을 측정하는 박테리아의 성장 속도는 기본적인 미생물학적 기법,그리고는 광범위한 사용에 기초연구뿐만 아니라 농업과 산업분야에 적용 가능합니다.
박테리아는 지구상에서 가장 풍부한 생명체 중 하나이며 인체를 포함한 모든 생태계에 존재합니다. 특정 세균 종은 또한 유전자는 매우 온순하고있어,다룰로서 연구 모델을 생산하는 자연인 또는 합성 제품에서 산업적 규모입니다., 그러나 모든 박테리아 종을 실험실에서 배양 할 수있는 것은 아닙니다. 할 수있는 사람들에게 중요한 특성은 곱셈 속도 또는”성장 동역학”입니다.
측정 세균 문화의 성장 속도 알릴 수 있습니다 과학자들에 대한 자신의 생리와 대사 기능도에 대한 정확한 세포 수의 박테리아를 다운스트림 응용 프로그램.,
이 비디오를 소개한다 원칙균 증가율 분석을 보여 프로토콜을 특성화하기 위한 성장율로”성장 곡선”,그리고 마지막으로,탐험을 여러 가지 환경학과 응용을 측정하기 위한 세균의 성장 속도.
박테리아는 일반적으로 재현하는 무성,곱하여 간단한 이분 어디 하나는 부모의 세포로 분할 두 가지 동일한 딸 세포입니다., 한 유리한 성장 조건 하에서 어디서 영양분이 풍부하게 사용할 수 있고 환경 변수 등의 온도는 모든 도움이 성장의 비율을 곱하여 훨씬 초과하는 죽음의 평가. 이로 인해 기하 급수적 인 성장이 발생합니다.
시간의 함수로서 배양에서 박테리아의 양을 측정함으로써 성장 곡선을 얻을 수있다. 성장하는 박테리아 액체에서 문화에서 최적의 조건을 생산하고 성장 곡선과 특성 모양으로 나눌 수 있는 다양한 단계입니다., 곡선은 박테리아가 배양 조건에 순응하는 동안 성장이 느린”지연 단계”로 시작됩니다. 다음은 박테리아가 기하 급수적 인 성장을 경험할 때”로그”또는”지수 단계”입니다. 영양소가 고갈되고 폐기물이 축적되면 성장은 결국 중단되어”정지 단계”가됩니다. 마지막으로,일단 증식 속도가 세포 사멸 속도에 의해 추월되면,배양 물은”죽음 단계”로 들어간다.,
을 구성하는 성장 곡선,세균 번호 플라스크에 액체의 문화 계산되는 다른 시간에 포인트의 일정 기간 배양. 박테리아 수는 여러 가지 다른 방법으로 얻을 수있다. 한 가지 일반적인 접근 방식은 측정의 광학 밀도 또는”OD”-600,는 세균성 솔루션의 흡광도에서 빛의 파장의 600nm.
또 다른 방법은 배양 물의 밀리리터 당”CFU”또는 콜로니 형성 단위를 결정하는 것이다., 으로 인해 클론 성격의 박테리아의 성장,하나의 박테리아에서 문화할 수 있는 이론적으로 확장 중 하나로 관찰할 수 식민지에 an agar plate. 에 의해 도금하는 시리즈의 희석의 세균 배양에 도달하 세균 농도는 개인은,개별 식민지 관찰할 수 있는 방법”이라는 일련의 희석 도금”,식민지로 계산하는 데 사용될 수 있 다시 계산 세균 농도의 측면에서 CFU per mL.,
이제는 방법을 이해한 세균의 성장을 분석할 수 있습자를 통해 갈 수행하기 위한 프로토콜 성장 곡선 분석에서는 순수한 문화의 세균 모델,대장균을 사용하여,serial 희석 도금하는 방법입니다.
하루 전에 시간 점 컬렉션,접종 20mL 의 사전 멸균 trypticase 콩 국물 또는 TSB,중간에서 50mL 플라스크를 가진 단 하나의 식민지를 E.coli.
37°C 에서 밤새 배양액을 흔들어 배양한다. 대장균의 경우,이는 약 109CFU/mL 의 고정 상 집단을 초래할 것이다.,
다음날,500-mL 플라스크에 250ml 의 TSB 에 100μl 의 밤새 배양액을 접종한다. 철저히 섞는다. 이것은 약 4x105CFU/mL 의 희석 된 배양액을 생성한다. 이 희석 된 배양액 5ml 를 배양 튜브에 보관하십시오. 이것은 시간 지점 0 또는 T0 의 aliquot 입니다. 4°C 에서 즉시 냉장 보관하십시오.
37°C 에서 배양 물의 나머지 부피를 흔들어 배양하십시오. 이후 최대 8 시간 동안 매 시간에 배양액에서 5-mL 의 분비를 수집하십시오. 이 샘플 T1 을 T8 로 지정하고 사용할 때까지 4°c 에서 모두 보관하십시오.,
실험 당일에 냉장고에서 대장균 시간 점 aliquots 를 제거하고 얼음 위에 보관하십시오. 사용 멸균 microfuge 튜브,각 900µL 멸균 염분을 설정하려면,희석에 대한 각 부분에 따라 다음과 같은 테이블.
부드럽게 vortexing 하여 T0 배양 물을 잘 혼합 한 다음 희석 시리즈의 튜브 A 에 100μl 을 첨가하여 1-in-10 또는 10-1 희석을 만듭니다. 소용돌이 튜브 a 를 혼합하고 신선한 피펫 팁을 사용하여 튜브 B 에 100μl 의 튜브 A 를 추가하여 1-in-100 또는 10-2 희석을 만듭니다.,
각 배양액 분화 과정을 반복하고 표 2 에 따라 적절한 희석 시리즈를 만든다. 면,희석한 모든 시간 지점의 샘플을 만들었습니다,가 적절한 수의 멸균 trypticase 콩 agar plate 준비를 위한 세균 도금입니다.
