Kjemiske reagenser og antistoffer
Bee venom collection
giften ble samlet inn ved hjelp av arbeidere og dronninger fra flere ulike bestander av Apid bier., Venom prøver fra Europeiske honningbier (Apis mellifera) og buff-tailed humler (Bombus terrestris audax) stammer fra Perth (Australia), Dublin (Irland), London (England). Honeybee giften ble samlet inn fra 30 arbeidere i hver av de tre forskjellige kolonier fra en apiary eller gården som beskrevet. Honeybee giften fra Australia ble samlet inn fra en apiary vedlikeholdt av Centre for Integrative Bee Forskning (CIBER), som ligger ved University of Western Australia (UWA: -31.980151, 115.817919)., Honeybee giften fra Irland ble samlet inn fra en koloni på en apiary ved Trinity College Dublin (53.343933, -6.254635), og de to andre kolonier fra gårder i nærheten av Glasnevin (53.383245, -6.276333) og Blanchardstown (53.384220, -6.375979). Honeybee og bumblebee giften fra England ble samlet inn ved Royal Holloway University of London (51.425626, -0.562987). Bumblebee giften ble samlet inn fra 20 arbeidere fra hver av 2 kjøpt kommersielt kolonier, med én queensize-humler fra hver av disse to kolonier som brukes for innsamling av queen bumblebee venom., Uavhengig biologiske master mix ble forberedt ved å holde giften fra forskjellige kolonier separat, med venom 312 bier samlet inn totalt.
Kjertel giften ble samlet inn ved manuell disseksjon. Biene ble fanget nær inngangen av strukturen for honningbier, eller direkte fra kolonien for humler, og bedøvet med karbondioksid og kald på is. Sting-apparat ble dissekert fra hver enkelt, da giften kjertelen fjernes og plasseres i fosfat-fosfatbufret saltløsning (PBS)., Kjertler var gjennomboret med en Needle Terumo (25 G × 5/8) og sentrifugerte (13,000 g, 10 min, 4 °C), og supernatanten samles inn, inneholder giften i flytende suspensjon. Protein konsentrasjon av hver master mix ble kvantifisert med et Vaskemiddel som er Kompatible Protein Assay (Bio-Rad), måling av absorbans ved 750 nm med et Millennium Vitenskap BioTek PowerWave XS2 (Gen 5 1.11 Programvare, Versjon 1.11.5). Hver master mix var så alikvotert og lagret ved -80 °C.,
Celle linjer og kultur betingelser
Alle cellelinjene ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), med unntak for HEK293FT celler som ble kjøpt fra Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australia), SUM149 og SUM159 som ble innhentet fra Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA), og T11 og B. 15 celler som ble godt levert av Charles Perou og Lyuba Varticovski fra University of North Carolina i Chapel Hill og National Institutes of Health, henholdsvis. T11 og B. 15 er svært godt preget celle lines37,38.,
Cellene ble inkubert ved 37 °C og 5% CO2 og supplert med 1% antibiotika–antimycotic. HDFa (normale primære voksen menneskelige dermal fibroblast) cellene ble dyrket i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS). MCF 10A og MCF-12A (human mammary udødeliggjort epitelceller, nontransformed) ble opprettholdt i DMEM/F-12 med tillegg (5% føtalt hest serum, 20 ng/mL epidermal growth factor, 10 µg/µL insulin, 100 ng/mL kolera-toksin, og 500 ng/mL hydrokortison). NIH/3T3 (murin embryonale fibroblast) cellene ble opprettholdt i DMEM med 10% FBS., HEK293FT (human [menneskets nyre 293 celler stabilt uttrykker SV40 stor T-antigen) ble dyrket i DMEM med 10% FBS og kosttilskudd (1% glutamin og 0,4 mg/mL G418 Geneticin, Gibco). MCF7 (human luminal En brystkreft) ble opprettholdt i MEM α med 10% FBS og kosttilskudd (1% hver av natrium pyruvate, sodium bicarbonate, og ikke-essensielle aminosyrer). T-47D og ZR-75-1 (både menneskelige luminal En brystkreft) ble dyrket i RPMI med 10% FBS. MDA-MB-231 (human claudin-lave brystkreft) ble dyrket i DMEM med 10% FBS., SUM149 (human basal-like brystkreft) ble dyrket i F-12 med 10% FBS. SUM159 (human claudin-lave brystkreft) ble dyrket i F-12 med 5% FBS og kosttilskudd (5 µg/mL insulin og 1 µg/mL hydrokortison). MDA-MB-453 (human HER2-beriket brystkreft) ble dyrket i DMEM med 10% FBS. SKBR3 (human HER2-beriket brystkreft) ble dyrket i RPMI med 10% FBS og 1% natrium pyruvate. p53− T11 (murin claudin-lave brystkreft) ble opprettholdt i RPMI 1640 medium med 10% FBS. BRCA− B. 15 (murin basal-like brystkreft) ble opprettholdt i RPMI 1640 medium med 10% FBS.,
