foreldrenes en celle deler seg i to identiske datterceller., Under gunstige vekstvilkår der næringsstoffer finnes i overflod og miljøfaktorer som temperatur er alle som bidrar til vekst, frekvensen av å multiplisere langt overstiger død pris. Dette resulterer i eksponentiell vekst.
Ved å måle mengden av bakterier i en kultur som en funksjon av tid, en vekstkurve kan oppnås. Voksende bakterier i en flytende kultur under optimale forhold produserer en vekstkurve med en karakteristisk form som kan deles inn i ulike faser., Kurven begynner med en «lag-fase», når veksten er langsom, mens bakterier blir akklimatisert til kultur betingelser. Neste er «log» eller «eksponentielle fasen», når bakterier erfaring eksponentiell vekst. Vekst slutt boder når næringsstoffer bli oppbrukt og avfallsstoffer samler seg, noe som resulterer i en «stasjonær fase». Til slutt, når frekvensen av å multiplisere er forbigått av frekvensen av celledød, kultur går inn i «død fase».,
for Å bygge opp en vekstkurve, bakterielle tall i en kolbe av væske kultur telles på forskjellige tidspunkter i løpet av en bestemt periode av kultur. Bakterietall kan fås med en rekke ulike metoder. En vanlig tilnærming er å måle optisk tetthet – eller «OD» – 600, som er den bakterielle løsning er absorbans av lys ved en bølgelengde på 600 nm.
en Annen metode er å bestemme «CFU», eller kolonidannende enheter per milliliter av kulturen., På grunn av den clonal arten av bakterievekst, en bakterie som i en kultur kan teoretisk utvide til en observerbar koloni på en agar plate. Med platekledning en serie av fortynninger av en bakteriekultur å nå en bakteriell konsentrasjon der enkelte, diskret kolonier som kan observeres, en metode som kalles «serial fortynning plating», kolonien teller kan brukes til å ta beregne bakteriell konsentrasjon i form av CFU per mL.,
Nå som du forstår hvordan bakteriell vekst kan bli analysert, la oss gå gjennom en protokoll for å gjennomføre vekstkurve analyse på rene kulturer av en godt etablert bakteriell modell, Escherichia coli, som bruker seriell fortynning plating metode.
En dag før tidspunkt for innsamling, inoculate 20 mL av pre-sterilized trypticase soy broth, eller TSB, medium i en 50-mL kolbe med en enkelt koloni av E. coli.
Inkuber kultur over natten ved 37 °C med risting. For E. coli, ville dette resultere i en stabil fase befolkning på ca 109 CFU/mL.,
Den følgende dag, inoculate 100 µL av natten kultur i 250 mL av TSB i en 500 mL kolbe. Bland godt. Dette gir en utvannet kultur på ca 4 x 105 CFU/mL. Lagre 5 mL av denne utvannet kultur i en kultur rør. Dette er alikvoter fra tidspunkt 0, eller T0. Avkjøl umiddelbart ved 4 °C.
Inkuber det gjenværende volumet av kultur ved 37 °C med risting. Hver time etterpå for opp til 8 h, samle 5-mL alikvoter fra kultur. Utpeke disse prøvene T1 til T8, og lagre alle av dem ved 4 °C før bruk.,
På dagen for eksperimentet, fjerne E. coli tidspunkt alikvoter fra kjøleskap og holde dem på isen. Bruk sterilt microfuge rør, hver med 900 µL sterilt saltvann, for å sette opp en fortynning serien for hver delprøve i henhold til følgende tabell.
Bland T0 kultur godt ved forsiktig virvling, så tilsett 100 µL til T En av sine fortynning serien, noe som gjør en 1-i-10, eller 10-1 fortynning. Vortex Rør til En blanding, og med en ny pipettespiss, og tilsett 100 µL av Rør A til T-B, noe som gjør den 1-i-100, eller 10-2 fortynning.,
Gjenta prosessen for hver kultur alikvoter og gjøre de riktige fortynningsserier i henhold til Tabell 2. Når fortynningsserier for alle tidspunkt prøver har blitt gjort, har det riktige antall sterile trypticase soy agar plater forberedt for bakteriell plating.
3 fortynninger av hvert tidspunkt kultur vil være belagt i triplikat i henhold til følgende tabell. Etiketten platene tilsvarende. Så, pipetter 100 µL av hver hensiktsmessig utvannet kultur på midten av respektive agar plate., Flamme-sterilisere en «L»-formet glass-stav, kule ved å berøre stang til agar bort fra inokulatet, og umiddelbart spre væske over agar-overflate. Vennligst merk at en forsinkelse i å spre kan føre til bakteriell overvekst i stedet for grader.
