Il microscopio elettronico a scansione in microbiologia e la diagnosi di malattie infettive

Per produrre un elettricamente conduttivo superficie per il SEM, campioni biologici sono spesso rivestiti con evaporazione a film sottile o sputtering di carbonio o metallo, in un vacuum, che richiede la previa disidratazione del campione. Questo processo di rivestimento può oscurare dettagli ultrastrutturali fini, a seconda dello spessore dello strato depositato (di solito 2-20 nm)., Queste procedure convenzionali sono difficili da eseguire su campioni microbiologici tipici, che di solito sono sospensioni di piccole particelle biologiche in acqua (<100 nm per la maggior parte dei virus, o nella gamma di dimensioni sub-micrometriche per molti batteri, funghi e parassiti). Un ulteriore problema è che i microbi di interesse nei campioni di pazienti o nei campioni ambientali possono essere presenti in concentrazioni relativamente basse, rendendo difficile osservarli su una superficie.,

In questo rapporto descriviamo i metodi per concentrare le sospensioni microbiche per l’osservazione SEM su substrati filtranti pre-rivestiti. Mostriamo che, invece del rivestimento di sputter, un liquido ionico (1-butil-3-metilimidazolio tetrafluoroborato) diluito in acqua può essere utilizzato per infiltrare rapidamente un campione microbiologico SEM, formando una superficie conduttiva elettrone-lucente, che impedisce la ricarica del campione e dà buoni risultati con campioni microbici (Fig. 1)., I liquidi ionici sono sali altamente conduttivi che rimangono allo stato liquido a temperatura ambiente e hanno una pressione di vapore trascurabile (≤5 × 10-9 Torr). Nelle condizioni di alto vuoto di un moderno SEM (≤1 × 10-6 Torr) i liquidi ionici rimangono allo stato liquido e non evaporano durante il funzionamento, pur essendo ancora conduttivi19,20,21,22,23. I liquidi ionici più utili per applicazioni in SEM biologico hanno una conduttività elettrica di circa 100 mScm-1, sono elettrochimicamente stabili (con una finestra elettrochimica di circa 5,8 V), oltre ad essere solubili in acqua e sono facilmente sintetizzati24., I liquidi ionici con queste proprietà sono stati precedentemente dimostrati per dare il contrasto di immagine di SEM paragonabile all’uso del rivestimento del carbonio e del metallo una volta usato con i campioni isolanti19,25. Sono stati anche utilizzati per l’imaging macroscopico di campioni biologici, come alghe,cellule coltivate di tessuti e cromosomi condensati20,21, 22. Substrati conduttivi come l’ossido di indio-stagno, il foglio di alluminio o i coprioggetti rivestiti in metallo sono stati utilizzati per prevenire la carica20, tuttavia questi materiali non sono adatti alla filtrazione per le indagini SEM sui microbi., Abbiamo scoperto che, per ottenere risultati ottimali utilizzando liquido ionico con oggetti subcellulari come virus o flagelli batterici, era necessario un precedente rivestimento di filtri in policarbonato con alluminio o oro. Non abbiamo rilevato alcuna deriva del campione quando si utilizzano campioni biologici macchiati di liquido ionico, poiché erano ben supportati dalla membrana di conduzione utilizzata durante il processo di filtrazione iniziale. I filtri in policarbonato SPI-pore sono idrofili e rimangono tali dopo il rivestimento metallico, rendendoli un substrato ideale per lavorare con campioni biologici idratati., La colorazione liquida ionica può anche essere eseguita all’interno di un armadio di sicurezza biologico, fornendo un’alternativa rapida e sicura al rivestimento di sputter quando si lavora con campioni infettivi, poiché l’apparecchiatura di rivestimento sotto vuoto può causare aerosol e non è facilmente contenuta20,21,22. Abbiamo risolto elegantemente il problema della concentrazione del campione e della prevenzione della carica, mediante rivestimento metallico del substrato filtrante stesso prima dell’applicazione del campione biologico (Fig. 2). In assenza di rivestimento a film sottile dei campioni, è stata necessaria anche l’infiltrazione con liquidi ionici per evitare la ricarica., I risultati sono comparabili con l’uso di SEM con rivestimento sputter e TEM con tecnica di colorazione negativa (Figg 1 e 2: Fichi supplementari S1–S5). L’ultrafiltrazione è un passo importante poiché aiuta a rimuovere i detriti che possono oscurare i dettagli di virus o batteri presenti nei campioni biologici. Nel presente rapporto, dimostriamo immagini chiare di virus e flagelli batterici in campioni SEM non rivestiti, che in precedenza richiedevano la disidratazione e il rivestimento di sputter, estendendo così la risoluzione e la gamma di campioni microbici che possono essere studiati con SEM.,