Celle-livskraftig analyser
celleviabilitet ble bestemt av Selvlysende celleviabilitet Analysen i henhold til leverandørens protokollen. Cellene ble belagt i 96-brønns kultur-plater og inkubert ved 37 °C og 5% CO2 for 24 h. For dose–respons-analyser, media ble forkastet og erstattet med medier som inneholder angitt konsentrasjoner av bee venom eller peptid og kultivert for 24 h., For celleviabilitet over 60 min, celler ble behandlet med IC50 av honeybee gift eller melittin for hver celle-linje for kort tid intervaller over 1 h, og levedyktigheten bestemt umiddelbart etter behandling. For å finne ut levedyktighet, cellene ble inkubert med CellTiter-Glo (CTG) 2.0 Reagens for 10 min. Celleviabilitet ble kvantifisert ved å måle verdien ved hjelp av en Ser 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer). Eksperimentene ble utført i biologiske replikater (n = 3).,
Produksjon av primære monoklonalt antistoff mot melittin
Antistoff-produksjonen ble utført i samsvar med protokoller som er godkjent av Dyr Etikk Komité av Harry Perkins Institute of Medical Research. Kvinnelig A/J mus ble vaksinert med honeybee venom samlet i Australia. Musene fikk intraperitoneal injeksjon av 12 µg av giften i Komplett Freund er Adjuvans (Difco), etterfulgt av en økning i Ufullstendig Freund er Adjuvant på Dag 29 og en vandig løft i PBS på 7 µg/mus på Dagen 49. Mus ble fjernet på Dag 60, og sera ble testet av ELISA., Den beste responder ble styrket med 7 µg av honeybee gift i PBS 4 dager før fusjon. Celler ble smeltet sammen med Sp2/O myelom celler i henhold til standard procedures82. Antistoff-inneholder supernatants ble undersøkt av ELISA. Hybridom klone 3B9 ble valgt for videre studier. Antistoffet ble produsert av økende hybridom celler i bioreactors i Hybridom Serum Frie Medium (Gibco). Antistoffet ble renset av protein G-Sepharose kromatografi. Renset antistoff var dialyzed i PBS (pH 7.3). Antistoffet ble heretter referert til som anti-melittin antistoff (3B9).,
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Venoms og peptider var belagt ut i klare kurve-basert 96-brønns plater på 5 µg/mL i karbonat-buffer og inkubert ved 4 °C i 24 timer. Væsken ble fjernet, og platene er vasket tre ganger i en løsning på 0,05% TWEEN-20 («Tween-20,» Sigma-Aldrich) i PBS. Den primære antistoff ble lagt til brønnene med 1:2 fortynninger fra 10 µg/mL oppløsningsvæske (0.1% bovint serum albumin (BSA) i PBS), og inkubert for 1 time ved romtemperatur. Den primære antistoff ble fjernet, og platene er vasket tre ganger på 0.,05% Tween-20 i PBS. Den polyklonale geit anti-mus IgG-γ-kjede-sekundære antistoffet ble lagt til brønnene (1:1000 i oppløsning) og inkubert for 1 time ved romtemperatur. Den primære antistoff ble fjernet, og platene er vasket tre ganger i trinn på 0,05% Tween-20 i PBS. ELISA-utvikling-bufferen, kan en løsning av renset vann som inneholder 10% sitronsyre (pH 4.2), 2% ABTS, og 0,1% H2O2, ble lagt til brønnene, og platene ble inkubert i mørke ved romtemperatur i 15 min., Absorbansen ble registrert ved 405 nm ved hjelp av VICTOR Lys plateavleser med Wallac 1420 Manager-Programvare (PerkinElmer). Kontrollen var musen monoklonale IgG-antistoff (28/00 8C1-6) som reagerer med menneskelig IL-12, påføres melittin peptid på ELISA-plate. Eksperimentene ble utført i biologiske replikater (n = 3).
