Måler væksten af bakterier, er en grundlæggende mikrobiologiske teknik, og har udbredt anvendelse inden for grundforskning samt i landbrugs-og industrielle applikationer.
bakterier er blandt de mest rigelige livsformer på jorden, der er til stede i ethvert økosystem, herunder menneskekroppen. Visse bakteriearter er også genetisk stærkt medtagelige og er blevet udnyttet som forskningsmodeller eller til at producere naturlige eller syntetiske produkter i industriel skala., Imidlertid kan ikke alle bakteriearter dyrkes i laboratoriet. For dem der kan, er en vigtig egenskab multiplikationshastigheden eller”vækstkinetik”.
måling af en bakteriekulturs væksthastighed kan informere forskere om deres fysiologiske og metaboliske funktioner og er også nyttig til at opnå et nøjagtigt celletal af bakterierne til nedstrøms applikationer.,
denne video vil introducere principperne bag analyse af bakterievæksthastighed, demonstrere en protokol til karakterisering af vækstrate med en “vækstkurve” og endelig udforske flere miljøvidenskabelige applikationer til måling af bakterievækstkinetik.
bakterier reproducerer generelt aseksuelt og multiplicerer med simpel binær fission, hvor en forældrecelle opdeles i to identiske datterceller., Under gunstige vækstbetingelser, hvor næringsstoffer er tilgængelige i overflod, og miljøparametre som temperatur er alle befordrende for vækst, overstiger multiplikationshastigheden langt dødeligheden. Dette resulterer i eksponentiel vækst.
Ved at måle mængden af bakterier i en kultur som en funktion af tiden, kan der opnås en vækstkurve. Voksende bakterier i en flydende kultur under optimale forhold frembringer en vækstkurve med en karakteristisk form, der kan opdeles i forskellige faser., Kurven begynder med en “lagfase”, når væksten er langsom, mens bakterierne bliver akklimatiseret til kulturbetingelserne. Næste er ” log “eller” eksponentiel fase”, når bakterierne oplever eksponentiel vækst. Væksten boder til sidst, når næringsstoffer bliver udtømt, og affaldsprodukter ophobes, hvilket resulterer i en “stationær fase”. Endelig, når multipliceringshastigheden er overhalet af celledødshastigheden, går kulturen ind i “dødsfasen”.,
for at konstruere en vækstkurve tælles bakterietal i en kolbe med flydende kultur på forskellige tidspunkter over en bestemt dyrkningsperiode. Bakterietællinger kan opnås ved en række forskellige metoder. En fælles tilgang er at måle optisk densitet – eller” OD ” – 600, som er bakterieopløsningens absorbans af lys ved en bølgelængde på 600 nm.
en anden metode er at bestemme “CFU” eller kolonidannende enheder pr., På grund af den klonale karakter af bakterievækst kan en bakterie i en kultur teoretisk udvide sig til en observerbar koloni på en agarplade. Ved at plette en række fortyndinger af en bakteriekultur for at nå en bakteriekoncentration, hvor individuelle, diskrete kolonier kan observeres, en metode kaldet “seriel fortynding plating”, kolonitællingen kan bruges til at beregne bakteriekoncentrationen med hensyn til CFU pr.,nu hvor du forstår, hvordan bakterievækst kan analyseres, lad os gennemgå en protokol til gennemførelse af vækstkurveanalyse på rene kulturer af en veletableret bakteriemodel, Escherichia coli, ved hjælp af den serielle fortyndingsmetode.
En dag før tid punkt samling, pode 20 mL af præ-steriliserede tryticase soy broth, eller TSB, medium i en 50 mL kolbe med en enkelt koloni af E. coli.
Inkub culturer kulturen natten over ved 37 with C under omrystning. For E. coli ville dette resultere i en stationær fase population på cirka 109 CFU/mL.,
den følgende dag inokuleres 100 µL af den natlige kultur i 250 mL TSB i en 500 mL kolbe. Blandes grundigt. Dette giver en fortyndet kultur på cirka 4 105 105 CFU / mL. Opbevar 5 mL af denne fortyndede kultur i et kulturrør. Dette er alikvoten fra tidspunkt 0 eller T0. Nedkøles straks ved 4 C. C.
inkuberes det resterende volumen af kulturen ved 37.C under omrystning. Hver time bagefter i op til 8 timer samles 5 mL portioner fra kulturen. Udpeg disse prøver T1 til T8, og opbevar dem alle ved 4.C indtil brug.,
på forsøgsdagen skal du fjerne E. coli-tidspunktsalikvoterne fra køleskabet og holde dem på is. Brug sterile mikrofugerør, hver med 900 µL sterilt saltvand, til at oprette en fortyndingsserie for hver delmængde i henhold til nedenstående tabel.
bland T0-kulturen godt ved forsigtigt vorte .ing, tilsæt derefter 100 µL til rør A i dens fortyndingsserie, hvilket gør en 1-i-10 eller 10-1 fortynding. Vorte .rør A til blanding, og ved hjælp af en frisk pipettespids tilsættes 100 pi rør A til rør B, hvilket gør 1-i-100 eller 10-2 fortynding.,
gentag processen for hver dyrkningsalikvot, og foretag den passende fortyndingsserie i henhold til tabel 2. Når fortyndingsserien for alle tidspunktprøver er blevet lavet, skal du have det passende antal sterile trypticase soja agarplader forberedt til bakteriel plating.
