reactivi Chimici și anticorpi
venin de Albine colecție
veninul fost colectate cu ajutorul lucrători sau queens din mai multe populații diferite de Apid albine., Veninul de probe recoltate de la albinele Europene (Apis mellifera) și bondari (Bombus terrestris audax) provenit de la Perth (Australia), Dublin (Irlanda) și Londra (Anglia). Veninul de albine a fost colectat de la 30 de muncitori din fiecare dintre cele trei colonii diferite dintr-o stupină sau fermă, așa cum este descris. Veninul de albine din Australia a fost colectat dintr-o stupină întreținută de Centrul de cercetare integrativă a albinelor (CIBER), situat la Universitatea din Australia de Vest (UWA: -31.980151, 115.817919)., De albine veninul din Irlanda au fost colectate de la o colonie la o stupină la Colegiul Trinity din Dublin (53.343933, -6.254635), și alte două colonii de la fermele de lângă Glasnevin (53.383245, -6.276333) și Blanchardstown (53.384220, -6.375979). Veninul de albine și bumblebee din Anglia a fost colectat la Universitatea Royal Holloway din Londra (51.425626, -0.562987). Veninul de Bumblebee a fost colectat de la 20 de muncitori din fiecare dintre cele 2 colonii achiziționate comercial, cu bumblebees cu o singură regină din fiecare dintre aceste două colonii folosite pentru colectarea veninului reginei bumblebee., Amestecurile master biologice independente au fost preparate prin păstrarea separată a veninului din diferite colonii, cu veninul A 312 albine colectate în total.veninul Glandular a fost colectat prin disecție manuală. Albinele au fost capturate lângă intrarea stupului pentru albine sau direct din colonie pentru albine și anesteziate cu dioxid de carbon și răcite pe gheață. Aparatul sting a fost disecat de la fiecare individ; apoi glanda venin îndepărtat și plasat în soluție salină tampon fosfat (PBS)., Glandele au fost perforate cu un ac Terumo (25 g × 5/8) și centrifugate (13.000 g, 10 min, 4 °C), iar supernatantul a fost colectat, conținând venin în suspensie lichidă. Concentrația de proteină de fiecare mix master a fost cuantificată cu un Detergent Compatibil Proteine Test (Bio-Rad), măsurarea absorbanței la 750 nm cu un Mileniu Știință BioTek PowerWave XS2 (Gen 5 1.11 Software, Versiunea 1.11.5). Fiecare amestec principal a fost apoi alicotat și păstrat la -80 °C.,
linii de Celule și de condițiile de cultură
Toate liniile celulare au fost achiziționate de la American Type Culture Collection (Manassas, VIRGINIA, statele UNITE ale americii), cu excepția HEK293FT celule care au fost achiziționate de la Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australia), SUM149 și SUM159 care au fost obținute din Asterand Bioscience (Detroit, MI, statele UNITE ale americii), și T11 și B. 15 celule care au fost furnizate cu amabilitate de către Charles Perou și Liuba Varticovski de la Universitatea din Carolina de Nord la Chapel Hill și Institutele Naționale de Sănătate, respectiv. T11 și B. 15 sunt foarte bine-caracterizată de celule lines37,38.,
celulele au fost incubate la 37 °C și 5% CO2 și suplimentate cu 1% antibiotic–antimicotic. Celulele HDFa (fibroblaste dermice umane normale primare adulte) au fost cultivate în DMEM cu 10% ser fetal bovin (FBS). MCF 10A și MCF-12A (umane mamare imortalizat celule epiteliale, nontransformed) au fost menținute în DMEM/F-12 cu suplimente (5% fetale ser de cal, 20 ng/mL factor de creștere epidermică, 10 µg/µL insulină, 100 ng/mL toxina holerică, și 500 ng/mL hidrocortizon). Celulele NIH / 3T3 (fibroblaste embrionare murine) au fost menținute în DMEM cu 10% FBS., HEK293FT (celule renale 293 embrionare umane stabil exprimarea SV40 antigen T mare) a fost cultivat în DMEM cu 10% FBS și suplimente (1% glutamina și 0,4 mg/mL G418 Geneticin, Gibco). MCF7 (cancerul de sân uman luminal A) a fost menținut în mem α cu 10% FBS și suplimente (1% fiecare din piruvatul de sodiu, Bicarbonatul de sodiu și