細菌の増殖速度を測定することは、基本的な微生物学的手法であり、基礎研究だけでなく、農業および産業用途において広く使用されている。
細菌は地球上で最も豊富な生命体の一つであり、人体を含むあらゆる生態系に存在しています。 特定の細菌種も遺伝的に非常に扱いやすく、研究モデルとして、または産業規模で天然または合成製品を生産するために利用されています。, しかし、すべての細菌種が実験室で培養できるわけではありません。 可能なものにとって、重要な特徴は、乗算速度、または”成長速度論”である。
細菌培養物の増殖速度を測定することは、その生理学的および代謝機能について科学者に知らせることができ、下流のアプリケーションのための細菌細胞数を正確に得るのにも有用である。,
このビデオでは、細菌増殖速度解析の背後にある原理を紹介し、”成長曲線”で増殖速度を特徴付けるためのプロトコルを示し、最後に、細菌増殖速度測定のためのいくつかの環境科学アプリケーションを探ります。
細菌は一般に無性生殖し、一つの親細胞が二つの同一の娘細胞に分裂する単純な二分裂分裂によって増殖する。, 栄養素が豊富で利用でき、温度のような環境変数がすべて成長を促す好ましい成長の条件の下で、増加の率はずっと死亡率を超過する。 これは指数関数的な成長をもたらす。培養物中の細菌の量を時間の関数として測定することによって、増殖曲線を得ることができる。
培養物中の細菌の量を測定することによって、増 最適条件下で液体培養中で細菌を増殖させると、様々な段階に分けることができる特徴的な形状を有する増殖曲線が生成される。, この曲線は、細菌が培養条件に順応する間に増殖が遅くなる”遅延期”から始まります。 次に、細菌が指数関数的増殖を経験するときの”対数”または”指数相”である。 栄養素が枯渇し、廃棄物が蓄積すると、成長は最終的に停止し、その結果”静止期”が生じる。 最後に、増殖の速度が細胞死の速度によって追い越されると、培養は”死期”に入る。,成長曲線を構築するために、液体培養のフラスコ中の細菌数は、培養の一定期間にわたって異なる時点で計数される。 細菌数は、多くの異なる方法によって得ることができる。 一つの一般的なアプローチは、600nmの波長における細菌溶液の光の吸光度である光学密度または”OD”-600を測定することである。別の方法は、培養物のミリリットル当たりの”ＣＦＵ”またはコロニー形成単位を決定することである。, 細菌の増殖のクローン性のために、培養物中の一つの細菌は、理論的には寒天プレート上の一つの観察可能なコロニーに拡大することができる。 細菌培養物の一連の希釈液をめっきして、個々の個別のコロニーを観察できる細菌濃度に達することにより、”連続希釈めっき”と呼ばれる方法で、コロニー数を使用して、mL当たりのCFUの観点から細菌濃度を逆算することができる。,
細菌の増殖をどのように解析できるかを理解したので、直列希釈めっき法を使用して、確立された細菌モデルである大腸菌の純粋な培養物について、成長曲線解析を行うためのプロトコルを見てみましょう。
タイムポイントコレクションの前日に、大腸菌の単一のコロニーを持つ20mLの事前滅菌トリプチカーゼ大豆ブロス、またはTSB、培地を50mLのフラスコ
培養物を振盪しながら37℃で一晩インキュベートする。 大腸菌の場合、これは約109CFU/mLの定常相集団をもたらすであろう。,
翌日、100μlの一晩培養物を250MLのTSB中に500mlフラスコ中に接種する。 よく混ぜる。 これはおよそ4x105CFU/mLの薄くされた文化を作り出す。 この希釈した培養物5mLを培養チューブに保存する。 これは、時点0またはT0からのアリコートです。 直ちに4℃で冷蔵する
培養物の残りの体積を振盪して37℃でインキュベートする。 その後、8時間ごとに、培養物から5-mLのアリコートを収集する。 これらのサンプルT1をT8に指定し、使用するまで4°Cですべて貯えて下さい。,
実験当日、大腸菌の時点アリコートを冷蔵庫から取り出し、氷の上に保管してください。 次のテーブルに従って各aliquotのための希薄シリーズをセットアップするのに生殖不能のmicrofugeの管、生殖不能の塩の900µLとのそれぞれを、使用しなさい。
t0培養物を穏やかに渦を起こしてよく混合し、その希釈系列のチューブAに100μlを加え、1-in-10または10-1希釈する。 渦管Aを混合し、新鮮なピペットチップを使用して、チューブAの100μlをチューブBに加え、1-in-100、または10-2希釈します。,
