skanningselektronmikroskopet i mikrobiologi och diagnos av infektionssjukdom

för att producera en elektriskt ledande yta för SEM, är biologiska prover ofta belagda med tunnfilmsindunstning eller sputtring av kol eller metall i en vakuumkoater, vilket kräver tidigare dehydrering av provet. Denna beläggningsprocess kan dölja fina ultrastrukturella detaljer, beroende på skiktets tjocklek (vanligtvis 2-20 nm)., Dessa konventionella förfaranden är svåra att genomföra på typiska mikrobiologiska prover, som vanligtvis är suspensioner av små biologiska partiklar i vatten (<100 nm för de flesta virus, eller i undermikrometerstorleksområdet för många bakterier, svampar och parasiter). Ett ytterligare problem är att mikroberna av intresse för patientprover eller miljöprover kan vara närvarande i relativt låga koncentrationer, vilket gör observation av dem på en yta svår.,

i denna rapport beskriver vi metoder för att koncentrera mikrobiella suspensioner för sem-observation på förbelagda filtersubstrat. Vi visar att istället för sputterbeläggning kan en jonvätska (1-butyl-3-metylimidazoliumtetrafluoroborat) utspädd i vatten användas för att snabbt infiltrera ett mikrobiologiskt SEM-prov, som bildar en elektronlucentledande yta, vilket förhindrar provladdning och ger bra resultat med mikrobiella prover (Fig. 1)., Joniska vätskor är mycket Ledande salter som förblir i flytande tillstånd vid rumstemperatur och har ett försumbart ångtryck (≤5 × 10-9 Torr). Under de höga vakuumförhållandena hos en modern SEM (≤1 × 10-6 Torr) förblir Joniska vätskor i flytande tillstånd och förångas inte under drift, medan de fortfarande är ledande19,20,21,22,23. De mest användbara Joniska vätskorna för applikationer i biologisk SEM har en elektrisk ledningsförmåga på cirka 100 mScm-1, är elektrokemiskt stabila (med ett elektrokemiskt fönster på cirka 5,8 V), samt att de är vattenlösliga och lätt syntetiserade24., Joniska vätskor med dessa egenskaper har tidigare visat sig ge SEM bildkontrast jämförbar med användningen av metall och kol beläggning när den används med isolerande specimens19, 25. De har också använts för makroskopisk avbildning av biologiska prover, såsom tång, vävnads odlade celler och kondenserade kromosomer20, 21, 22. Ledande substrat som indium – tennoxid, aluminiumfolie eller metallbelagda täckglas har använts för att förhindra laddning20, men dessa material är olämpliga för filtrering för sem-undersökningar av mikrober., Vi upptäckte att, för optimala resultat med jonvätska med subcellulära föremål som virus eller bakteriella flagellae, tidigare beläggning av polykarbonatfilter med aluminium eller guld var nödvändigt. Vi upptäckte inte någon provdrift vid användning av joniska flytande färgade biologiska prover, eftersom de var väl stödda av det ledande membranet som användes under den ursprungliga filtreringsprocessen. SPI-pore polykarbonatfiltren är hydrofila och förblir så efter metallbeläggning, vilket gör dem till ett idealiskt substrat för att arbeta med hydratiserade biologiska prover., Jonisk vätskefärgning kan också utföras inom ett biologiskt säkerhetsskåp, vilket ger ett snabbt och säkert alternativ till sputterbeläggning när man arbetar med smittsamma prover, eftersom vakuumbeläggningsutrustning kan orsaka aerosoler och inte lätt innehåller20,21,22. Vi har elegant löst problemet med att koncentrera provet och förhindra laddning, genom metallbeläggning av filtersubstratet själv innan det biologiska provet appliceras (Fig. 2). I avsaknad av tunnfilmsbeläggning av proverna krävdes också infiltrering med joniska vätskor för att undvika laddning., Resultaten är jämförbara med användning av sem med sputterbeläggning och TEM med negativ färgningsteknik (Fig 1 och 2: kompletterande fikon S1–S5). Ultrafiltrering är ett viktigt steg eftersom det hjälper till att ta bort skräp som kan dölja detaljerna om virus eller bakterier som finns i biologiska prover. I den aktuella rapporten visar vi tydlig avbildning av virus och bakteriella flagellae i obelagda SEM-prover, som tidigare krävde uttorkning och sputterbeläggning för att uppnå, vilket utvidgade upplösningen och sortimentet av mikrobiella prover som kan undersökas med SEM.,