aminoacizii neesențiali). T-47D și ZR-75-1 (ambele cancer de sân uman luminal A) au fost cultivate în RPMI cu 10% FBS. MDA-MB-231 (human claudin-cancer de sân scăzut) a fost cultivat în DMEM cu 10% FBS., SUM149 (cancer de sân uman bazal) a fost cultivat în F-12 cu 10% FBS. SUM159 (uman tip-scăzut de cancer de san) a fost cultivat în F-12 cu 5% FBS și suplimente (5 µg/mL insulină și 1 µg/mL hidrocortizon). MDA-MB-453 (cancerul de sân îmbogățit cu HER2 uman) a fost cultivat în DMEM cu 10% FBS. SKBR3 (cancerul de sân îmbogățit cu HER2 uman) a fost cultivat în RPMI cu 10% FBS și 1% piruvat de sodiu. p53− T11 (murine claudin-cancer de sân scăzut) a fost menținut în RPMI 1640 mediu cu 10% FBS. BRCA-B. 15 (cancerul de sân murin bazal) a fost menținut în mediul RPMI 1640 cu 10% FBS.,
testele de viabilitate celulară
viabilitatea celulară a fost determinată prin testul de viabilitate celulară luminescentă în conformitate cu protocolul furnizorului. Celulele au fost placate în plăci de cultură cu 96 de puțuri și incubate la 37 °C și 5% CO2 timp de 24 h. pentru testele doză–răspuns, mediile au fost aruncate și înlocuite cu medii care conțin concentrații indicate de venin de albine sau peptidă și cultivate timp de 24 h., Pentru viabilitatea celulară de peste 60 de minute, celulele au fost tratate cu IC50 de venin de albine sau melittină pentru fiecare linie celulară pentru intervale scurte de timp de peste 1 oră, iar viabilitatea a fost determinată imediat după tratament. Pentru a determina viabilitatea, celulele au fost incubate cu reactiv CellTiter-Glo (CTG) 2.0 timp de 10 min. Viabilitatea celulară a fost cuantificată prin măsurarea luminiscenței utilizând un cititor Multilabel EnVision 2102 (PerkinElmer). Experimentele au fost efectuate în replicate biologice (n = 3).,
producerea unui anticorp monoclonal primar împotriva melittinei
producția de anticorpi a fost efectuată în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul de etică animală al Institutului de Cercetări Medicale Harry Perkins. Șoarecii de sex feminin A / J au fost imunizați cu venin de albine colectat în Australia. Șoarecii au primit injecții intraperitoneale de 12 µg de venin în adjuvantul complet al lui Freund (Difco), urmat de un impuls în adjuvantul incomplet al lui Freund în ziua 29 și un impuls apos în PBS la 7 µg/șoarece în ziua 49. Șoarecii au fost sângerați în ziua 60, iar serurile au fost testate prin ELISA., Cel mai bun răspuns a fost amplificat cu 7 µg de venin de albine în PBS cu 4 zile înainte de fuziune. Celulele splinei au fost fuzionate cu celulele mielomului Sp2/O conform procedurilor standard82. Supernatanții care conțin anticorpi au fost examinați prin ELISA. Hybridoma clone 3B9 a fost selectat pentru studii suplimentare. Anticorpul a fost produs prin creșterea celulelor hybridoma în bioreactori în mediul liber seric Hybridoma (Gibco). Anticorpul a fost purificat prin cromatografia proteinei G-Sepharose. Anticorpul purificat a fost dializat în PBS (pH 7,3). Anticorpul a fost de acum înainte denumit anticorp anti-melittin (3B9).,Venomele și peptidele au fost placate în plăci clare de 96 de puțuri pe bază de curbă la 5 µg/mL în tampon carbonat și incubate la 4 °C timp de 24 de ore. lichidul a fost îndepărtat, iar plăcile spălate de trei ori într-o soluție de 0,05% TWEEN-20 („Tween-20”, Sigma-Aldrich) în PBS. Anticorpii primari au fost adăugați în godeuri cu diluții 1:2 începând de la 10 µg/mL în diluant (0,1% albumină serică bovină (BSA) în PBS) și incubați timp de 1 h la temperatura camerei. Anticorpii primari au fost îndepărtați, iar plăcile au fost spălate de trei ori în 0.,05% Tween-20 în PBS. Anticorpul secundar specific lanțului IgG γ policlonal de capră anti-șoarece a fost adăugat în godeuri (1: 1000 în diluant) și incubat timp de 1 h la temperatura camerei. Anticorpii primari au fost îndepărtați, iar plăcile au fost spălate de trei