Anti-melittin antistoff konkurranse eksperimenter
HDFa og SUM159 celler ble belagt i 96-brønns kultur-plater og inkubert ved 37 °C og 5% CO2 for 24 h., Økende konsentrasjoner av anti-melittin antistoff ble inkubert med IC50 konsentrasjoner av honeybee gift eller melittin for hver celle-linje for 1 time ved romtemperatur, og deretter lagt til cellene for 24 h. Celleviabilitet ble bestemt som beskrevet i «celleviabilitet analyser». Eksperimentene ble utført i biologiske replikater (n = 3).
Western blot
Celler ble belagt på 6-bra plater på en tetthet på 300,000 celler/godt og inkubert ved 37 °C og 5% CO2 for 24 h., Cellekultur eksperimenter ble utført som beskrevet, og deretter standard Western blot-protokollen ble fulgt opp som beskrevet her. Cellene ble vasket med kaldt PBS og lysert med kaldt protein lyse buffer (2% sodium dodecyl sulfat (SDS), 125 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8). Prøvene ble sonicated for 10 s på 10 mA, og protein konsentrasjoner kvantifiseres med Vaskemiddel Kompatibel Protein Assay (Bio-Rad). Like mengder av proteiner, ble blandet med loading buffer (Laemmli Eksempel Buffer, Bio-Rad) supplert med reduksjonsmiddel ditiotreitol (DTT)., Protein prøvene ble denaturert ved koking ved 95 °C i 5 min, som er lagt inn i Mini-PROTEAN prefabrikerte gur (Bio-Rad) og utsatt for elektroforese ved 100 V, og trykk deretter overført til PVDF membran (Bio-Rad) med den Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) for 7 min. Membraner ble inkubert med TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, og 0.1% Tween-20) med 5% nonfat melk til å blokkere ikke-bindende. Membraner ble inkubert over natten ved 4 °C med primær antistoff utvannet i 3% BSA og 0.02% natriumazid., Signalet ble oppdaget med Luminata Crescendo Western HRP-Substrat (Millipore) med ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) kjører Bilde Lab Software (Bio-Rad, Versjon 6). Western blot, stammer fra det samme eksperimentet og behandles parallelt. Ubeskårne skanninger av Western blot er gitt i Utfyllende Fiken. 10-15.
flowcytometri
Apoptosis og nekrose ble vurdert ved hjelp av Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biovitenskap) i henhold til produsentens protokollen. SUM159 celler ble belagt i 6-godt kultur-plater for 24 h., Media ble deretter forkastet og erstattet med medier som inneholder honeybee gift eller melittin (IC50 konsentrasjoner) og dyrket i 60 min. Cellene ble samlet inn med trypsin og media, og sentrifugerte (1000g, 5 min, 24 °C), skylt med kaldt PBS, sentrifugerte (1000g, 5 min, 24 °C), og resuspendert i 1× bindende buffer. Cellene ble forberedt til en konsentrasjon på 1 million celler/mL i 1× bindende buffer. Prøvene ble inkubert med FITC og PI (5 µL av hver) i mørke i 15 min., Tilstedeværelse av levende, døde, apoptotic, eller nekrotisk celler ble vurdert med BD Accuri C6 Blokkdel (BD Biovitenskap, San Jose, USA) med BD Accuri C6-programvare, og analysert med FlowJo™ (Ashland, USA, Windows Versjon 7). Eksperimentene ble utført i biologiske replikater (n = 3). Den avgrensning strategier er presentert i Supplerende Fig. 16.