jämförelse av konventionella sputterbeläggning sem provberedningsmetoder (paneler på vänster sida) med jonisk vätskebehandling (mittpaneler) och konventionell TEM (paneler på höger sida) för observation av mikrober: (a) leptospira biflexa, b) salmonella Senftenberg, C) vaccinia och d) Ebola-virus. Sem-bilderna i de vänstra sidopanelerna var av exemplar som var sputter belagda med guld, på vanliga obelagda filter., Bilder i mittpanelerna var av prover behandlade med jonvätska efter avsättning på förbelagda aluminiumfilter. På höger sida, TEM bilder av liknande exemplar beredda med metylamin volframat negativ färgning.

beredning av biologiska prover för SEM.

(a) komponenterna i filterenheten visas före montering., Den infällda sem-bilden visar ett guldbelagt filter vid hög förstoring innan ett prov appliceras. Observera att filtret är rent och porerna är tydligt uppenbara. (B) filterenheten visas efter montering och användning med en sprutpump i ett biosafety-skåp (c,d). Den blå pilen i (d) pekar på filterenheten. (E) bilder av filter som har avdunstat metall på dem. Tjockleken på Al är 18 nm och 9 nm och Au är 27 nm och 9 nm tjock. För filtret med båda metallerna är tjockleken på Al och Au 18 nm respektive 27 nm., f) SEM och g) motsvarande elementär karta som genereras genom Röntgenmikroanalys av en region som liknar den som markeras med den streckade rektangeln i e. (h–k) sem-bilder av Salmonella färgade med jonvätska som illustrerar effekten av olika metalltyper och metalltjocklek indunstades på de slutliga bilder som registrerats (h Al 9 nm, i Au 9 nm, j Al 18 nm, K au 27 nm). Röda pilar indikerar flagellae.

bilderna av bakterier färgade med jonvätska hade en jämnare yttopografi än de som var uttorkade och sputter belagda., Storleksmätningar visar att de uttorkade exemplaren krympte med cirka 10-20% (Tabell 1). Vi tolkar ytdetaljerna på dehydrerade, sputterbelagda bakterierna som rynkning av cellväggen på grund av krympning, snarare än observation av ytterligare funktioner som är närvarande in vivo: dessa rynkor är således sannolikt att vara artefakter på grund av torkning. Bakteriella flagellae var också tydligt synliga med jonisk vätskebehandling på de ledande substraten (Fig. 1, Kompletterande Fig. S3). Dessa resultat var jämförbara med dem vi observerade med sem-sputterbeläggning och TEM-negativ färgning.,

Joniska flytande tekniker kan också användas säkert med infektiösa patogener, i ett biologiskt inneslutet SEM-hölje, vilket möjliggör karakterisering av nya smittämnen i ett tillstånd som ligger närmare deras hydratiserade ”native state” än med konventionella provberedningstekniker8. Vid denna undersökning involverade vårt konventionella protokoll uttorkning i etanolserie, följt av lufttorkning och metallbeläggning före SEM-bildbehandling., För jonvätskeprotokollet hade det biologiska provet en droppe av en 2,5% vattenlösning av 1-butyl-3-metylimidazoliumtetrafluoroborat placerad direkt på den. Efter blotting för att avlägsna överskott av vätska placerades det våta provet direkt i SEM. Vid hantering av infektionsprover behövs ett ytterligare aldehydfixeringssteg för det konventionella förfarandet för att undvika risken för smittsamma aerosoler som kan genereras under sputterbeläggningsprocessen., Detta fixeringssteg krävs inte med jonvätsketekniken, eftersom provet kan bearbetas i en biologisk inneslutningskåpa och sedan placeras direkt i en SEM i ett biologiskt inneslutet SEM-omslag8, för Avbildning i ett oblandat, hydratiserat tillstånd, vilket ligger mycket närmare organismens ursprungliga tillstånd. Mikroskopi kompletterar konventionella diagnostiska tester som kan missa nya eller variant strains3, 26, 27, 28 och kan snabbt identifiera vilken typ av organism som är närvarande och styra valet av mer specifika test29., Elektronmikroskopi kräver emellertid vanligtvis en minsta koncentration av partiklar för tillförlitlig identifiering av mikrober. För virus är detta mellan 105 till 106 viruspartiklar / mL4, 5. Med filtreringstekniker kan både tem och sem av virus utföras med så lite som 5000 partiklar per prov7.

