Het meten van de groeisnelheid van bacteriën is een fundamentele microbiologische techniek en wordt wijdverbreid gebruikt in fundamenteel onderzoek en in agrarische en industriële toepassingen.
bacteriën behoren tot de meest voorkomende levensvormen op aarde en zijn aanwezig in elk ecosysteem, inclusief het menselijk lichaam. Bepaalde bacteriesoorten zijn ook genetisch zeer tracteerbaar en zijn gebruikt als onderzoeksmodellen of om natuurlijke of synthetische producten op industriële schaal te produceren., Echter, niet alle bacteriële soorten kunnen worden gekweekt in het lab. Voor degenen die dat kunnen, is een belangrijk kenmerk De snelheid van vermenigvuldiging, of “groeikinetiek”.
Het meten van de groeisnelheid van een bacteriecultuur kan wetenschappers informeren over hun fysiologische en metabole functies, en is ook nuttig voor het verkrijgen van een nauwkeurig celaantal van de bacteriën voor downstreamtoepassingen.,
Deze video introduceert de principes achter de analyse van de bacteriegroeisnelheid, demonstreert een protocol voor het karakteriseren van de groeisnelheid met een “groeicurve”, en ten slotte onderzoekt het verschillende toepassingen in de milieuwetenschappen voor het meten van de bacteriegroeikinetiek.
bacteriën reproduceren zich in het algemeen ongeslachtelijk en vermenigvuldigen zich door eenvoudige binaire splitsing waarbij één oudercel zich in twee identieke dochtercellen verdeelt., Onder gunstige groeiomstandigheden waar voedingsstoffen beschikbaar zijn in overvloed en milieuparameters zoals temperatuur zijn allemaal bevorderlijk voor de groei, De snelheid van vermenigvuldiging veel groter is dan het sterftecijfer. Dit resulteert in exponentiële groei.
door de hoeveelheid bacteriën in een cultuur te meten als functie van de tijd, kan een groeicurve worden verkregen. Het kweken van bacteriën in een vloeibare cultuur onder optimale omstandigheden produceert een groeicurve met een karakteristieke vorm die in verschillende fasen kan worden verdeeld., De kromme begint met een” vertragingsfase”, wanneer de groei langzaam is terwijl de bacteriën aan de cultuurvoorwaarden worden geacclimatiseerd. Vervolgens is de ” log ” of “exponentiële fase”, wanneer de bacteriën exponentiële groei ervaren. De groei stagneert uiteindelijk zodra voedingsstoffen uitgeput raken en afvalproducten zich ophopen, wat resulteert in een”stationaire fase”. Ten slotte, zodra de vermenigvuldigingssnelheid wordt ingehaald door de snelheid van celdood, de cultuur gaat de “dood fase”.,
om een groeicurve te construeren, worden bacteriële aantallen in een kolf met vloeibare cultuur geteld op verschillende tijdstippen gedurende een bepaalde kweekperiode. Bacteriële tellingen kunnen worden verkregen door een aantal verschillende methoden. Een gemeenschappelijke aanpak is om optische dichtheid te meten – of” OD ” – 600, wat de absorptie van licht van de bacteriële oplossing is bij een golflengte van 600 nm.
een andere methode is het bepalen van de” CFU”, of kolonievormende eenheden, per milliliter van de cultuur., Door de klonale aard van bacteriegroei kan één bacterie in een cultuur theoretisch uitgroeien tot één waarneembare kolonie op een agarplaat. Door het Plateren van een reeks verdunningen van een bacteriële cultuur om een bacteriële concentratie te bereiken waar individuele, discrete kolonies kunnen worden waargenomen, een methode genaamd “seriële verdunning plating”, kan de kolonie telling worden gebruikt om de bacteriële concentratie in termen van CFU per mL back-berekenen.,
nu u begrijpt hoe bacteriegroei kan worden geanalyseerd, gaan we door een protocol voor het uitvoeren van groeicurve analyse op zuivere culturen van een goed gevestigd bacterieel model, Escherichia coli, met behulp van de seriële verdunning plating methode.