ori în 0,05% Tween-20 în PBS. Tamponul de dezvoltare ELISA, o soluție de apă purificată care conține 10% acid citric (pH 4,2), 2% ABTS și 0,1% H2O2, a fost adăugat în puțuri, iar plăcile au fost incubate în întuneric la temperatura camerei timp de 15 min., Absorbanța a fost înregistrată la 405 nm folosind cititorul de plăci VICTOR Light cu software-ul Wallac 1420 Manager (PerkinElmer). Controlul a fost mouse-ul monoclonal IgG anticorpi (28/00 8C1-6), care reacționează cu om IL-12, aplicat la melittin de peptide pe placa ELISA. Experimentele au fost efectuate în replicate biologice (n = 3).celulele HDFa și SUM159 au fost placate în plăci de cultură cu 96 de puțuri și incubate la 37 °C și 5% CO2 timp de 24 de ore., Creșterea concentrațiilor de anti-melittin de anticorpi au fost incubate cu IC50 concentrații de albine veninul sau melittin pentru fiecare linie de celule de 1 h la temperatura camerei, și apoi se adaugă la celule pentru 24 de ore. Viabilitatea celulară a fost determinat după cum este descris în „viabilitatea Celulară teste”. Experimentele au fost efectuate în replicate biologice (n = 3).celulele au fost placate pe plăci cu 6 puțuri la o densitate de 300.000 celule/puț și incubate la 37 °C și 5% CO2 timp de 24 de ore., Experimentele de culturi celulare au fost efectuate așa cum este descris, iar apoi protocolul standard Western blot a fost urmat așa cum este descris aici. Celulele au fost spălate cu PBS rece și lizate cu tampon de liză proteică rece (2% dodecil sulfat de sodiu (SDS), 125 mmol/l Tris-HCl, pH 6,8). Probele au fost sonicate timp de 10 s la 10 mA, iar concentrațiile de proteine cuantificate cu testul de proteine compatibil cu detergentul (Bio-Rad). Cantități egale de proteine au fost amestecate cu tampon de încărcare (tampon de probă Laemmli, Bio-Rad) suplimentat cu agentul reducător ditiotreitol (DTT)., Probele de proteine au fost denaturate prin fierbere la 95 °C timp de 5 min, încărcate în geluri prefabricate Mini-proteice (Bio-Rad) și supuse electroforezei la 100 V, apoi transferate în membrane PVDF (Bio-Rad) Cu sistemul de transfer Turbo Trans-Blot (Bio-Rad) timp de 7 min. Membranele au fost incubate cu TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl și 0,1% Tween-20) cu 5% lapte degresat pentru a bloca legarea nespecifică. Membranele au fost incubate peste noapte la 4 °C cu anticorpii primari diluați în 3% BSA și 0,02% azidă de sodiu., Semnalul a fost detectat cu Luminata Crescendo Vest HRP Substrat (Millipore) cu ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad), care rulează Image Lab Software (Bio-Rad, Versiunea 6). Western blots au fost derivate din același experiment și prelucrate în paralel. Scanările neprocesate ale Western blots sunt furnizate în smochine suplimentare. 10–15.
citometria în flux
apoptoza și necroza au fost evaluate utilizând kitul de detectare a apoptozei Anexin V-FITC i (BD Biosciences) în conformitate cu protocolul producătorului. Celulele SUM159 au fost placate în plăci de cultură cu 6 puțuri timp de 24 de ore., Mediile au fost apoi aruncate și înlocuite cu medii care conțin venin de albine sau melittină (concentrații IC50) și cultivate timp de 60 min. Celulele au fost colectate cu tripsină și medii și centrifugate (1000g, 5 min, 24 °C), spălate cu PBS rece, centrifugate (1000g, 5 min, 24 °C) și resuspendate în tampon de legare 1×. Celulele au fost preparate la o concentrație de 1 milion celule/mL în 1× tampon de legare. Probele au fost incubate cu FITC și PI (5 µL din fiecare) în întuneric timp de 15 min., Prezența celulelor vii, moarte, apoptotice sau necrotice a fost evaluată cu CITOMETRUL BD Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, SUA) cu software bd Accuri C6 și analizată cu FlowJo™ (Ashland, SUA, Windows versiunea 7). Experimentele au fost efectuate în replicate biologice (n = 3). Strategiile de închidere sunt prezentate în Fig. 16.
