Reagenti chimici e anticorpi
, Campioni di veleno raccolti da api europee (Apis mellifera) e bombi dalla coda buff (Bombus terrestris audax) provenivano da Perth (Australia), Dublino (Irlanda) e Londra (Inghilterra). Veleno di api è stato raccolto da 30 lavoratori di ciascuna delle tre diverse colonie da un apiario o fattoria come descritto. Il veleno dell’ape dall’Australia è stato raccolto da un apiario mantenuto dal centro per la ricerca integrativa dell’ape (CIBER), situato all’università dell’Australia occidentale (UWA: -31.980151, 115.817919)., Il veleno di api dall’Irlanda è stato raccolto da una colonia in un apiario al Trinity College di Dublino (53.343933, -6.254635), e le altre due colonie da fattorie vicino a Glasnevin (53.383245, -6.276333) e Blanchardstown (53.384220, -6.375979). Honeybee e bumblebee venom dall’Inghilterra sono stati raccolti presso la Royal Holloway University di Londra (51.425626, -0.562987). Bumblebee venom è stato raccolto da 20 lavoratori da ciascuna delle 2 colonie acquistate commercialmente, con i bombi single-queen da ciascuna di queste due colonie utilizzate per la raccolta di queen bumblebee venom., I master mix biologici indipendenti sono stati preparati mantenendo separati il veleno di diverse colonie, con il veleno di 312 api raccolte in totale.
Il veleno ghiandolare è stato raccolto mediante dissezione manuale. Le api venivano catturate vicino all’ingresso dell’alveare per le api da miele, o direttamente dalla colonia per i bombi, e anestetizzate con anidride carbonica e raffreddate sul ghiaccio. L’apparato pungiglione è stato sezionato da ogni individuo; poi la ghiandola veleno rimosso e posto in soluzione salina fosfato-tamponata (PBS)., Le ghiandole sono state forate con un ago Terumo (25 G × 5/8) e centrifugate (13.000 g, 10 min, 4 °C), e il surnatante raccolto, contenente veleno in sospensione liquida. La concentrazione proteica di ogni master mix è stata quantificata con un saggio proteico compatibile con detergenti (Bio-Rad), misurando l’assorbanza a 750 nm con un Millennium Science BioTek PowerWave XS2 (Software Gen 5 1.11, versione 1.11.5). Ogni master mix è stato quindi aliquotato e conservato a -80 °C.,
linee di Cellule di cultura e condizioni
Tutte le linee cellulari sono state acquistate dalla American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), fatta eccezione per HEK293FT le cellule che sono state acquistate da Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australia), SUM149 e SUM159 che sono stati ottenuti da Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA), e T11 e B. 15 cellule che sono state gentilmente concesse da Carlo Perù e Lyuba Varticovski dall’Università di North Carolina a Chapel Hill e National Institutes of Health, rispettivamente. T11 e B. 15 sono linee cellulari molto ben caratterizzate37, 38.,
Le cellule sono state incubate a 37 °C e al 5% di CO2 e integrate con l ‘ 1% di antibiotico–antimicotico. Le cellule HDFa (fibroblasto dermico umano adulto primario normale) sono state coltivate in DMEM con siero bovino fetale al 10% (FBS). MCF 10A e MCF-12A (cellule epiteliali immortalate mammarie umane, non trasformate) sono state mantenute in DMEM/F-12 con integratori (siero di cavallo fetale 5%, fattore di crescita epidermico 20 ng/mL, insulina 10 µg/µL, tossina del colera 100 ng/mL e idrocortisone 500 ng/mL). Le cellule NIH/3T3 (fibroblasti embrionali murini) sono state mantenute in DMEM con FBS al 10%., HEK293FT (rene embrionale umano 293 cellule che esprimono stabilmente l’antigene SV40 large T) è stato coltivato in DMEM con 10% FBS e integratori (1% glutammina e 0,4 mg/mL