Live-celle mikroskopi
SKBR3 celler ble belagt i en glass-bunn mikrotiterplateleser tallerken (10 x 35 mm, MatTek) og inkubert i 24 h., Den mikrotiterplateleser retten ble til venstre for å la i et NIKON Eclipse Ti konfokal mikroskopet scenen-top-inkubasjon kammer (37 °C og 5% CO2) i 20 min. 20× mål ble brukt med Kohler justering, og det ble tatt bilder hvert minutt fra 10 min før 1 t etter behandling med IC50 av honeybee venom samlet i Australia., Forfatterne erkjenner fasiliteter og vitenskapelig og teknisk assistanse som tilbys av National Imaging-Anlegget, en Nasjonal Collaborative Research Infrastructure-Strategi (NCRIS) – evne, samt den Australske Regjering & Microanalysis Forskning Anlegget, både ved Senter for Mikroskopi, Karakterisering og Analyse (CMCA), UWA, et anlegg som er finansiert av Universitetet, Stat og Commonwealth Regjeringer.,
Skanning elektron mikroskopi
Glass dekkglass (12 mm diameter, Menzel, Thermo Fisher Scientific) var belagt med poly-l-lysin hydrobromide (Sigma-Aldrich) for 20 min og så vasket to ganger med rent vann. SUM159 celler ble belagt på objektglass ved en tetthet av 62,500 celler/godt og inkubert ved 37 °C og 5% CO2 for 24 h. Cellene ble vasket to ganger med PBS og deretter behandlet med bil eller IC50 konsentrasjoner av honeybee gift og melittin for 1 h., Cellene ble vasket to ganger med PBS, deretter festes med 4% formaldehyd i PBS i 25 min, og deretter vasket igjen tre ganger med PBS. I forberedelse for mikroskopi, prøvene var nedsenket i 2,5% glutaraldehyde og ble inkubert ved 4 °C for 2 h. Prøvene ble vasket med avionisert vann og midt i økende konsentrasjoner av etanol (50%, 70%, 95%, 100%, og da 100% absolutt «tørr» etanol). Mellom hver fordypning, prøvene var dehydrert i en spesialisert mikrobølgeovn (PELCO, BioWave 34700 Laboratorium Mikrobølgeovn System)., Den dehydrering prosessen ble gjennomført med et Kritisk Punkt Tørking Apparater E3000 å erstatte etanol i utvalget med superkritisk CO2. Bearbeidede coverslips var montert på SEM mounts (ProSciTech) med karbon faner. Prøvene ble belagt med 3-nm platinum for å gjøre dem elektronisk ledende før de blir visualisert under scanning elektron mikroskop (Zeiss 1555 VP-FESEM) på CMCA, UWA. Bildene ble tatt med i-linse og detektor på 2.6 mm arbeider avstand, 30-mikrometer blenderåpning, og en akselererende spenning på 5 kV., Bildene ble analysert med image analysis software FIJI (ImageJ)83.
Immunfluorescens
Glass dekkglass (12 mm diameter, Menzel, Thermo Fisher Scientific) ble plassert i 24-godt plater og belagt med poly-l-lysin (Sigma-Aldrich) for 20 min og så vasket to ganger med rent vann. SUM159 celler ble belagt på objektglass og inkubert ved 37 °C og 5% CO2 for 24 h. Cellene ble behandlet for 30 min med bil, eller IC50 av honeybee venom, melittin, RGD1-melittin, og tilsvarende molar konsentrasjon som melittin for DEDE-melittin., Cellene ble vasket to ganger med PBS, deretter festes med 4% paraformaldehyde i PBS i 25 min, og deretter vasket igjen tre ganger med PBS. Ikke-spesifikk binding ble blokkert ved å bruke 5% Normal Geit Serum (Thermo Fisher Scientific) i PBS for 1 time ved romtemperatur. Primær-antistoffer ble lagt til cellene, inkludert monoklonale anti-melittin antistoff (5 µg/mL) og 1:500 av anti-EGFR (Abcam). Prøvene ble inkubert med milde rocking ved 4 °C over natten., Cellene ble vasket tre ganger med PBS, og deretter inkubert med 1:500 av Alexa Fluor 488 geit anti-mus sekundært antistoff, 1:500 av Alexa Fluor 594 geit anti-kanin sekundært antistoff, og Hoechst (1:5000) i PBS i romtemperatur i 1 time. Prøvene ble skylt tre ganger med PBS og monteres på glass dekkglass med SlowFade Diamond Antifade Væsken (Thermo Fisher Scientific). Lysbilder ble fotografert med konfokal fluorescens Nikon Ti-E invertert mikroskop. Bildene ble tatt ved hjelp av en 20× air mål (NA 0.,75), og sekvensiell eksitasjon med bølgelengder av 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (Alexa Fluor 488 sekundært antistoff), og 561 nm (Alexa Fluor 594 sekundært antistoff). Bildene ble samlet inn ved hjelp av NIS-C Elementer Programvare og bearbeidet ved hjelp av FIJI (ImageJ) på CMCA83.