3 fortyndinger af hver tidspunktskultur vil blive udpladet i tre eksemplarer i henhold til nedenstående tabel. Mærk pladerne i overensstemmelse hermed. Derefter pipetteres 100 pi af hver passende fortyndet kultur på midten af den respektive agarplade., Flammesteriliser en”L” -formet glasstang, afkøles ved at berøre stangen til agaren væk fra inokulumet og straks sprede væsken over agaroverfladen. Bemærk, at en forsinkelse i spredningen kan resultere i bakteriel overvækst på inokulationsstedet.
Fortsæt plettering af hver fortyndingsserie for alle 9 tidspunktskulturer, idet flammesterilisering af glasfordelestangen mellem hver fortyndingsserie.
når pladerne har fået lov til at tørre i et par minutter, skal du vende dem og placere dem i 37 C C inkubatoren natten over. Efter denne vækstperiode kan plader opbevares ved 4 C. C.,
efter natten over inkubation af fortyndingspladerne, undersøge dem for forurening og ensartethed af kolonier. For hver tidspunktskultur skal du vælge en fortynding, for hvilken der er mellem 30-300 kolonier pr. Tæl antallet af kolonier på hver af de tredobbelte plader til den fortynding.
Ved hjælp af det gennemsnitlige antal kolonier for hver fortynding og fortyndingsfaktoren beregnes koncentrationen af bakterier i den oprindelige kultur på hvert tidspunkt i CFU / mL. For eksempel, hvis der i gennemsnit er 30 kolonier fra det tredobbelte pladesæt opnået fra 0.,1 mL af 10-4, eller 1-i-10.000, fortynding, så ville der være 30 divideret med 0,1 mL ganget med 10.000, eller 3 millioner CFU / mL.
Ved hjælp af den bakteriekoncentration, der er beregnet for hvert tidspunkt, skal du plotte en graf af basis-10-loggen af bakteriekoncentrationerne i CFU / mL mod Tid i timer. Fra grafen skal du identificere logfasen for vækst af den oprindelige bakteriekultur og vælge to af tidspunkterne inden for logfasen og udpege det første af disse tidspunkter som t = 0., Beregn den gennemsnitlige generationstid ved hjælp af ligningen equals er lig med 2 til effekten af n multipliceret med .0, hvor.er bakteriekoncentrationen på tidspunktet t ,00 er den indledende koncentration ved t = 0, og n er antallet af generationer, der er gået mellem de to tidspunkter.Antag for eksempel, at00 er 1.000 CFU/mL, og ved T = 6 timer er koncentrationen 16.000 CFU/mL. Ved hjælp af ligningen opnår vi, at 4 generationer har fundet sted inden for 6 h, hvilket giver en generationstid på 6 divideret med 4 eller 1,5 h pr.,
måling af bakterievækstkinetik er grundlæggende for mange applikationer til forsknings -, landbrugs-eller bioengineeringsformål.
en anvendelse til at kende bakterievæksthastigheden er at tillade en nøjagtig mængde af en bakteriekultur, der skal opnås for at inokulere en anden kultur eller medium. For eksempel skal visse afgrøder, såsom bælgfrugter, dyrkes med symbiotiske bakterier kendt som RHI .obia, der koloniserer planternes rødder for at danne knuder og “fi.” nitrogenomdannende atmosfærisk nitrogen til ammoniak, som kan udnyttes af planten., For landbrugs-applikationer, en kendt mængde af rhizobia er føjet til en tørv-baseret carbon medium, som derefter bruges til at pode bælgplantefrø at etablere anlægget-bakteriel symbiose.
Vækstanalyse kan også bruges til at identificere bakteriearter, der kan nedbryde industriaffald og muligvis generere værdifulde biprodukter. I dette eksempel undersøgte forskere, hvordan vækstmedier suppleret med sort væske, et affaldsprodukt fra træpulpning og papirproduktion, påvirkede væksten af et miljømikrobielt isolat.,
bakterierne viste ikke kun forbedret vækst med sort væske, men viste også et “difasisk” vækstmønster, hvilket indikerer tilstedeværelsen af mere end en carbonkilde i sort væske, som bakterierne kan metabolisere. Individuelle komponenter af sort spiritus kunne derefter ekstraheres til mere detaljeret vækstanalyse.
endelig er væksthastighedsmålinger også nyttige til karakterisering af bakterier, der er konstrueret til særlige industrielle formål, for eksempel til rensning af olieforurening., Her skabte forskere genetisk manipulerede bakteriestammer, der indeholder en .ymer for at nedbryde carbonhydridkomponenterne i olie. Vækstanalyse blev for eksempel udført for at verificere, at de konstruerede bakterier har øget væksthastighed end normale bakterier i nærvær af de giftige kulbrinter, hvilket indikerer forbedret tolerance, der gør det muligt for de konstruerede bakterier at udføre deres forureningsoprensningsfunktion.
du har lige set joves video om at analysere bakterievæksthastigheder med vækstkurver., Du skal nu forstår de forskellige vækstfaser af bakterielle kulturer, hvordan man udfører et eksperiment, for at opnå en vækst kurve ved hjælp af tidspunkt for indsamling og seriel fortynding plating, og hvordan vækst-analyse kan anvendes til forskning og industrielle formål. Som altid, tak for at se!
Leave a Reply