Live-celule microscopie
SKBR3 celulele au fost placat într-un fund de sticlă microwell vas (10 × 35 mm, MatTek) și incubate timp de 24 h., Vasul microwell a fost lăsat să se echilibreze într-o cameră de incubare NIKON Eclipse Ti confocal microscop stage-top (37 °C și 5% CO2) timp de 20 min. Obiectivul 20× a fost utilizat cu alinierea Kohler, iar imaginile au fost luate în fiecare minut de la 10 min înainte la 1 h după tratamentul cu IC50 al veninului de albine colectat în Australia., Autorii recunosc facilitățile și asistență științifică și tehnică oferit de către National de Imagistica Facilității Național de Cercetare Colaborativă, Strategia Infrastructurii (NCRIS) capacitatea, precum și Australian Microscopie & Microanaliză centru de Cercetare, atât la Centrul de Microscopie, Caracterizarea și Analiza (CMCA), UWA, o instituție finanțată de către Universitate, de Stat și Comunitatea de Guverne.,capacele de sticlă (diametru de 12 mm, Menzel, Thermo Fisher Scientific) au fost acoperite cu bromhidrat de poli-L-lizină (Sigma-Aldrich) timp de 20 min și apoi spălate de două ori cu apă purificată. SUM159 celulele au fost placat pe lamele de sticlă la desimea de 62.500 de celule/godeu și se incubează la 37 °C și 5% CO2, timp de 24 h. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS și apoi tratat cu vehicul sau CI50 concentrații de albine veninul și melittin pentru 1 sec., Celulele au fost spălate de două ori cu PBS, apoi fixate cu 4% formaldehidă în PBS timp de 25 min, apoi spălate din nou de trei ori cu PBS. În pregătirea pentru microscopie, probele au fost scufundate în 2,5% glutaraldehidă și au fost incubate la 4 °C timp de 2 ore. probele au fost spălate cu apă deionizată și scufundate în concentrații crescânde de etanol (50%, 70%, 95%, 100%, și apoi 100% etanol absolut „uscat”). Între fiecare imersiune, probele au fost deshidratate într-un cuptor cu microunde specializat (PELCO, BioWave 34700 sistem de microunde de laborator)., Procesul de deshidratare a fost completat cu un aparat critic de uscare a punctelor E3000 pentru a înlocui etanolul din eșantion cu CO2 supercritic. Capacele prelucrate au fost montate pe suporturi SEM (ProSciTech) cu file de carbon. Probele au fost acoperite cu 3-nm platinum pentru a le face electronic conductoare înainte de a fi vizualizate la microscop (Zeiss 1555 VP-FESEM) la CMCA, UWA. Imaginile au fost realizate cu detectorul de lentile la o distanță de lucru de 2,6 mm, o deschidere de 30 µm și o tensiune de accelerare de 5 kV., Imaginile au fost analizate cu software-ul de analiză a imaginii FIJI (ImageJ)83.capacele de sticlă (diametrul de 12 mm, Menzel, Thermo Fisher Scientific) au fost plasate în plăci cu 24 de puțuri și acoperite cu poli-L-lizină (Sigma-Aldrich) timp de 20 de minute și apoi spălate de două ori cu apă purificată. SUM159 celulele au fost placat pe lame de sticlă și se incubează la 37 °C și 5% CO2, timp de 24 h. Celulele au fost tratate timp de 30 de minute cu mașina, sau CI50 de venin de albine, melittin, RGD1-melittin, și echivalentul concentrația molară ca melittin pentru DEDE-melittin., Celulele au fost spălate de două ori cu PBS, apoi fixate cu 4% paraformaldehidă în PBS timp de 25 min, apoi spălate din nou de trei ori cu PBS. Legarea anticorpilor nespecifici a fost blocată folosind 5% ser normal de capră (Thermo Fisher Scientific) în PBS timp de 1 h la temperatura camerei. Anticorpi primari au fost adăugate la celule, inclusiv monoclonali anti-melittin anticorp (5 µg/mL) și 1:500 de anti-EGFR (Abcam). Probele au fost incubate cu balansare ușoară la 4 °C peste noapte., Celulele au fost spălate de trei ori cu PBS, și apoi incubate cu 1:500 de Alexa Fluor 488 de capră anti-mouse-ul anticorpul secundar, 1:500 de Alexa Fluor 594 de capră anti iepure cu anticorpul secundar, și Hoechst (1:5000) în PBS la temperatura camerei timp de 1 sec. Probele au fost spălate de trei ori cu PBS și montate pe lamele de sticlă cu SlowFade Diamant Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific). Diapozitivele au fost imaginate folosind microscopul inversat cu fluorescență confocală Nikon Ti-E. Imaginile au fost luate folosind un obiectiv de 20× aer (NA 0.,75) și excitație secvențială folosind lungimi de undă de 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (anticorp secundar Alexa Fluor 488) și 561 nm (anticorp secundar Alexa Fluor 594). Imaginile au fost colectate folosind Software-ul Nis-c Elements și procesate folosind Fiji (ImageJ) la CMCA83.