Confronto dei tradizionali sputter rivestimento SEM del campione metodi di preparazione (pannelli sul lato sinistro) con liquido ionico trattamento (centro di pannelli) e TEM convenzionale (pannelli sul lato destro) per l’osservazione di microbi: (a) Leptospira biflexa, (b) Salmonella Senftenberg, (c) vaccinia e (d) del virus Ebola. Le immagini SEM nei pannelli laterali di sinistra erano di esemplari che sono stati sputter rivestito con oro, su filtri non rivestiti pianura., Le immagini nei pannelli centrali erano di campioni trattati con liquido ionico dopo la deposizione su filtri di alluminio pre-rivestiti. Sul lato destro, immagini TEM di campioni simili preparati con metilammina tungstato colorazione negativa.

la Preparazione di campioni biologici per il SEM.

(a) I componenti dell’unità filtrante sono mostrati prima del montaggio., L’immagine SEM inserto mostra un filtro rivestito d’oro ad alto ingrandimento prima di un campione viene applicato. Si noti che il filtro è pulito e i pori sono chiaramente evidenti. (b) L’unità filtrante è mostrata dopo il montaggio e in uso con una pompa a siringa in un armadio di biosicurezza (c,d). La freccia blu in (d) punta all’unità filtro. (e) Immagini di filtri che hanno avuto metallo evaporato su di loro. Lo spessore dell’Al è 18 nm e 9 nm e l’Au è 27 nm e 9 nm di spessore. Per il filtro con entrambi i metalli lo spessore del Al e Au sono 18 nm e 27 nm, rispettivamente., (f) SEM e (g) la corrispondente mappa elementare generata dalla microanalisi a raggi X di una regione simile a quella evidenziata dal rettangolo punteggiato in (e). (h-k) Immagini SEM di Salmonella colorate con liquido ionico che illustrano l’effetto di diversi tipi di metallo e lo spessore del metallo evaporato sulle immagini finali registrate (h Al 9 nm, i Au 9 nm, j Al 18 nm, k Au 27 nm). Le frecce rosse indicano i flagelli.

Le immagini di batteri macchiati con liquido ionico avevano una topografia superficiale più liscia rispetto a quelle disidratate e ricoperte di sputter., Le misurazioni delle dimensioni mostrano che i campioni disidratati si sono ridotti di circa il 10-20 per cento (Tabella 1). Interpretiamo il dettaglio superficiale sui batteri disidratati e ricoperti di sputter come rughe della parete cellulare a causa del restringimento, piuttosto che l’osservazione di caratteristiche aggiuntive presenti in vivo: queste rughe sono quindi suscettibili di essere artefatti dovuti all’essiccazione. I flagelli batterici erano anche chiaramente visibili con il trattamento liquido ionico sui substrati conduttori (Fig. 1, Fig.supplementare. S3). Questi risultati sono stati paragonabili a quelli osservati con il rivestimento SEM-sputter e la colorazione TEM-negativa.,

Le tecniche ioniche liquide possono essere utilizzate in modo sicuro anche con agenti patogeni infettivi, in un contenitore SEM biologicamente contenuto, consentendo la caratterizzazione di nuovi agenti infettivi in una condizione più vicina al loro “stato nativo” idratato rispetto alle tecniche convenzionali di preparazione del campione8. Nel caso di questa indagine, il nostro protocollo convenzionale prevedeva la disidratazione in serie di etanolo, seguita da essiccazione all’aria e rivestimento metallico prima dell’imaging SEM., Per il protocollo liquido ionico, il campione biologico aveva una goccia di una soluzione acquosa al 2,5% di 1-butil-3-metilimidazolio tetrafluoroborato posta direttamente su di esso. Dopo aver tamponato per rimuovere il liquido in eccesso, il campione bagnato è stato quindi posizionato direttamente nel SEM. Quando si tratta di campioni infettivi, è necessaria una fase aggiuntiva di fissazione dell’aldeide per la procedura convenzionale per evitare il rischio di aerosol infettivi che potrebbero essere generati durante il processo di rivestimento dello sputter., Questa fase di fissazione non è richiesta con la tecnica del liquido ionico, poiché il campione può essere elaborato in una cappa di contenimento biologico e quindi essere posizionato direttamente in un SEM in un involucro SEM biologicamente contenuto8, per l’imaging in uno stato non fissato e idratato, che è molto più vicino allo stato nativo dell’organismo. La microscopia integra i test diagnostici convenzionali che possono mancare filtri nuovi o varianti3, 26, 27, 28 e può identificare rapidamente il tipo di organismo presente, guidando la selezione di test più specifici29., Tuttavia, la microscopia elettronica di solito richiede una concentrazione minima di particelle per l’identificazione affidabile dei microbi. Per i virus, questo è compreso tra 105 e 106 particelle virali / mL4,5. Con le tecniche di filtrazione, sia TEM che SEM di virus possono essere eseguiti con un minimo di 5000 particelle per campione7.