jonisk flytande färgning på förbelagda filter är allmänt tillämplig på alla biologiska prov som kan dra nytta av filtrering för att koncentrera partiklar av intresse., Användningen av metallbelagda filter Med mer än en typ av beläggning på olika områden gör det möjligt att välja vilken av dessa beläggningar som ger optimala resultat för att observera ett visst prov eller specifika egenskaper och hjälper till att spara tid (Fig. 2a,e–k). Till exempel, efter jonisk flytande färgning bakteriella flagellae verkade ljusare mot det Al-belagda substratet, medan på Au-belagda området av filtret kontrasten vänds och flagellae verkade mörkare (Fig. 2h–k)., På samma sätt visade bilderna av ebolavirus och Leptospira biflexa god kvalitet topografiska detaljer när de avbildades med ett aluminiumbelagt filter, men det biologiska materialet hade mindre detaljer och verkade som en mörk platt silhuett när de avbildades på guldbelagda filter (kompletterande fikon S4 och S5). Vi föreslår att detta beror på den högre sekundära elektronutsläppssignalen från Au jämfört med Al. I denna undersökning samlade vi SEM-bilder med den sekundära elektrondetektorn, som oftast används för rutinmässig avbildning med biologiska exemplar., I SEM är den sekundära elektronemissionskoefficienten (δ) relativt konstant oberoende av atomnummer. Ett undantag är dock med Au, för vilken δ är nästan dubbelt så mycket som för Al och många andra element. Värdet av δ påverkas också av strålenergi: vid 20 kV är δ 0,1 för Al och 0,2 för Au30. Genom att mäta intensiteten i sekundära elektronbilder tagna vid 4 kV med både Al och Au i samma bild (Fig. 2F), vi beräknade signalen från Au att vara 2,1 gånger intensiteten av Al,som ligger nära den förväntade teoretiskt., Med bilderna inspelade av exemplar på de guldbelagda filtren tolkar vi resultaten som att producera för mycket kontrast från bakgrundssubstratet, vilket tenderade att dölja fina detaljer som flagellae som visas som en ”silhuetter” på en ljus bakgrund. Den joniska vätskan infiltrerade mikrober och det aluminiumbelagda filtret har emellertid liknande emissionskoefficienter, så kontrasten beror till stor del på topografin snarare än skillnaderna i materialkompositionen, vilket gör att mer fina detaljer kan ses.,

förbeläggning av filtren med metall påverkade inte porstorlekarna eller filtreringskapaciteten hos filtren (Fig. 2). Hela Joniska flytande färgningsprotokollet kan utföras på en standard laboratoriebänk på cirka 15 minuter och passar inuti ett biosafety-skåp (Fig. 2c,d). I sputterbeläggning för SEM orsakar för tunt skikt dålig ledning och laddning, medan för tjockt lager döljer fina detaljer., Tjockleken som används för pre-beläggning substraten kan vara mycket större än sputter beläggningar som vanligtvis används för biologiska exemplar, för att säkerställa god ledningsförmåga, så länge filterporerna inte blockeras. (Fig. 2e–k, Kompletterande Fig. S2).