G418 Geneticina, Gibco). MCF7 (human luminal A breast cancer) è stato mantenuto in MEM α con 10% FBS e integratori (1% ciascuno di piruvato di sodio, bicarbonato di sodio e amminoacidi non essenziali). T-47D e ZR-75-1 (entrambi cancro al seno umano luminal A) sono stati coltivati in RPMI con 10% FBS. MDA-MB-231 (cancro al seno claudin-basso umano) è stato coltivato in DMEM con 10% FBS., SUM149 (cancro al seno basale-simile umano) è stato coltivato in F-12 con 10% FBS. SUM159 (carcinoma mammario umano a basso contenuto di claudina) è stato coltivato in F-12 con FBS al 5% e integratori (5 µg/mL di insulina e 1 µg/mL di idrocortisone). MDA-MB-453 (human HER2-enriched breast cancer) è stato coltivato in DMEM con 10% FBS. SKBR3 (human HER2-enriched breast cancer) è stato coltivato in RPMI con 10% FBS e 1% piruvato di sodio. p53-T11 (cancro al seno claudin-basso murino) è stato mantenuto nel mezzo RPMI 1640 con FBS 10%. BRCA-B. 15 (carcinoma mammario basal-simile murino) è stato mantenuto nel mezzo RPMI 1640 con FBS del 10%.,
Analisi di vitalità cellulare
La vitalità cellulare è stata determinata dal test di vitalità cellulare luminescente secondo il protocollo del fornitore. Le cellule sono state placcate in piastre di coltura a 96 pozzetti e incubate a 37 °C e 5% di CO2 per 24 h. Per i saggi dose-risposta, i supporti sono stati scartati e sostituiti con supporti contenenti concentrazioni indicate di veleno d’api o peptide e coltivati per 24 h., Per la vitalità cellulare oltre 60 min, le cellule sono state trattate con l’IC50 di veleno di api o melittina per ogni linea cellulare per brevi intervalli di tempo oltre 1 h, e la vitalità determinata immediatamente dopo il trattamento. Per determinare la vitalità, le cellule sono state incubate con il reagente CellTiter-Glo (CTG) 2.0 per 10 min. La vitalità cellulare è stata quantificata misurando la luminescenza utilizzando un lettore Multilabel EnVision 2102 (PerkinElmer). Gli esperimenti sono stati condotti in repliche biologiche (n = 3).,
La produzione di un anticorpo monoclonale primario contro la melittina
La produzione di anticorpi è stata eseguita in conformità con i protocolli approvati dal Comitato etico animale dell’Harry Perkins Institute of Medical Research. Topi femmina A / J sono stati immunizzati con veleno di api raccolte in Australia. I topi hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali di 12 µg di veleno nell’adiuvante di Freund completo (Difco), seguite da una spinta nell’Adiuvante di Freund incompleto il giorno 29 e una spinta acquosa in PBS a 7 µg/topo il giorno 49. I topi sono stati dissanguati al giorno 60 e i sieri sono stati testati da ELISA., Il miglior responder è stato potenziato con 7 µg di veleno di api in PBS 4 giorni prima della fusione. Le cellule della milza sono state fuse con cellule di mieloma Sp2/O secondo procedure standard82. I supernatanti contenenti anticorpi sono stati sottoposti a screening ELISA. Hybridoma clone 3B9 è stato selezionato per ulteriori studi. L’anticorpo è stato prodotto facendo crescere le cellule di ibridoma in bioreattori in mezzo libero da siero di ibridoma (Gibco). L’anticorpo è stato purificato mediante cromatografia della proteina G-sepharosio. L’anticorpo purificato è stato dializzato in PBS (pH 7.3). L’anticorpo è stato d’ora in poi denominato anticorpo anti-melittina (3B9).,