La colorazione liquida ionica sui filtri pre-rivestiti è ampiamente applicabile a qualsiasi campione biologico che può beneficiare della filtrazione per concentrare le particelle di interesse., L’uso di filtri rivestiti in metallo con più di un tipo di rivestimento su diverse aree consente la selezione di qualsiasi di questi rivestimenti dà i risultati ottimali per l’osservazione di un particolare campione o caratteristiche specifiche e aiuta a risparmiare tempo (Fig. 2 bis, e-k). Ad esempio, dopo la colorazione liquida ionica i flagelli batterici sono apparsi più luminosi contro il substrato rivestito di Al, mentre sull’area rivestita di Au del filtro il contrasto è invertito e i flagelli sono apparsi più scuri (Fig. 2h-k)., Allo stesso modo le immagini del virus Ebola e della Leptospira biflexa hanno mostrato dettagli topografici di buona qualità quando fotografati con un filtro rivestito in alluminio, ma il materiale biologico aveva meno dettagli e appariva come una sagoma piatta scura quando fotografata su filtri rivestiti in oro (fichi supplementari S4 e S5). Proponiamo che ciò sia dovuto al più alto segnale di emissione di elettroni secondari da Au rispetto ad Al. In questa indagine abbiamo raccolto immagini SEM con il rivelatore di elettroni secondari, che è più comunemente usato per l’imaging di routine con campioni biologici., In SEM, il coefficiente di emissione di elettroni secondari (δ) è relativamente costante indipendentemente dal numero atomico. Tuttavia un’eccezione è con Au, per il quale δ è quasi il doppio di Al e molti altri elementi. Il valore di δ è anche influenzato dall’energia del fascio: a 20 kV, δ è 0,1 per Al e 0,2 per Au30. Misurando l’intensità nelle immagini elettroniche secondarie prese a 4 kV con Al e Au nella stessa immagine (Fig. 2f), abbiamo calcolato il segnale dall’Au per essere 2,1 volte l’intensità dell’Al, che è vicino a quello previsto teoricamente., Con le immagini registrate dei campioni sui filtri dorati, interpretiamo i risultati come producendo troppo contrasto dal substrato di fondo, che tendeva a oscurare dettagli fini come flagelli che appaiono come “sagome” su uno sfondo luminoso. Tuttavia, i microbi infiltrati liquidi ionici e il filtro rivestito in alluminio hanno coefficienti di emissione simili, quindi il contrasto è in gran parte dovuto alla topografia piuttosto che alle differenze nella composizione del materiale, consentendo di vedere dettagli più fini.,

Il pre-rivestimento dei filtri con metallo non ha influenzato le dimensioni dei pori o la capacità di filtrazione dei filtri (Fig. 2). L’intero protocollo di colorazione liquido ionico può essere eseguito su un banco di laboratorio standard in circa 15 minuti e si inserisce all’interno di un armadio di biosicurezza (Fig. 2 quater, d). Nel rivestimento sputter per SEM, uno strato troppo sottile causa una scarsa conduzione e carica, mentre uno strato troppo spesso oscura i dettagli fini., Lo spessore utilizzato per il pre-rivestimento dei substrati può essere molto maggiore dei rivestimenti di sputter tipicamente utilizzati per i campioni biologici, per garantire una buona conduttività, purché i pori del filtro non siano bloccati. (Fico. 2e-k, Fig. supplementare S2).

