, Hogy készítsen egy elektromosan vezető felület SEM, biológiai minták gyakran bevont segítségével vékony film párolgás vagy porlasztás szén-vagy fém vákuumban coater, amely megköveteli, előzetes kiszáradás a minta. Ez a bevonási folyamat elfedheti a finom ultrastrukturális részleteket, a lerakódott réteg vastagságától függően (általában 2-20 nm)., Ezek a hagyományos eljárások nehéz elvégezni a tipikus mikrobiológiai minták, amelyek általában felfüggesztések kis biológiai részecskék víz (<100 nm legtöbb vírus, vagy az al-mikrométer méret tartomány sok baktériumok, gombák, paraziták). További probléma, hogy a betegminták vagy környezeti minták iránt érdeklődő mikrobák viszonylag alacsony koncentrációban lehetnek jelen, ami megnehezíti a megfigyelést egy felületen.,
ebben a jelentésben leírjuk a mikrobiális szuszpenziók koncentrálásának módszereit SEM megfigyelésre az előbevonatú szűrőanyagokra. Megmutatjuk, hogy a porlasztásos bevonat helyett egy vízben hígított Ionos folyadék (1-butil-3-metilimidazolium tetrafluoroborát)használható mikrobiológiai SEM minta gyors beszivárgására, elektron-luciens vezető felületet képezve, amely megakadályozza a minta töltését, és jó eredményeket ad a mikrobiális mintákkal (ábra. 1)., Az ionos folyadékok nagyon vezető sók, amelyek szobahőmérsékleten folyékony állapotban maradnak, és elhanyagolható gőznyomással rendelkeznek (≤5 × 10-9 Torr). A modern SEM (≤1 × 10-6 Torr) nagy vákuumos körülményei között az ionos folyadékok folyékony állapotban maradnak, és működés közben nem párolognak el, miközben még mindig vezetők19,20,21,22,23. A biológiai SEM alkalmazásokhoz a leghasznosabb Ionos folyadékok elektromos vezetőképessége körülbelül 100 mScm-1, elektrokémiai szempontból stabilak (elektrokémiai ablakuk körülbelül 5,8 V), valamint vízben oldhatók és könnyen szintetizálhatók24., Az ilyen tulajdonságokkal rendelkező Ionos folyadékokról korábban bebizonyosodott,hogy a fém-és szénbevonattal összehasonlítható SEM képkontrasztot adnak szigetelő példányok használata esetén19, 25. Biológiai példányok makroszkopikus képalkotására is használták őket, mint például a hínár, a szöveti tenyésztett sejtek és a kondenzált kromoszómák20, 21, 22. Vezetőképes hordozókat, például indium-ón-oxidot, alumíniumfóliát vagy fémbevonatú burkolatokat használtak a feltöltés megakadályozására20, azonban ezek az anyagok nem alkalmasak szűrésre a mikrobák SEM vizsgálatához., Felfedeztük, hogy az optimális eredmény érdekében Ionos folyadék felhasználásával szubcelluláris tárgyakkal, például vírusokkal vagy bakteriális flagellákkal, a polikarbonát szűrők alumíniummal vagy arannyal történő előzetes bevonására volt szükség. Ionos folyékony festett biológiai minták használatakor nem észleltünk semmilyen mintadarab sodródását, mivel azokat a kezdeti szűrési folyamat során használt vezető membrán jól támogatta. A SPI-pórusú polikarbonát szűrők hidrofilek, így fémbevonat után is megmaradnak, így ideális szubsztrát a hidratált biológiai mintákkal való munkavégzéshez., Az ionos folyadékfestés biológiai biztonsági szekrényen belül is elvégezhető, gyors és biztonságos alternatívát nyújtva a porlasztásos bevonatnak a fertőző mintákkal végzett munka során, mivel a vákuumos bevonó berendezés aeroszolokat okozhat és nem könnyen tárolható20,21,22. Elegánsan megoldottuk a minta koncentrálásának és a töltés megakadályozásának problémáját, a biológiai minta alkalmazása előtt maga a szűrőanyag fémbevonatával (1.ábra). 2). A minták vékony filmbevonatának hiányában Ionos folyadékokkal történő beszivárgásra is szükség volt a töltés elkerülése érdekében., Az eredmények összehasonlíthatók a SEM porlasztásos bevonattal és a TEM negatív festési technikával történő alkalmazásával (füge 1 és 2: Kiegészítő füge S1-S5). Az ultraszűrés fontos lépés, mivel segít eltávolítani azokat a törmelékeket, amelyek elhomályosíthatják a biológiai mintákban jelen lévő vírusok vagy baktériumok részleteit. A jelenlegi jelentésben a nem bevont SEM-mintákban a vírusok és a bakteriális flagellák egyértelmű képalkotását mutatjuk be, amelyek eléréséhez korábban dehidratációra és porlasztásos bevonatra volt szükség, ezáltal kiterjesztve a SEM-vel vizsgálható mikrobiális minták felbontását és tartományát.,
Összehasonlítás a hagyományos sputter bevonat SEM minta-előkészítési módszerek (panel a bal oldalon) a ionos folyadék kezelés (központ panel), valamint a hagyományos TEM (panel a jobb oldalon) a megfigyelés, a mikrobák: (a) Leptospira biflexa, (b) Salmonella Senftenberg, (c) antivakcinia, valamint (d) Ebola vírus. A bal oldali panelek SEM képei olyan példányokból álltak, amelyeket arany bevonattal láttak el, sima, bevonat nélküli szűrőkön., A középső paneleken lévő képek Ionos folyadékkal kezelt mintákból készültek, miután az előbevonatú alumínium szűrőkön lerakódott. A jobb oldalon a metilamin tungstate negatív festéssel készített hasonló példányok TEM képei.