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Veleni e peptidi sono stati placcati in piastre a 96 pozzetti a 5 µg / mL in tampone carbonato e incubati a 4 °C per 24 h. Il liquido è stato rimosso e le piastre lavate tre volte in una soluzione di 0,05% TWEEN-20 (“Tween-20”, Sigma-Aldrich) in PBS. Gli anticorpi primari sono stati aggiunti ai pozzetti con diluizioni 1:2 a partire da 10 µg/mL in diluente (0,1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS) e incubati per 1 ora a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari sono stati rimossi e le piastre lavate tre volte in 0.,05% Tween-20 in PBS. L’anticorpo secondario policlonale goat anti-mouse IgG γ-chain-specific è stato aggiunto ai pozzetti (1: 1000 in diluente) e incubato per 1 h a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari sono stati rimossi e le piastre lavate tre volte in 0,05% Tween-20 in PBS. Il tampone ELISA, una soluzione di acqua purificata contenente acido citrico al 10% (pH 4,2), 2% ABTS e 0,1% H2O2, è stato aggiunto ai pozzetti e le piastre sono state incubate al buio a temperatura ambiente per 15 min., L’assorbanza è stata registrata a 405 nm utilizzando il lettore di piastre luminose VICTOR con il software Wallac 1420 Manager (PerkinElmer). Il controllo è stato l’anticorpo monoclonale IgG di topo (28/00 8C1-6) che reagisce con IL-12 umano, applicato al peptide melittinico sulla piastra ELISA. Gli esperimenti sono stati condotti in repliche biologiche (n = 3).
Esperimenti di competizione con anticorpi anti-melittina
Le cellule HDFa e SUM159 sono state placcate in piastre di coltura a 96 pozzetti e incubate a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore., Le concentrazioni crescenti dell’anticorpo anti-melittina sono state incubate con le concentrazioni IC50 di veleno di api o melittina per ogni linea cellulare per 1 h a temperatura ambiente e quindi aggiunte alle cellule per 24 h. La vitalità cellulare è stata determinata come descritto in “Analisi di vitalità cellulare”. Gli esperimenti sono stati condotti in repliche biologiche (n = 3).
Western blot
Le celle sono state placcate su piastre a 6 pozzetti ad una densità di 300.000 celle / pozzetto e incubate a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore., Esperimenti di coltura cellulare sono stati condotti come descritto, e poi il protocollo standard Western blot è stato seguito come descritto nel presente documento. Le cellule sono state lavate con PBS freddo e lisate con tampone di lisi delle proteine fredde (2% di sodio dodecil solfato (SDS), 125 mmol/L Tris-HCl, pH 6,8). I campioni sono stati sonicati per 10 s a 10 mA e le concentrazioni proteiche sono state quantificate con il saggio di proteine compatibili con il detergente (Bio-Rad). Quantità uguali di proteine sono state mescolate con tampone di carico (tampone campione Laemmli, Bio-Rad) integrato con l’agente riducente ditiotreitolo (DTT)., I campioni di proteine sono stati denaturati facendo bollire a 95 °C per 5 min, caricati in gel prefabbricati Mini-PROTEICI (Bio-Rad) e sottoposti ad elettroforesi a 100 V, e poi trasferiti su membrane PVDF (Bio-Rad) con il sistema di trasferimento Trans-Blot Turbo (Bio-Rad) per 7 min. Le membrane sono state incubate con TBST (20 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl e 0,1% Tween-20) con latte non grasso al 5% per bloccare il legame non specifico. Le membrane sono state incubate durante la notte a 4 ° C con gli anticorpi primari diluiti nel 3% di BSA e nello 0,02% di sodio azide., Il segnale è stato rilevato con Luminata Crescendo Western HRP Substrate (Millipore) con il ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) che esegue il software Image Lab (Bio-Rad, versione 6). Le Western blot sono state derivate dallo stesso esperimento ed elaborate in parallelo. Le scansioni non tagliate delle Western blot sono fornite in fichi supplementari. 10–15.