In questa indagine abbiamo utilizzato rivestimenti di 18 e 27 nm rispettivamente per Al e Au, poiché questi spessori sono risultati sufficienti per impedire la ricarica, rispetto ai filtri non rivestiti (Fig. S2). I substrati con questi spessori minimi sono stati facilmente selezionati poiché erano visibili come un rivestimento metallico lucido., Quando erano presenti rivestimenti inferiori a 27 nm per Au o 18 nm per Al, avevano un aspetto opaco o bianco piatto (Fig. 2). Con la colorazione liquida ionica usando questi filtri rivestiti di metallo, siamo stati in grado di visualizzare i dettagli strutturali fini dei batteri, come i flagelli della salmonella, che hanno un diametro di 20 nm, tramite SEM (Fig. 2j, k, Fig. supplementare S3).,

I risultati ottenuti con filtrazione e semplice infiltrazione di liquido ionico per SEM sono molto comparabili in qualità con quelli del rivestimento sputter convenzionale in SEM e della colorazione negativa in TEM per una varietà di campioni batterici e virali, tra cui Leptospira, Salmonella, virus vaccinia e virus Ebola (Fig. 1, Fig.supplementare. S3-S5) 7,16,31,32. Abbiamo scoperto che c’era molto meno restringimento dei batteri e dei virus infiltrati nel liquido ionico rispetto sia ai preparati SEM rivestiti con sputter disidratati che alle immagini colorate negative TEM (Tabella 1)., In tutti i casi le dimensioni dei microbi TEM disidratati rivestiti con sputter e macchiati con negativo erano dal 9,9% al 18,9% più piccole dei campioni trattati con liquido ionico (Tabella 1). In un’indagine precedente abbiamo immaginato il virus Ebola congelato-vetrificato mediante microscopia crio-elettronica il diametro del virus Ebola è stato misurato come 96-98 nm16 che è molto simile al valore di 98,5 ± 10,2 nm per il diametro misurato degli stessi campioni trattati con liquido ionico nel presente studio., Ciò dimostra ulteriormente che i volumi dei campioni infiltrati di liquido ionico sono paragonabili a quelli misurati in condizioni idratate congelate e riflettono da vicino lo stato nativo completamente idratato del virus Ebola. Per una struttura bacilliforme, una riduzione del 10% delle dimensioni equivale a una riduzione del 27% del volume dovuta alla disidratazione, sebbene il collasso e l’appiattimento della forma cilindrica implichino un grado ancora maggiore di perdita d’acqua., È chiaro che questo appiattimento e collasso dovuto alla disidratazione è presente in una certa misura in tutte le immagini di virus e batteri rivestiti di sputter (Fig. 1).

Anche se le immagini appaiono relativamente simili, rivestimento sputter oro sembra dare un po ‘ più di contrasto di liquido ionico. Un’altra differenza osservabile è meno della rugosità superficiale delle pareti cellulari batteriche nelle immagini ioniche macchiate di liquido. Questo può essere visto nelle immagini di Salmonella (Fig. 1, Fig.supplementare. S3)., In queste immagini c’è un chiaro aspetto strutturato e rugoso sulla superficie delle cellule batteriche rivestite di sputter e un aspetto liscio sulle pareti cellulari dei preparati infiltrati liquidi ionici. Proponiamo che questa differenza osservata sia in gran parte il risultato della perdita di turgore cellulare a causa della disidratazione e della perdita di volume nei campioni rivestiti di sputter e quindi le rughe possono effettivamente essere un artefatto o una caratteristica accentuata dalla disidratazione., La prova a sostegno di ciò deriva dal fatto che altre strutture fini, come i flagelli, sono chiaramente visibili (e di aspetto simile) sia negli esemplari trattati con liquido ionico che con rivestimento a sputter. Pertanto, i risultati di studi precedenti che utilizzavano il rivestimento di sputter di batteri potrebbero dover essere accuratamente reinterpretati alla luce di possibili effetti di disidratazione.

La procedura del liquido ionico presentata in questa indagine è rapida e riproducibile poiché i filtri del campione possono essere preparati in anticipo., Poiché il liquido ionico ha una pressione di vapore molto bassa, un ulteriore vantaggio è che si evitano artefatti di essiccazione come restringimento, rughe o screpolature che possono verificarsi durante l’osservazione SEM (Tabella 1, Fig. S3). In futuro, prevediamo lo sviluppo di una varietà di diversi tipi di rivestimenti filtranti per migliorare ulteriormente le tecniche SEM utilizzando la colorazione liquida ionica per campioni biologici nella gamma di dimensioni nanometriche.