transferul de energie prin rezonanță Bioluminescentă (BRET)
interacțiunile ligand–Receptor au fost evaluate cu BRET, utilizând o metodă similară celei descrise anterior84,85., BRET implică nonradiative transfer de energie (dipol–dipol) între două proteine sau molecule de interes etichetate cu nici un donator luciferază sau acceptor fluorophore după substrat de oxidare de luciferază și, ulterior, a emisiilor de light54. FITC categorie au fost conjugate la N-terminus al melittin (FITC-melittin) și DEDE-melittin (FITC–DEDE-melittin). Celulele HEK293 care exprimă stabil antigenul T mare SV40 (HEK293FT) au fost placate pe plăci cu 6 puțuri la o densitate de 550.000 celule/puț timp de 24 de ore., HEK293FT celulele au fost transfectate cu plasmide care conțin adnc pentru NanoLuc-EGFR folosind FuGENE. Pe scurt, ADNc plasmidă a fost incubată timp de 10 minute la temperatura camerei cu un amestec de reactiv de transfecție și DMEM fără ser la un raport de 10 ng/µL NanoLuc-EGFR: 4 µL de Fugen: 100 µL de SFM. Amestecul a fost adăugat la HEK293FT celule la o concentrație finală de 10 ng/µL NanoLuc-EGFR pe ei de 6-ei bine placa, iar celulele incubate timp de 24 h. Celulele au fost spălate cu PBS și detașat cu tripsina, apoi colectate în mass-media care conțin 5% ser fetal de vițel în roșu fenol-gratuit DMEM., Celulele au fost placat de la 50.000 celule/în poli-l-lizina-acoperite 96-ei bine plăci albe și incubate timp de 24 h. Pentru ambele saturație și cinetică BRET teste, două filtre au fost folosite pentru a măsura simultan scurt și lung de undă de luminescență corespunzătoare la lungimi de undă de emisie de donor și acceptor de molecule, respectiv.
în timp real ligand asociere cinetica experimente, mass-media a fost eliminat din celule, care au fost apoi incubate cu 50 µL/godeu de NanoLuc substrat furimazine până la o concentrație finală de 10 µM diluat în Hank Echilibrată Soluție de Sare (HBSS)., Celulele au fost apoi echilibrate în cititorul de plăci CLARIOstar (BMG Labtech, Australia) timp de 5 minute pentru a înregistra citirile bazale. De liganzi (TAMRA-FEG, FITC-melittin, și FITC–DEDE-melittin) au fost apoi adăugat la o serie de corect concentrațiile finale, și NanoBRET înregistrări luate la fiecare 90 s pentru 60 de minute la 37 °C. Pentru saturație experimente, mass-media a fost eliminat din celule, și o serie de concentrații ale TAMRA-FEG, FITC-melittin, și FITC–DEDE-melittin adăugat în prezența sau absența unei concurente de concentrare (1 µM) de neetichetate FEG și se incubează la 37 °C timp de 60 min în întuneric., Furimazina a fost adăugată la o concentrație finală de 10 µM. Înregistrările au fost făcute folosind LUMIstar Omega (BMG Labtech, Australia). Datele sunt prezentate ca „raportul BRET brut”, derivat din raportul emisiei de lungime de undă lungă (acceptor) față de emisia de lungime de undă scurtă (donator). Experimentele au fost efectuate în replicate biologice (n = 3).