biológiai minták sem.
(a) a szűrőegység komponensei az összeszerelés előtt jelennek meg., Az inset SEM kép egy arany bevonatú szűrőt mutat nagy nagyítás mellett, mielőtt egy mintát alkalmaznának. Vegye figyelembe, hogy a szűrő tiszta, a pórusok pedig egyértelműen nyilvánvalóak. b) a szűrőegység a szerelés után és a fecskendőszivattyúval való használat során egy biológiai biztonsági szekrényben (C, d)jelenik meg. A (D) pontban található kék nyíl a szűrőegységre mutat. e) olyan szűrők képei,amelyeken fém elpárolgott. Az Al vastagsága 18 nm és 9 nm, Az Au pedig 27 nm és 9 nm vastag. Mindkét fémes szűrő esetében az Al és az Au vastagsága 18 nm, illetve 27 nm., f) SEM és g) a megfelelő elemi térkép, amelyet egy olyan régió röntgen-mikroanalízise hoz létre, amely hasonló az e) pontozott téglalap által kiemelthez. (h–k) SEM Ionos folyadékkal festett szalmonella-képek, amelyek szemléltetik a különböző fémtípusok hatását és a fém vastagságát a rögzített végső képeken (h Al 9 nm, I Au 9 nm, j Al 18 nm, K Au 27 nm). Piros nyilak jelzik flagellae.
az ionos folyadékkal festett baktériumok képei simább felületi topográfiával rendelkeztek, mint a dehidratált és porlasztóval bevont., A méretmérések azt mutatják, hogy a kiszáradt példányok körülbelül 10-20% – kal zsugorodtak (1.táblázat). A dehidratált, porlasztóval bevont baktériumok felületi részleteit úgy értelmezzük, mint a sejtfal ráncosodását a zsugorodás miatt, ahelyett, hogy megfigyelnénk az in vivo jelen lévő további jellemzőket: ezek a ráncok valószínűleg a szárítás miatt műtárgyak. Bakteriális flagellae is jól látható Ionos folyadék kezelés a vezető szubsztrátok (ábra. 1, Kiegészítő Ábra. S3). Ezek az eredmények hasonlóak voltak a SEM-sputter bevonattal és a TEM-negatív festéssel megfigyelt eredményekhez.,
Ionos folyadék technikák is biztonságosan használható fertőző kórokozók, egy biológiailag zárt SEM burkolat, amely lehetővé teszi a jellemzése új fertőző ágensek olyan állapotban közelebb a hidratált “natív állapot”, mint a hagyományos minta készítmény technikák8. A vizsgálat során hagyományos protokollunk az etanol-sorozat dehidratálásáról szólt, amelyet légszárítás és fémbevonat követett a SEM képalkotás előtt., Az ionos folyadék protokoll esetében a biológiai mintában egy csepp 2,5%-os vizes 1-butil-3-metil-imidazolium-tetrafluor-borát került közvetlenül rá. A felesleges folyadék eltávolítása után a nedves mintát közvetlenül a SEM-be helyeztük. A fertőző minták kezelése során a hagyományos eljáráshoz további aldehid-rögzítési lépésre van szükség a fertőző aeroszolok kockázatának elkerülése érdekében, amelyek a porlasztásos bevonási folyamat során keletkezhetnek., Ez a rögzítési lépés nem szükséges az ionos folyadék technikával, mivel a mintát biológiai elszigetelő burkolatban lehet feldolgozni, majd közvetlenül egy SEM-be kell helyezni egy biológiailag tartalmazott SEM enklosure8-ban, nem rögzített, hidratált állapotban történő képalkotáshoz, amely sokkal közelebb áll a szervezet natív állapotához. A mikroszkópia kiegészíti a hagyományos diagnosztikai teszteket, amelyek kihagyhatják az új vagy variáns strains3,26,27,28-at, és gyorsan azonosíthatják a jelen lévő szervezet típusát, irányítva a specifikusabb tesztek29 kiválasztását., Az elektronmikroszkópia azonban általában minimális részecskekoncentrációt igényel a mikrobák megbízható azonosításához. A vírusok esetében ez 105-106 vírusrészecske/mL4,5 között van. Szűrési technikákkal mind a TEM, mind a SEM vírusok mintavételenként akár 5000 részecskével is elvégezhetők7.