Citometria a flusso
L’apoptosi e la necrosi sono state valutate utilizzando l’Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences) secondo il protocollo del produttore. Le celle SUM159 sono state placcate in piastre di coltura a 6 pozzetti per 24 h., I supporti sono stati poi scartati e sostituiti con supporti contenenti veleno di api o melittina (concentrazioni IC50) e coltivati per 60 min. Le cellule sono state raccolte con tripsina e media e centrifugate (1000g, 5 min, 24 °C), lavate con PBS freddo, centrifugate (1000g, 5 min, 24 °C) e risospese in 1× binding buffer. Le cellule sono state preparate ad una concentrazione di 1 milione di cellule / mL in 1× tampone di legame. I campioni sono stati incubati con FITC e PI (5 µL di ciascuno) al buio per 15 min., La presenza di cellule vive, morte, apoptotiche o necrotiche è stata valutata con il citometro BD Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, USA) con il software BD Accuri C6 e analizzata con FlowJo™ (Ashland, USA, Windows Versione 7). Gli esperimenti sono stati condotti in repliche biologiche (n = 3). Le strategie di gating sono presentati in Fig supplementare. 16.
Microscopia a cellule vive
Le cellule SKBR3 sono state placcate in una micropiastra con fondo di vetro (10 × 35 mm, MatTek) e incubate per 24 ore., Il microwell dish è stato lasciato in equilibrio in un microscopio confocale NIKON Eclipse Ti stage – top camera di incubazione (37 °C e 5% CO2) per 20 min. L’obiettivo 20× è stato utilizzato con l’allineamento di Kohler e le immagini sono state scattate ogni minuto da 10 min prima a 1 h dopo il trattamento con l’IC50 di honeybee venom raccolto in Australia., Gli autori riconoscono le strutture e l’assistenza scientifica e tecnica offerta dalla National Imaging Facility, una capacità di National Collaborative Research Infrastructure Strategy (NCRIS), così come la microscopia australiana & Microanalysis Research Facility, sia presso il Centro per la microscopia, la caratterizzazione e l’analisi (CMCA), UWA, una struttura finanziata dall’Università, dai governi statali e del Commonwealth.,
Microscopia elettronica a scansione
Le coperture in vetro (diametro 12 mm, Menzel, Thermo Fisher Scientific) sono state rivestite con bromidrato di poli-l-lisina (Sigma-Aldrich) per 20 min e poi lavate due volte con acqua purificata. Le celle SUM159 sono state placcate sui vetrini ad una densità di 62.500 celle / pozzetto e incubate a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore. Le celle sono state lavate due volte con PBS e poi trattate con vehicle o le concentrazioni IC50 di veleno di api e melittina per 1 ora., Le cellule sono state lavate due volte con PBS, quindi fissate con 4% di formaldeide in PBS per 25 min, quindi lavate nuovamente tre volte con PBS. In preparazione per la microscopia, i campioni sono stati immersi in glutaraldeide al 2,5% e sono stati incubati a 4 ° C per 2 h. I campioni sono stati lavati con acqua deionizzata e immersi in concentrazioni crescenti di etanolo (50%, 70%, 95%, 100%, e poi 100% assoluto etanolo “secco”). Tra ogni immersione, i campioni sono stati disidratati in un forno a microonde specializzato (PELCO, BioWave 34700 Laboratory Microwave System)., Il processo di disidratazione è stato completato con un apparecchio di essiccazione punto critico E3000 per sostituire l’etanolo nel campione con CO2 supercritica. I coprioggetti elaborati sono stati montati su supporti SEM (ProSciTech) con linguette in carbonio. I campioni sono stati rivestiti con platino a 3 nm per renderli elettronicamente conduttivi prima di essere visualizzati al microscopio elettronico a scansione (Zeiss 1555 VP-FESEM) presso CMCA, UWA. Le immagini sono state scattate con il rivelatore in-lens a distanza di lavoro di 2,6 mm, apertura di 30 µm e una tensione di accelerazione di 5 kV., Le immagini sono state analizzate con il software di analisi delle immagini FIJI (ImageJ)83.