Fortsett plating hver fortynning serie for alle 9 tidspunkt kulturer, flamme-sterilisering glass spre stang mellom hver fortynning serien.
Når platene som har fått lov til å tørke i et par minutter, snu og sette dem inn i 37 °C inkubator over natten. Etter denne perioden med vekst, plater kan lagres ved 4 °C.,
Etter natten inkubering av fortynning plater, undersøke dem for forurensning og ensartethet av koloniene. For hvert tidspunkt kultur, plukke en fortynning som det er mellom 30-300 kolonier per plate. Telle antall kolonier på hver av de triplikat platene for at fortynning.
ved Hjelp av gjennomsnittlig antall kolonier for hver fortynning og fortynningsforholdet, beregne konsentrasjonen av bakterier i den opprinnelige kulturen på hvert tidspunkt i CFU/mL. For eksempel, hvis det er i gjennomsnitt 30 kolonier fra triplikat plate sett hentet fra 0.,1 mL av 10-4, eller 1-i-10,000, fortynning, da ville det være 30 delt på 0,1 mL multiplisert med 10 000, eller 3 millioner CFU/mL.
ved Hjelp av bakterielle konsentrasjon beregnet for hvert tidspunkt, plotte en graf av base-10 logge av bakterielle konsentrasjoner, i CFU/mL, mot tiden i timer. Fra grafen, identifisere logg fase av vekst av den opprinnelige bakteriell kultur og plukke to av tid poeng i loggen fase, som betegner den første av disse tid poeng som t = 0., Beregne gjennomsnittlig generasjon tid ved hjelp av ligningen X er lik 2 opphøyd i n multiplisert med X0, der X er bakteriell konsentrasjon ved tid t, X0 er den første konsentrasjon ved t = 0, og n er antall generasjoner som har gått mellom de to tidspunktene.
For eksempel, la oss anta at X0 er 1000 CFU/mL, og ved t = 6 t, konsentrasjonen er på 16.000 CFU/mL. Ved hjelp av ligningen, får vi at 4 generasjoner har skjedd innen 6 t, som gir en generasjon tid av 6 delt på 4 eller 1.5 h per generasjon.,
Måling av bakteriell vekst kinetikk er grunnleggende for mange programmer for forskning, landbruk, eller bioteknologi formål.
En bruk for å vite bakteriell vekst er å gi en nøyaktig mengde av en bakteriekultur som skal innhentes for å inoculate en annen kultur eller medium. For eksempel, visse avlinger, som belgfrukter, må være dyrket med symbiotiske bakterier som er kjent som rhizobia at kolonisere planter’ røtter for å danne knuter og «fikse» nitrogen – konvertering av atmosfærisk nitrogen i ammoniakk som kan benyttes av anlegget., For landbruks-programmer, en kjent mengde av rhizobia er lagt til et torv-basert carbon medium, som deretter brukes til å inoculate legume frø til å etablere anlegg-bakteriell symbiose.
Vekst analysen kan også brukes til å identifisere bakteriearter, som kan forringe industriavfall og muligens generere verdifulle biprodukter. I dette eksempel, har forskere undersøkt hvordan vekst media supplert med black liquor, en av avfall produkt fra tre pulping og produksjon av papir, påvirket veksten av en miljø-mikrobiell isolere.,
bakterier ikke bare vist forbedret vekst med black liquor, men viste også en «diphasic» vekst mønster, som indikerer tilstedeværelsen av mer enn ett karbon kilde i black liquor at bakterier kan forbrenne. Individuelle komponenter av black liquor kunne da blitt tatt ut for mer detaljert vekst analyse.
til Slutt, vekst målinger er også nyttige for karakterisering av bakterier som har blitt utviklet spesielt for industrielle formål, for eksempel for utbedring av oljeforurensning., Her, forskere opprettet genmodifisert bakterielle stammer som inneholder enzymer til å bryte ned hydrokarbon komponenter i oljen. Vekst analyse ble utført, for eksempel, for å kontrollere at den er konstruert bakterier har økt vekstrate enn normale bakterier i nærvær av giftige hydrokarboner, noe som indikerer økt toleranse som vil tillate konstruert for bakterier å utføre sine forurensning opprydding funksjon.
Du har bare så JoVE video på å analysere bakteriell vekst med vekst kurver., Du bør nå å forstå de ulike vekstfaser av bakteriekulturer, hvordan å utføre et eksperiment for å oppnå en vekstkurve ved hjelp av tidspunkt for innsamling og seriell fortynning plating, og hvordan veksten analyse kan brukes til forskning og industrielle formål. Som alltid, takk for at du ser!
Leave a Reply