Az ionos folyadékfestés az előbevonatú szűrőkön széles körben alkalmazható minden olyan biológiai mintára, amely előnyös lehet A szűrésből az érdekes részecskék koncentrálására., A különböző területeken egynél több típusú bevonattal ellátott fémbevonatú szűrők használata lehetővé teszi, hogy kiválasszuk, melyik bevonat adja az optimális eredményt egy adott minta vagy sajátosságok megfigyelésére, és időt takaríthat meg (1.ábra). 2a, e-k). Például az ionos folyadékfestés után a bakteriális flagellák fényesebbnek tűntek az Al-bevonatú hordozóval szemben, míg a szűrő Au-bevonatú területén a kontraszt megfordult ,a flagellák sötétebbnek tűntek (ábra. 2h-k)., Hasonlóképpen a képek Ebola vírus Leptospira biflexa mutatott jó minőségű topográfiai részlet, amikor rajzolódik egy alumínium bevonatú szűrő, de a biológiai anyag volt kevesebb részlet jelent meg, mint egy sötét, lapos sziluett, amikor rajzolódik arany bevonatú szűrő (Kiegészítő Füge S4, S5). Javasoljuk, hogy ez az Au magasabb másodlagos elektronkibocsátási jelének köszönhető, mint az Al. Ebben a vizsgálatban SEM képeket gyűjtöttünk a másodlagos elektronérzékelővel, amelyet leggyakrabban biológiai mintákkal történő rutin képalkotáshoz használnak., SEM-ben a másodlagos elektronkibocsátási együttható (δ) viszonylag állandó, az atomszámtól függetlenül. Kivétel azonban az Au, amelynél a δ majdnem kétszerese az Al-énak és sok más elemnek. A δ értékét a fényenergia is befolyásolja: 20 kV-nál δ az Al esetében 0,1, az Au30 esetében pedig 0,2. Az intenzitás mérésével a 4 kV-os másodlagos elektronképekben, mind az Al, mind az Au-Val ugyanabban a képen (ábra. 2f), kiszámítottuk az Au jelét, hogy az al intenzitása 2,1-szerese legyen, ami közel áll az elméletileg elvárthoz., A rögzített képek a példányok az arany bevonatú szűrő, értelmezzük az eredményeket, mint termelő túl nagy a kontraszt a háttérben szubsztrátum, amely inkább a homályos részleteket, mint például flagellae, amely úgy jelenik meg, mint egy “sziluettek” a világos háttér. Azonban az ionos folyadék beszivárgott mikrobák és az alumínium bevonatú szűrő hasonló kibocsátási együtthatókkal rendelkeznek, így a kontraszt nagyrészt a topográfiának köszönhető, nem pedig az anyagösszetétel különbségeinek, így további finom részletek láthatók.,
a szűrők fémmel történő előbevonása nem befolyásolta a pórusméreteket vagy a szűrők szűrési kapacitását (ábra). 2). A teljes Ionos folyadékfestési protokollt egy szabványos laboratóriumi padon körülbelül 15 perc alatt el lehet végezni, majd egy biosafety szekrénybe illeszkedik (ábra. 2c, d). A SEM sputter bevonatban a túl vékony réteg rossz vezetőképességet és töltést okoz, míg a túl vastag réteg elhomályosítja a finom részleteket., A szubsztrátok előbevonásához használt vastagság sokkal nagyobb lehet, mint a biológiai mintákhoz általában használt porlasztó bevonatok, a jó vezetőképesség biztosítása érdekében, mindaddig, amíg a szűrő pórusai nem blokkolódnak. (Ábra. 2e-k, kiegészítő ábra. S2).