Bioluminescence resonans energi overføring (BRET)
Reseptor–ligand vekselsvirkningene, ble vurdert med BRET, ved hjelp av en metode som ligner på den som er beskrevet previously84,85., BRET innebærer nonradiative overføring av energi (dipol–dipol) mellom to proteiner eller molekyler av interesse merket med enten en donor luciferase eller en akseptor separeres fluoroforen etter underlaget oksidasjon av luciferase og påfølgende utslipp av light54. FITC koder ble conjugated til N-terminus av melittin (FITC-melittin) og DEDE-melittin (FITC–DEDE-melittin). HEK293 celler stabilt uttrykker SV40 stor T-antigen (HEK293FT) var belagt på 6-bra plater på en tetthet på 550.000 celler/godt for 24 h., HEK293FT celler ble transfekte med plasmidene inneholder cDNA for NanoLuc-EGFR ved hjelp av FuGENE. Kort, plasmider cDNA ble inkubert i 10 min ved romtemperatur med en blanding av transfection reagens og serum-gratis DMEM på et forhold på 10 ng/µL NanoLuc-EGFR: 4 µL av FuGENE: 100 µL av SFM. Mix ble lagt til HEK293FT celler på en endelig konsentrasjon på 10 ng/µL NanoLuc-EGFR per brønn 6-brønns plate, og celler inkubert i 24 h. Cellene ble vasket med PBS og frittstående med trypsin, deretter samlet i media som inneholder 5% føtalt kalveserum i phenol red-gratis DMEM., Cellene ble belagt 50.000 celler/godt inn i poly-l-lysin-belagt 96-brønns hvite plater og inkubert i 24 h. For både metning og kinetisk BRET-analyser, to filtre ble brukt til å samtidig måle på kort og lang bølgelengde verdien tilsvarer utslipp bølgelengder av donor og godkjenner molekyler, henholdsvis.
For real-time ligand association kinetikk eksperimenter, media ble fjernet fra cellene ble inkubert med 50 µL/brønn av NanoLuc substrat furimazine til en endelig konsentrasjon på 10 µM utvannet i Hank ‘ s Balanced Salt-Løsning (HBSS)., Cellene ble deretter likevekt i CLARIOstar plate reader (BMG Labtech, Australia) for 5 min å spille inn basal målinger. Den ligander (TAMRA-EGF, FITC-melittin, og FITC–DEDE-melittin) ble deretter lagt til et utvalg av riktig endelige konsentrasjoner, og NanoBRET innspillinger som er tatt hver 90 s i 60 min ved 37 °C. For metning eksperimenter, media ble fjernet fra cellene, og en rekke konsentrasjoner av TAMRA-EGF, FITC-melittin, og FITC–DEDE-melittin lagt i nærvær eller fravær av konkurrerende konsentrasjon (1 mikrometer) av umerket EGF og inkubert ved 37 °C i 60 min i mørket., Furimazine ble det lagt til en endelig konsentrasjon på 10 µM. Opptakene ble gjort ved hjelp av LUMIstar Omega (BMG Labtech, Australia). Data er presentert som «rå BRET-ratio,» avledet fra forholdet mellom den lange bølgelengden utslipp (godkjenner) over kort bølgelengde utslipp (giver). Eksperimentene ble utført i biologiske replikater (n = 3).