각 시간 점 문화의 3 희석은 다음 표에 따라 3 중으로 도금 될 것입니다. 그에 따라 플레이트에 라벨을 붙이십시오. 이어서,각각의 한천 플레이트의 중심에 각각의 적절히 희석 된 배양액 100μl 을 피펫., 불꽃독하는”L”자 모양 유리제 막대,멋진을 터치하여 막대 한천에서 접종하고 즉시 확 액체 agar 표면입니다. 확산이 지연되면 접종 장소에서 박테리아 과증식이 발생할 수 있음을 유의하십시오.
계속 도금 각 희석에 대한 모든 9 시간 문화점,난 살균리 확산 막대 사이의 각 희석 시리즈입니다.
일단 플레이트가 몇 분 동안 건조되도록 허용되면,밤새 37°c 인큐베이터에 뒤집어서 놓습니다. 이 성장 기간이 지나면 4℃에서 플레이트를 보관할 수 있습니다.,
희석 판을 밤새 배양 한 후 콜로니의 오염 및 균일 성을 검사한다. 각 시간 점 문화에 대해 접시 당 30-300 개의 콜로니 사이에있는 희석을 선택하십시오. 그 희석을 위해 삼중 판 각각에 콜로니 수를 세십시오.
각 희석에 대한 콜로니의 평균 수와 희석 인자를 사용하여 CFU/mL 의 각 시간 지점에서 원래 배양액의 박테리아 농도를 계산합니다. 예를 들어,0 에서 얻은 삼중 판 세트에서 평균 30 개의 콜로니가있는 경우.,1mL 의 10-4,또는 1-in-10,000,희석,다음 것 30 나눈 0.1mL 곱한 10,000,또는 3 백만 CFU/mL.
를 사용하여 세균 농도에 대해 계산된 각 시점,그래프를 그린베이-10 의 로그를 세균 농도에서 CFU/mL,에 대하여 시간에는 시간입니다. 그래프에서 식별,로그의 성장 단계에 원래 세균의 문화와 선택의 두 시간 내에 있는 포인트 로그 단계를 지정,이 중 첫 번째 시간을 포 t=0., 계산 평균 세대 시간 사용하여 방정식 X=2 의 힘 n 곱 X0X 세균 농도에서 시간 t,X0 초기 농도에 t=0,n 은 세대의 수 있는 시간이고 두 시간이 포인트입니다.
예를 들어,X0 이 1,000CFU/mL 이고 t=6h 에서 농도가 16,000CFU/mL 라고 가정합니다. 방정식을 사용하여 6h 내에서 4 세대가 발생했음을 얻었는데,이는 6 의 생성 시간을 4 로 나눈 값 또는 세대 당 1.5h 를 제공합니다.,
박테리아 성장 동역학의 측정은 연구,농업 또는 생물 공학 목적을위한 많은 응용 분야의 기본입니다.
중 하나를 사용한 알고 세균 성장률이 허용하는 정확한 금액의 세균 배양을 획득하는 접종합니다 다른 문화 또는 매체입니다. 예를 들어,특정과 같은 작물 콩과식물,성장해야와의 상생으로 알려진 박테리아 rhizobia 는 식민지로 식물의 뿌리를 형성 결절하고”수정”질소-로 변환하기 질소로는 암모니아에 의해 이용 될 수 있는 식물., 농업을 위한 응용 프로그램,알려진 양의 rhizobia 에 추가된 탄 기반는 탄소 중,다음 사용하는 접종 콩의 씨앗을 설정 공장균 공생.
성장을 분석하는 데 사용될 수도 있습 식별 세균 종가 저하시킬 수 있습 산업 폐기물 및능성 가치 부산물. 이 예제에서 연구 조사를 어떻게 성장 매체 보충을 가진 흑액,폐기물에서 목재 펄프와 종이 생산에 영향을 성장의 환경은 미생물 격리입니다.,
박테리아는 하지만 증명하는 향상된 성장과 흑액이지만,또한”diphasic”성장 패턴,존재를 나타내는 하나 이상의 탄소원 블랙에서는 주류의 박테리아 대사. 그런 다음 검은 주류의 개별 구성 요소를보다 자세한 성장 분석을 위해 추출 할 수있었습니다.
마지막으로,성장률을 측정하는 데 도움이 됩니다 또한 특성화는 박테리아할 수 있도록 제작되었습에 대한 특정한 산업적 목적으로,예를 들어,치료 오일의 오염입니다., 여기에서 과학자들은 오일의 탄화수소 성분을 분해하는 효소를 포함하는 유전자 조작 박테리아 균주를 만들었습니다. 장 분석이 수행되었,예를 들어,는지 확인하려면 설계한 박테리아가 증가보다 성장 속도 정상적인 박테리아의 존재에는 유독한 탄화수소,향상을 나타내는 허용할 수 있는 설계한 박테리아 수행하려는 그들의 오염 정리 기능입니다.
방금 성장 곡선으로 박테리아 성장률을 분석하는 JoVE 의 비디오를 보았습니다., 이제 이해하는 다양한 세균의 성장 단계 문화를 수행하는 방법을 실험을 얻을 성장 곡선을 사용하여 시간에 포인트 컬렉션 시리얼 희석 도금,그리고 어떻게 성장을 분석할 수 있습에 적용할 연구 및 산업의 목적이다. 언제나처럼,시청 해 주셔서 감사합니다!
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