één dag voor het verzamelen van het tijdstip 20 mL vooraf gesteriliseerde trypticase-sojabouillon of TSB-medium inoculeren in een kolf van 50 mL met een enkele kolonie E. coli.incubeer de cultuur ‘ s nachts bij 37 °C onder schudden. Voor E. coli zou dit resulteren in een stationaire fase populatie van ongeveer 109 CFU/mL.,de volgende dag 100 µL van de NACHTCULTUUR in 250 mL TSB in een erlenmeyer van 500 mL inoculeren. Meng goed. Hierdoor ontstaat een verdunde cultuur van ongeveer 4 x 105 CFU / mL. Bewaar 5 mL van deze verdunde cultuur in een kweekbuis. Dit is het aliquot van tijdpunt 0, of T0. Onmiddellijk in de koelkast bewaren bij 4 °C.
incubeer het resterende volume van de cultuur bij 37 °C door schudden. Om het uur daarna gedurende maximaal 8 uur, verzamel 5 mL aliquots uit de cultuur. Wijs deze monsters T1 tot en met T8 aan en bewaar ze tot gebruik bij 4 °C.,
op de dag van het experiment, verwijder de E. coli tijdpunt aliquots uit de koelkast en bewaar ze op ijs. Gebruik steriele microfugebuisjes, elk met 900 µL steriele zoutoplossing, om een verdunningsreeks op te zetten voor elk aliquot volgens onderstaande tabel.
Meng de T0-cultuur goed door voorzichtig te draaien en voeg vervolgens 100 µL toe aan Buis A van zijn verdunningsreeks, waardoor een 1-op-10 of 10-1 verdunning ontstaat. Vortex Tube a te mengen, en met behulp van een verse pipet tip, voeg 100 µL van buis A aan Buis B, waardoor de 1-in-100, of 10-2 verdunning.,
herhaal het proces voor elke kweek aliquot en maak de juiste verdunningsreeks overeenkomstig tabel 2. Zodra de verdunningsreeks voor alle tijdpuntmonsters is gemaakt, moet het juiste aantal steriele trypticase-soja-agar-platen worden bereid voor bacteriële plating.
3 verdunningen van elke tijdpuntcultuur worden in drievoud geplateerd volgens de volgende tabel. Label de platen dienovereenkomstig. Pipetteer vervolgens 100 µL van elke goed verdunde cultuur op het midden van de respectieve agarplaat., Vlam-steriliseer een”L” -vormige glazen staaf, koel door de staaf aan te raken op de agar weg van het entmateriaal, en verdeel de vloeistof onmiddellijk over het oppervlak van de agar. Houd er rekening mee dat een vertraging in de verspreiding kan leiden tot bacteriële overgroei op de plek van de inenting.
ga verder met het Plateren van elke verdunningsreeks voor alle negen tijdpuntculturen en steriliseer de glasstrooier tussen elke verdunningsreeks.
zodra de platen enkele minuten droog zijn, omdraaien en ‘ s nachts in de incubator van 37 °C plaatsen. Na deze groeiperiode kunnen platen worden opgeslagen bij 4 °C.,
na een nachtelijke incubatie van de verdunningsplaten, onderzoek ze op verontreiniging en uniformiteit van de kolonies. Kies voor elke tijdpuntcultuur een verdunning waarvoor er tussen 30-300 kolonies per plaat zijn. Tel voor die verdunning het aantal kolonies op elk van de drievoudige platen.
bereken aan de hand van het gemiddelde aantal kolonies voor elke verdunning en de verdunningsfactor de concentratie van bacteriën in de oorspronkelijke cultuur op elk tijdstip in CFU / mL. Bijvoorbeeld, als er gemiddeld 30 kolonies uit de triplicaat plaat set verkregen uit 0.,1 mL van de 10-4, of 1-op-10.000, verdunning, dan zou er 30 gedeeld door 0,1 mL vermenigvuldigd met 10.000, of 3 miljoen CFU / mL.