Immunofluorescenza
Le coperture in vetro (diametro 12 mm, Menzel, Thermo Fisher Scientific) sono state poste in piastre da 24 pozzetti e rivestite con poli-l-lisina (Sigma-Aldrich) per 20 min e poi lavate due volte con acqua purificata. Le cellule SUM159 sono state placcate sui vetrini e incubate a 37 °C e 5% di CO2 per 24 h. Le cellule sono state trattate per 30 min con veicolo, o l’IC50 di veleno di api, melittina, RGD1-melittina e la concentrazione molare equivalente come melittina per DEDE-melittina., Le cellule sono state lavate due volte con PBS, quindi fissate con 4% di paraformaldeide in PBS per 25 min, quindi lavate nuovamente tre volte con PBS. Il legame anticorpale non specifico è stato bloccato utilizzando siero di capra normale al 5% (Thermo Fisher Scientific) in PBS per 1 h a temperatura ambiente. Sono stati aggiunti anticorpi primari alle cellule, incluso l’anticorpo monoclonale anti-melittina (5 µg/mL) e 1:500 di anti-EGFR (Abcam). I campioni sono stati incubati con una leggera oscillazione a 4 °C durante la notte., Le cellule sono state lavate tre volte con PBS, e quindi incubate con 1:500 di Alexa Fluor 488 di capra anti-topo anticorpo secondario, 1:500 di Alexa Fluor 594 di capra anti-coniglio anticorpo secondario, e Hoechst (1:5000) in PBS a temperatura ambiente per 1 h. I campioni sono stati lavati tre volte con PBS e montati su lamelle di vetro con SlowFade Diamante Antifade Montante (Thermo Fisher Scientific). Le diapositive sono state riprese utilizzando il microscopio invertito Nikon Ti-E a fluorescenza confocale. Le immagini sono state scattate utilizzando un 20× obiettivo aria (NA 0.,75), e l’eccitazione sequenziale utilizzando lunghezze d’onda di 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (Alexa Fluor 488 anticorpo secondario), e 561 nm (Alexa Fluor 594 anticorpo secondario). Le immagini sono state raccolte utilizzando il software NIS-C Elements ed elaborate utilizzando FIJI (ImageJ) a CMCA83.
Bioluminescence resonance energy transfer (BRET)
Le interazioni recettore–ligando sono state valutate con BRET, utilizzando un metodo simile a quello descritto in precedenza84,85., BRET comporta il trasferimento non radiativo di energia (dipolo–dipolo) tra due proteine o molecole di interesse etichettate con una luciferasi donatrice o un fluoroforo accettore dopo ossidazione del substrato da parte della luciferasi e successiva emissione di luce54. I tag FITC sono stati coniugati al terminale N di melittin (FITC-melittin) e DEDE-melittin (FITC–DEDE-melittin). Le cellule HEK293 che esprimono stabilmente l’antigene SV40 large T (HEK293FT) sono state placcate su piastre a 6 pozzetti ad una densità di 550.000 cellule/pozzetto per 24 ore., Le cellule HEK293FT sono state trasfettate con plasmidi contenenti cDNA per NanoLuc-EGFR usando FuGENE. In breve, il cDNA plasmidico è stato incubato per 10 min a temperatura ambiente con una miscela di reagente di trasfezione e DMEM senza siero con un rapporto di 10 ng / µL NanoLuc-EGFR: 4 µL di FuGENE: 100 µL di SFM. La miscela è stata aggiunta alle cellule HEK293FT ad una concentrazione finale di 10 ng / µL NanoLuc-EGFR per pozzetto della piastra 6-well e le cellule incubate per 24 h. Le cellule sono state lavate con PBS e staccate con tripsina, quindi raccolte in supporti contenenti 5% siero di vitello fetale in DMEM privo di fenolo rosso., Le cellule sono state placcate a 50.000 cellule / pozzetto in piastre bianche 96 pozzetti rivestite di poli-l-lisina e incubate per 24 ore. Sia per i test di saturazione che per quelli cinetici di BRET, sono stati utilizzati due filtri per misurare simultaneamente la luminescenza a lunghezza d’onda corta e lunga corrispondente alle lunghezze d’onda di emissione delle molecole donatore e accettore, rispettivamente.