i denna undersökning använde vi beläggningar på 18 respektive 27 nm för Al respektive Au, eftersom dessa tjocklekar befanns vara tillräckliga för att förhindra laddning, jämfört med obelagda filter (kompletterande Fig. S2). Substrat med dessa minsta tjocklekar valdes lätt eftersom de var synliga som en glänsande metallisk beläggning., När beläggningar på mindre än 27 nm för Au eller 18 nm för Al var närvarande, hade de ett ogenomskinligt eller plattvitt utseende (Fig. 2). Med jonisk flytande färgning med hjälp av dessa metallbelagda filter kunde vi visualisera de fina strukturella detaljerna hos bakterier, såsom salmonellas flagellae, som är 20 nm i diameter, av SEM (Fig. 2J, k, kompletterande Fig. S3).,

de resultat som erhållits med filtrering och enkel jonisk flytande infiltration för SEM är mycket jämförbara i kvalitet med de från konventionell sputterbeläggning i SEM och negativ färgning i TEM för en mängd olika bakterie-och virusprover, inklusive Leptospira, Salmonella, vaccinia-virus och Ebola-virus (Fig. 1, Kompletterande Fig. S3 S5)7,16,31,32. Vi fann att det var mycket mindre krympning av jonvätskan infiltrerade bakterier och virus jämfört med både dehydrerade sputterbelagda SEM-preparat och TEM-negativa färgade bilder (Tabell 1)., I samtliga fall var dimensionerna hos dehydrerade sem-sputterbelagda och negativt färgade TEM-mikrober från 9,9% till 18,9% mindre än de joniska vätskebehandlade proverna (Tabell 1). I en tidigare undersökning vi avbildade fryst-förglasat Ebolavirus genom kryo-elektronmikroskopi diametern av Ebolaviruset mättes som 96-98 nm16 som är mycket lik värdet av 98,5 ± 10,2 nm för diametern mätt av samma exemplar som behandlats med jonvätska i denna studie., Detta visar vidare att volymerna av de joniska vätskeinfiltrerade proverna är jämförbara med de som mäts under frusna hydratiserade förhållanden och återspeglar noggrant det fullständigt hydrerade inhemska tillståndet av ebolavirus. För en bacilliform struktur, en 10% minskning i dimensioner motsvarar en 27% minskning i volym på grund av uttorkning, men kollaps och tillplattning av den cylindriska formen skulle innebära en ännu större grad av vattenförlust., Det framgår tydligt av att denna tillplattning och kollaps på grund av uttorkning är närvarande i viss utsträckning i alla bilder av sputter belagda virus och bakterier (Fig. 1).

även om bilderna ser relativt lika ut, verkar guldsputterbeläggningen ge något mer kontrast än jonvätska. En annan observerbar skillnad är mindre av ytjämnheten hos bakteriecellväggarna i de joniska flytande färgade bilderna. Detta kan ses i bilderna av Salmonella (Fig. 1, Kompletterande Fig. S3)., I dessa bilder finns ett tydligt texturerat och skrynkligt utseende på ytan av de sputterbelagda bakteriecellerna och ett jämnt utseende på cellväggarna hos de joniska flytande infiltrerade preparaten. Vi föreslår att denna observerade skillnad i stor utsträckning är resultatet av förlust av cellturgor på grund av uttorkning och volymförlust i sputterbelagda exemplar och sålunda kan rynkorna faktiskt vara en artefakt eller funktion som accentueras av uttorkning., Stödjande bevis för detta kommer från det faktum att andra fina strukturer, såsom flagellae, är tydligt synliga (och av liknande utseende) i både sputter-belagda och Joniska flytande behandlade exemplar. Således kan resultaten från tidigare studier med sputterbeläggning av bakterier måste försiktigt återtolkas mot bakgrund av eventuella uttorkningseffekter.

det joniska vätskeproceduren som presenteras i denna undersökning är snabb och reproducerbar eftersom provfilter kan förberedas i förväg., Eftersom jonvätskan har ett mycket lågt ångtryck, är en extra fördel att torkartefakter som krympning, rynkning eller sprickbildning som kan uppstå under sem-observation undviks (Tabell 1, kompletterande Fig. S3). I framtiden förutser vi utvecklingen av en mängd olika typer av filterbeläggningar för att ytterligare förbättra SEM-tekniker med jonisk vätskefärgning för biologiska prover i storleksintervallet nanometer.