ebben a vizsgálatban Al és Au esetében 18, illetve 27 nm-es bevonatokat használtunk, mivel ezek a vastagságok elegendőnek bizonyultak a töltés megakadályozásához, összehasonlítva a nem bevont szűrőkkel (kiegészítő ábra. S2). Az ilyen minimális vastagságú szubsztrátok könnyen kiválaszthatók, mivel fényes fémbevonatként voltak láthatóak., Amikor az Au esetében 27 nm-nél kisebb vagy az Al esetében 18 nm-nél kisebb bevonatok voltak jelen, átlátszatlan vagy lapos fehér megjelenésük volt (ábra. 2). Ionos folyadékfestéssel ezekkel a fémbevonatú szűrőkkel képesek voltunk elképzelni a baktériumok finom szerkezeti részleteit, például a szalmonella flagelláit, amelyek átmérője 20 nm, SEM (ábra. 2j, k, kiegészítő ábra. S3).,
A kapott eredmények a szűrés és egyszerű ionos folyadék beszivárgását SEM nagyon hasonló minőségű azokkal a hagyományos sputter bevonat SEM pedig negatív festés a TEM a különböző bakteriális, vírusos példányok, beleértve a Leptospira, Szalmonella, antivakcinia vírus Ebola vírus (Fig. 1, Kiegészítő Ábra. S3-S5) 7,16,31,32. Megállapítottuk, hogy mind a dehidratált porlasztóval bevont SEM készítményekhez, mind a TEM negatív festett képekhez képest sokkal kevésbé zsugorodott az ionos folyadék beszivárgott baktériumok és vírusok (1.táblázat)., A dehidratált SEM porlasztóval bevont és negatív festésű TEM mikrobák méretei minden esetben 9,9% – ról 18,9% – kal kisebbek voltak, mint az ionos folyadékkal kezelt minták (1.táblázat). Egy korábbi vizsgálat, mi rajzolódik fagyott-üvegszerű Ebola vírus által krio-elektronmikroszkópos az átmérője az Ebola vírus volt mérve, mint 96-98 nm16, amely nagyon hasonló az értéke 98.5 ± 10.2 nm az átmérő mérése azonos példányok kezelt ionos folyadék a jelen tanulmány., Ez azt is bizonyítja, hogy az ionos folyadék beszivárgott minták mennyisége összehasonlítható a fagyott hidratált körülmények között mért mennyiségekkel, és szorosan tükrözi az Ebola-vírus teljesen hidratált natív állapotát. Egy bacilliform szerkezet esetében a méretek 10% – os csökkenése egyenértékű a kiszáradás miatti 27% – os térfogatcsökkenéssel, bár a hengeres alak összeomlása és simítása még nagyobb mértékű vízveszteséget jelentene., Ebből az következik, hogy ez a kiszáradás okozta laposodás és összeomlás bizonyos mértékig jelen van a porlasztóval bevont vírusok és baktériumok összes képében (ábra). 1).
bár a képek viszonylag hasonlónak tűnnek, az arany porlasztó bevonat kissé nagyobb kontrasztot ad, mint az ionos folyadék. Egy másik megfigyelhető különbség az ionos folyadékfestett képek bakteriális sejtfalainak felületi érdessége. Ez látható a szalmonella képein (ábra. 1, Kiegészítő Ábra. S3)., Ezeken a képeken a porlasztóval bevont baktériumsejtek felületén tiszta texturált és ráncos megjelenés, valamint az ionos folyadék beszivárgott készítmények sejtfalain sima megjelenés figyelhető meg. Azt javasoljuk, hogy ez a megfigyelt különbség nagyrészt a sejt turgor elvesztésének következménye a kiszáradás és a porlasztóval bevont példányok térfogatvesztése miatt, így a ráncok valójában olyan tárgy vagy tulajdonság lehetnek, amelyet a kiszáradás hangsúlyoz., Ennek alátámasztó bizonyítéka az a tény, hogy más finom szerkezetek, mint például a flagellae, jól láthatóak (és hasonló megjelenésűek) mind a porlasztóval bevont, mind az ionos folyadékkal kezelt mintákban. Így a baktériumok porlasztásos bevonatával végzett korábbi vizsgálatok eredményeit óvatosan újra kell értelmezni a lehetséges dehidrációs hatások fényében.
Az ebben a vizsgálatban bemutatott Ionos folyadék eljárás gyors és reprodukálható, mivel a mintaszűrők előre elkészíthetők., Mivel az ionos folyadék nagyon alacsony gőznyomással rendelkezik, további előnye, hogy elkerülhetők a szárítási tárgyak, például zsugorodás, ráncosodás vagy repedés, amely a SEM megfigyelés során előfordulhat (1.táblázat, kiegészítő ábra. S3). A jövőben különféle szűrőbevonatok kifejlesztésére számítunk, hogy tovább javítsuk a SEM technikákat Ionos folyadékfestéssel a biológiai mintákhoz a nanometre mérettartományban.
Leave a Reply