Per esperimenti di cinetica di associazione ligando in tempo reale, il supporto è stato rimosso dalle cellule, che sono state poi incubate con 50 µL / pozzetto del substrato NanoLuc furimazina ad una concentrazione finale di 10 µM diluito in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)., Le cellule sono state poi equilibrate nel CLARIOstar plate reader (BMG Labtech, Australia) per 5 minuti per registrare le letture basali. I ligandi (TAMRA-EGF, FITC-melittina, e FITC–DEDE-melittina) sono stati poi aggiunti ad una serie di corrette concentrazioni finali, e NanoBRET registrazioni effettuate ogni 90 s per 60 min a 37 °C. Per la saturazione di esperimenti, il supporto è stato rimosso dalle cellule, e una gamma di concentrazioni di TAMRA-EGF, FITC-melittina, e FITC–DEDE-melittina aggiunto, in presenza o assenza di una competizione di concentrazione (1 µM) di adenoide FEG e incubate a 37 °C per 60 min al buio., Furimazina è stata aggiunta ad una concentrazione finale di 10 µM. Le registrazioni sono state effettuate utilizzando il LUMIstar Omega (BMG Labtech, Australia). I dati sono presentati come il “rapporto BRET grezzo”, derivato dal rapporto tra l’emissione di lunghezza d’onda lunga (accettore) rispetto all’emissione di lunghezza d’onda corta (donatore). Gli esperimenti sono stati condotti in repliche biologiche (n = 3).
L’analisi degli effetti combinati del farmaco
Il veleno delle api o la melittina sono stati combinati con docetaxel e somministrati alle concentrazioni indicate in un rapporto non costante nelle cellule T11 per 24 ore., La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando CellTiter-Glo come menzionato in precedenza. L’effetto combinato di veleno di api o melittina con docetaxel è stato valutato con il metodo dose-effetto mediano utilizzando il software CompuSyn (ComboSyn). Questo metodo determina un CI in base all’effetto di una combinazione tra due agenti (dove CI < 1 è sinergico, CI > 1 è antagonista e CI = 1 è additivo)56. Gli esperimenti sono stati condotti in repliche biologiche (n = 3).,
Modello animale e trattamenti
Questi esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato Etico Animale dell’UWA. Per simulare un modello avanzato di carcinoma mammario a basso contenuto di claudina, 2,5 × 105 cellule T11 sono state sospese in un mezzo privo di siero e in una matrice BD Matrigel ad alta concentrazione (BD Bioscience) in un rapporto 1:1 per un volume totale di 100 µL e iniettate per via sottocutanea nei fianchi di femmine BALB/cJ di 5 settimane (Animal Resources Centre, WA, Australia) utilizzando un ago da 26 G., Le cellule T11 utilizzate sono state trasdotte lentiviralmente con il costrutto ZsGreen-luciferasi e ordinate tre volte per ottenere un arricchimento superiore al 99% delle cellule luciferasi-positive. Melittin è stato sospeso in Milli-Q acqua + 5% destrosio. Docetaxel (in polvere) è stato sospeso in 25% TWEEN 80 (Sigma-Aldrich), e 75% di una miscela di 15.25:84.75 (v/v) soluzione di etanolo assoluto e acqua purificata e mantenuto a -20 °C. Immediatamente prima dei trattamenti, docetaxel è stato appena diluito in Milli-Q acqua + 5% destrosio alla concentrazione finale richiesta., Tre giorni dopo la generazione di tumori T11 (~50 mm3), i topi sono stati randomizzati in 4 gruppi (n = 12 topi/gruppo). I trattamenti sono stati iniettati per via intratumorale in giorni 3, 5, 7, 9, 11, 13, e 15 dopo inoculazione di cellule T11, con veicolo, melittina (5 mg/kg), docetaxel (7 mg/kg), o una combinazione di melittina (5 mg/kg) e docetaxel (7 mg/kg). Gli animali sono stati monitorati per le dimensioni del tumore ogni 2 giorni e i volumi calcolati dalla formula ellissoide modificata (volume = larghezza2 × lunghezza/2). Gli animali sono stati sacrificati umanamente quando i tumori hanno raggiunto 800 mm3.,