Analyse av kombinerte virkninger av rusmidler
Honeybee gift eller melittin ble kombinert med docetaxel og administreres ved konsentrasjoner som er angitt i en nonconstant forhold i T11 celler for 24 h., Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av CellTiter-Glo som nevnt tidligere. Den kombinerte effekten av honeybee gift eller melittin med docetaxel ble vurdert av median dose-effekt-metoden ved å bruke CompuSyn Programvare (ComboSyn). Denne metoden bestemmer en CI basert på effekten av en kombinasjon mellom to agenter (der CI < 1 er synergistisk, CI > 1 er antagonistiske, og CI = 1 er additiv)56. Eksperimentene ble utført i biologiske replikater (n = 3).,
Dyr modell og behandlinger
Disse dyr eksperimenter ble utført i samsvar med protokoller som er godkjent av Dyr Etikk Komité av UWA. For å simulere en avansert modell av claudin-lave brystkreft, 2.5 × 105 T11 celler ble suspendert i serum-frie medier og BD Matrigel Matrix Høy Konsentrasjon (BD Bioscience) i en 1:1-forhold til et totalt volum på 100 µL og injiseres subkutant i flankene av 5-ukers gamle BALB/cJ kvinner (Dyr Ressurser Sentrum, WA, Australia) ved hjelp av en 26-G nål., Den T11 celler som ble brukt var lentivirally transduced med ZsGreen-luciferase konstruere og sortert tre ganger for å oppnå en berikelse bedre enn 99% av luciferase-positive celler. Melittin ble suspendert i Milli-Q vann + 5% druesukker. Docetaxel (i pulverform) var suspendert i 25% TWEEN 80 (Sigma-Aldrich), og 75% av en blanding av 15.25:84.75 (v/v) løsning av absolutt etanol og renset vann og oppbevart ved -20 °C. Umiddelbart før behandling, docetaxel var fersk utvannet i Milli-Q vann + 5% druesukker i den nødvendige endelig konsentrasjon., Tre dager etter generasjon av T11 svulster (~50 mm3), mus ble randomisert i 4 grupper (n = 12 mus/gruppe). Behandlingene ble injisert intratumorally på dager 3, 5, 7, 9, 11, 13, og 15 innlegg grader av T11 celler, med bil, melittin (5 mg/kg), docetaxel (7 mg/kg), eller en kombinasjon av melittin (5 mg/kg) og docetaxel (7 mg/kg). Dyrene ble overvåket for tumor størrelse hver 2 dager, og volumene som er beregnet av endret ellipsoide formel (volum = width2 × lengde/2). Dyrene var humant ofret når svulster nådd 800 mm3.,
Immunohistochemical analyse av svulster
Tumor vev ble fiksert på 4% paraformaldehyde, vasket tre ganger i PBS, og til venstre i 70% etanol. Svulster ble innebygd i parafin, og 5 µm deler var forberedt. For hematoksylin/eosin-farging, lysbilder var dewaxed, hydrert ved hjelp av en synkende løsning bank av etanol, farget med Gill ‘ s hematoksylin og dehydrert med 70% etanol, farget med eosin, ytterligere dehydrert ved hjelp av 100% etanol, ryddet ved hjelp av toluen, og montert i coverslips ved hjelp av Acrymount IHC montering media (StatLab)., Tumor cell apoptosis ble bestemt i vevsprøver av TUNEL i analysen (In Situ celledød Detection Kit, Roche).
Bioluminescence imaging
for Å nøyaktig spore endringer i in vivo tumor vekst med behandlinger, har vi utført bioluminescence analyser ved hjelp av Måleinstrumentet IVIS Lumina II imaging system på CMCA, UWA. Analysene ble utført hver 2 dager etter generasjon av svulster. Mus ble injisert intraperitoneally med 200 µL av D-Luciferin (Cayman Kjemisk) på endelig konsentrasjon på 150 mg/kg oppløst i PBS før de blir bedøvet på 4% isofluran., Når bedøvet, mus ble plassert på innsiden av det prewarmed chamber of bioluminescence imager og avbildes 7-12 minutter etter injeksjon, under 2% isofluran, til bioluminescence signal intensitet hadde nådd en steady state.
Statistiske analyser
Alle data ble hentet fra flere eksperimenter utført minst i triplikat. Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism v8 (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft), og SPSS Prediktiv Analytics Programvare (IBM, Versjon 26)., For celle-livskraftig analyser data ble normalisert til den gjennomsnittlige verdien av bilens tilstand, som ble ansett som 100% levedyktighet, med IC50s kommer i GraphPad Prism. For immunohistochemistry i behandlet T11 svulster til å oppdage p-HER2 (Tyr1248) og p-EGFR (Tyr1068), bilen ble normalisert til 100%., Der det er hensiktsmessig og som tiltalt i hovedteksten, statistisk signifikans ble fastsatt ved hjelp gruppert to-tailed Student ‘s t-tester, gruppert en-veis ANOVA med Tukey’ s HSD post hoc test korrigere for flere sammenligninger, to-veis ANOVA med gjentatt tiltak etterfulgt av Sidak eller Tukey ‘ s multiple comparison test, eller en generalisert lineær modell (GLM). For alle tester, forskjeller ble betraktet som signifikant på p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), og p < 0.001 (***).,
Rapportering oppsummering
Ytterligere informasjon om forskning design er tilgjengelig i Nature Research Rapportering Oppsummering knyttet til denne artikkelen.
Leave a Reply