aan de hand van de voor elk tijdstip berekende bacteriële concentratie wordt een grafiek van de base-10 log van de bacteriële concentraties, in CFU / mL, uitgezet tegen de tijd in uren. Uit de grafiek, identificeer de log fase van de groei van de oorspronkelijke bacteriecultuur en kies twee van de tijdpunten binnen de log fase, het aanwijzen van de eerste van deze tijdpunten als t = 0., Bereken de gemiddelde generatietijd met behulp van de vergelijking X is gelijk aan 2 tot de macht van n vermenigvuldigd met X0 waarbij X de bacteriële concentratie op tijdstip t is, X0 de initiële concentratie bij t = 0, en n is het aantal generaties dat is verstreken tussen de twee tijdpunten.
bijvoorbeeld, stel dat X0 1.000 KVE/mL is, en bij t = 6 uur is de concentratie 16.000 KVE/mL. Met behulp van de vergelijking, verkrijgen we dat 4 generaties zijn opgetreden binnen 6 uur, wat een generatietijd van 6 gedeeld door 4 of 1,5 uur per generatie geeft.,
meting van bacteriegroeikinetiek is van fundamenteel belang voor vele toepassingen voor onderzoek, landbouw of bio-engineering.
voor het kennen van de bacteriegroeisnelheid kan een nauwkeurige hoeveelheid van een bacteriecultuur worden verkregen om een andere cultuur of een ander medium te vaccineren. Bijvoorbeeld, bepaalde gewassen, zoals peulvruchten, moeten worden gekweekt met symbiotische bacteriën bekend als rhizobia die de wortels van de planten koloniseren knobbeltjes te vormen en” fix ” stikstof – het omzetten van atmosferische stikstof in ammoniak die kan worden gebruikt door de plant., Voor landbouwtoepassingen wordt een bekende hoeveelheid rhizobia toegevoegd aan een op turf gebaseerd koolstofmedium, dat vervolgens wordt gebruikt om peulzaden in te enten om de plant-bacteriële symbiose vast te stellen.
groeianalyse kan ook worden gebruikt om bacteriesoorten te identificeren die industrieel afval kunnen afbreken en mogelijk waardevolle bijproducten kunnen genereren. In dit voorbeeld onderzochten onderzoekers hoe groeimedia aangevuld met black liquor, een afvalproduct van houtpulp en papierproductie, de groei van een microbieel isolaat in het milieu beïnvloedden.,
de bacteriën vertoonden niet alleen een verhoogde groei met zwarte vloeistof, maar vertoonden ook een” difasisch ” groeipatroon, wat wijst op de aanwezigheid van meer dan één koolstofbron in zwarte vloeistof die de bacteriën kunnen metaboliseren. Individuele componenten van zwarte vloeistof kon vervolgens worden geëxtraheerd voor meer gedetailleerde groeianalyse.
ten slotte zijn groeisnelheidsmetingen ook nuttig voor het karakteriseren van bacteriën die zijn ontworpen voor bepaalde industriële doeleinden, bijvoorbeeld voor de sanering van olieverontreiniging., Hier creëerden wetenschappers genetisch gemanipuleerde bacteriestammen die enzymen bevatten om de koolwaterstofcomponenten van olie te degraderen. De groeianalyse werd uitgevoerd, bijvoorbeeld, om te verifiëren dat de gemanipuleerde bacteriën de groeisnelheid dan normale bacteriën in aanwezigheid van giftige koolwaterstoffen hebben verhoogd, die betere tolerantie aangeven die de gemanipuleerde bacteriën zal toestaan om hun verontreinigingsreinigingsfunctie uit te voeren.
Je hebt zojuist JoVE ‘ s video bekeken over het analyseren van bacteriegroei met groeicurven., U moet nu de verschillende groeifasen van bacterieculturen begrijpen, hoe u een experiment kunt uitvoeren om een groeicurve te verkrijgen met behulp van tijdpuntverzameling en seriële verdunning plating, en hoe groeianalyse kan worden toegepast op onderzoek en industriële doeleinden. Zoals altijd, bedankt voor het kijken!
Leave a Reply