Analisi immunoistochimica dei tumori
I tessuti tumorali sono stati fissati in paraformaldeide al 4%, lavati tre volte in PBS e lasciati in etanolo al 70%. I tumori sono stati incorporati nella paraffina e sono state preparate sezioni da 5 µm. Per la colorazione di ematossilina/eosina, i vetrini sono stati deparaffinati, idratati utilizzando un banco di soluzione decrescente di etanolo, colorati con ematossilina di Gill, disidratati con etanolo al 70%, colorati con eosina, ulteriormente disidratati con etanolo al 100%, eliminati con toluene e montati in coprioggetti utilizzando supporti di montaggio Acrymount IHC (StatLab)., L’apoptosi delle cellule tumorali è stata determinata in sezioni di tessuto mediante test TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche).
Imaging a bioluminescenza
Per monitorare con precisione i cambiamenti nella crescita tumorale in vivo con i trattamenti, abbiamo eseguito l’analisi di bioluminescenza utilizzando il sistema di imaging Caliper IVIS Lumina II presso CMCA, UWA. Le analisi sono state condotte ogni 2 giorni dopo la generazione di tumori. I topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con 200 µL di D-Luciferina (Cayman Chemical) alla concentrazione finale di 150 mg/kg disciolti in PBS prima di essere anestetizzati al 4% di isoflurano., Una volta anestetizzati, i topi sono stati collocati all’interno della camera pre-riscaldata dell’imager di bioluminescenza e imaged 7-12 min dopo l’iniezione, sotto il 2% di isoflurano, fino a quando l’intensità del segnale di bioluminescenza aveva raggiunto uno stato stazionario.
Analisi statistica
Tutti i dati sono stati ricavati da più esperimenti condotti almeno in triplice copia. Le analisi statistiche sono state eseguite con GraphPad Prism v8 (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft) e software di analisi predittiva SPSS (IBM, versione 26)., Per i test di vitalità cellulare, i dati sono stati normalizzati alla luminescenza media della condizione del veicolo, che è stata considerata vitalità al 100%, con l’IC50S derivato in GraphPad Prism. Per l’immunoistochimica nei tumori T11 trattati per rilevare p-HER2 (Tyr1248) e p-EGFR (Tyr1068), il veicolo è stato normalizzato al 100%., Se del caso e come indicato nel testo principale, la significatività statistica è stata determinata utilizzando test t dello studente a due code non accoppiati, ANOVA unidirezionale non accoppiata con il test HSD post hoc di Tukey che corregge per confronti multipli, ANOVA a due vie con misure ripetute seguite dal test di confronto multiplo di Sidak o Tukey o un modello lineare generalizzato (GLM). Per tutti i test, le differenze sono state considerate significative a p <0.05 (*), p<0.01 ( * * ) e p< 0.001 (***).,
Reporting summary
Ulteriori informazioni sul design della ricerca sono disponibili nel Reporting Summary di Nature Research collegato a questo articolo.
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