各培養アリコートに対して処理を繰り返し、表2に従って適切な希釈系列を作る。 すべての時点のサンプルのための希薄シリーズがなされたら、細菌のめっきのために準備される生殖不能のトリプチカーゼの大豆寒天の版の適切な数
各時点培養の3希釈液は、以下の表に従って三重にめっきされる。 ラベルプレートです。 次いで、それぞれの寒天プレートの中央にそれぞれ適宜希釈培養した100μlのピペットを置く。, 炎-“L”形のガラス棒を殺菌し、接種物から離れた寒天に棒に触れることによって冷却し、すぐに寒天の表面に液体を広げて下さい。 広がりの遅れが接種の点で細菌の過剰増殖で起因できることに注意して下さい。
各希釈シリーズの間のガラス広がりの棒を炎殺菌するすべての9時間のポイント文化のための各希釈シリーズをめっきし続けて下さい。
プレートを数分間乾燥させたら、反転させて一晩37℃のインキュベーターに入れます。 成長のこの期間の後で、版は4°C.で貯えることができます。,
希釈プレートの一晩インキュベーション後、コロニーの汚染および均一性についてそれらを調べる。 各時点培養について、プレートあたり30-300コロニーの間にある希釈を選択します。 その希釈のための三重のプレートのそれぞれのコロニーの数を数えます。
各希釈の平均コロニー数および希釈係数を用いて、CFU/mLの各時点における元の培養物中の細菌の濃度を計算する。 例えば、平均して30個のコロニーが0から得られる三重板セットから存在する場合。,1mLの10-4、または1-in-10,000の希釈により、30を0.1mLで割った10,000、または3万CFU/mLを掛けたものになります。
各時点について計算された細菌濃度を用いて、時間単位の時間に対して、細菌濃度の塩基10対数のグラフをCFU/mLでプロットする。 グラフから、元の細菌培養物の成長の対数相を特定し、対数相内の二つの時点を選択し、これらの時点の最初の時点をt=0として指定します。, 式X=2をnの累乗にX0を掛けたものを使用して、平均生成時間を計算します。Xは時間tにおける細菌濃度、X0はt=0における初期濃度、nは二つの時間点の間に経過した世代数です。
たとえば、X0が1,000cfu/mLであり、t=6時間において、濃度は16,000cfu/mLであると仮定する。 この式を使用すると、4世代が6時間以内に発生したことがわかり、6世代あたりの世代時間を4または1.5時間で割ったものになります。,
細菌増殖速度論の測定は、研究、農業、または生物工学の目的のための多くのアプリケーションにとって基本的である。
細菌増殖速度を知るための一つの用途は、別の培養物または培地を接種するために正確な量の細菌培養物を得ることを可能にすることである。
例えば、マメ科植物のような特定の作物は、根粒菌として知られる共生細菌で栽培される必要があり、植物の根を植民地化して結節を形成し、窒素を”固定”-大気中の窒素を植物によって利用することができるアンモニアに変換する。, 農業の適用のために、rhizobiaの知られていた量は植物細菌の共生を確立するためにマメ科植物の種を接種するのに泥炭ベースの炭素媒体に加えられます。
増殖分析はまた、産業廃棄物を分解し、おそらく貴重な副産物を生成する可能性のある細菌種を同定するために使用することもできる。 この例では、研究者らは、木材パルプ化および製紙生産からの廃棄物である黒液を補充した成長培地が環境微生物分離物の成長にどのように影響,
細菌は黒液による増殖促進を示しただけでなく、細菌が代謝できる黒液中に複数の炭素源が存在することを示す”二相性”増殖パターンを示した。 その後、黒液の個々の成分を抽出して、より詳細な成長分析を行うことができた。最後に、増殖速度測定は、特定の産業目的のために、例えば、石油汚染の修復のために設計された細菌を特徴付けるのにも有用である。, ここでは、科学者たちは、油の炭化水素成分を分解する酵素を含む遺伝子操作された細菌株を作り出しました。 例えば、増殖解析を行って、操作された細菌が有毒な炭化水素の存在下で正常な細菌よりも増殖速度が増加していることを確認し、操作された細菌が汚染クリーンアップ機能を果たすことを可能にする耐性が改善されていることを示した。
あなたはちょうど成長曲線で細菌増殖速度を分析する上でジョブのビデオを見てきました。, これで、細菌培養のさまざまな成長段階、時間点収集および連続希釈めっきを使用して成長曲線を得るための実験の実行方法、および成長分析が研究および産業目的にどのように適用できるかを理解する必要があります。 いつも通り、見てくれてありがとう！
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