Analiza combinată de droguri efecte
venin de Albine sau melittin a fost combinat cu docetaxel și administrat în concentrațiile indicate într-o nonconstant raport în T11 celule pentru 24 de ore., Viabilitatea celulară a fost evaluată utilizând CellTiter-Glo, așa cum s-a menționat anterior. Efectul combinat al veninului de albine sau al melitinei cu docetaxelul a fost evaluat prin metoda mediană doză-efect utilizând software-ul CompuSyn (ComboSyn). Această metodă determină un IÎ bazat pe efectul unei combinații între doi agenți (unde IÎ < 1 este sinergic, IÎ > 1 este antagonist și IÎ = 1 este aditiv)56. Experimentele au fost efectuate în replicate biologice (n = 3).,aceste experimente pe animale au fost efectuate în conformitate cu protocoalele aprobate de Comitetul de etică a animalelor din UWA. Pentru a simula un model avansat de tip-scăzut de cancer de sân, de 2,5 × 105 T11 celulele au fost suspendate în ser-mass-media libere și BD Matrigel Matrice Concentrație Mare (BD Bioscience) într-un raport de 1:1 până la un volum total de 100 µL și se injectează subcutanat în flancurile de 5 săptămâni BALB/cJ femele (Animal Centrul de Resurse, WA, Australia), folosind un 26-G ac., La T11 celule utilizate au fost lentivirally transduced cu ZsGreen-luciferază construi și sortate de trei ori pentru a realiza o îmbogățire superioară decât 99% din luciferază-celule pozitive. Melittin a fost suspendat în apă Milli-Q + 5% dextroză. Docetaxel (praf) a fost suspendat în 25% TWEEN 80 (Sigma-Aldrich), și 75% dintr-un amestec de 15.25:84.75 (v/v) soluție de etanol absolut și apă purificată și se păstrează la -20 °C. Imediat înainte de tratamente, docetaxel a fost proaspăt diluat în Milli-Q apa + dextroză 5% în concentrație finală necesară., La trei zile după generarea tumorilor T11 (~50 mm3), șoarecii au fost randomizați în 4 grupe (n = 12 șoareci/grup). Tratamentele au fost injectate intratumorally pe zile 3, 5, 7, 9, 11, 13, și 15 post inoculare de T11 celule, cu vehiculul, melittin (5 mg/kg), docetaxel (7 mg/kg), sau o combinație de melittin (5 mg/kg) și docetaxel (7 mg/kg). Animalele au fost monitorizate pentru dimensiunea tumorii la fiecare 2 zile, iar volumele calculate prin formula elipsoidă modificată (volum = lățime2 × lungime/2). Animalele au fost sacrificate uman când tumorile au ajuns la 800 mm3.,
analiza imunohistochimică a tumorilor
țesuturile tumorale au fost fixate în paraformaldehidă 4%, spălate de trei ori în PBS și lăsate în etanol 70%. Tumorile au fost încorporate în parafină și au fost preparate secțiuni de 5 µm. Pentru hematoxilină/eozină, slide-uri au fost deparafinate, hidratata folosind o scădere soluție banca de etanol, colorate cu Gill hematoxilină, deshidratat, folosind etanol 70%, colorate cu eozină, în continuare deshidratate folosind 100% etanol, aprobate prin toluen, și montate în lamele folosind Acrymount IHC montare mass-media (StatLab)., Apoptoza celulelor tumorale a fost determinată în secțiuni de țesut prin testul TUNEL (in Situ Cell Death Detection Kit, Roche).pentru a urmări cu exactitate modificările în creșterea tumorii in vivo cu tratamentele, am efectuat analiza bioluminescenței folosind sistemul Imagistic Caliper IVIS Lumina II la CMCA, UWA. Analizele au fost efectuate la fiecare 2 zile după generarea tumorilor. Șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 200 µL de D-luciferină (substanță chimică Cayman) la concentrația finală de 150 mg/kg dizolvată în PBS înainte de a fi anesteziați la 4% izofluran., Odată anesteziat, șoarecii au fost plasate în interiorul prewarmed camera de bioluminiscență imager și sonda 7-12 min după injectare, sub 2% isofluran, până bioluminiscență semnal de intensitate a ajuns la o stare de echilibru.
analiză statistică
toate datele au fost obținute din experimente multiple efectuate cel puțin în trei exemplare. Analizele statistice au fost efectuate cu GraphPad Prism V8 (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft) și SPSS Predictive Analytics Software (IBM, versiunea 26)., Pentru testele de viabilitate celulară, datele au fost normalizate la luminescența medie a stării vehiculului, care a fost considerată viabilitate 100%, cu IC50s derivată din prisma GraphPad. Pentru imunohistochimie în tratate T11 tumori pentru a detecta p-HER2 (Tyr1248) și p-EGFR (Tyr1068), vehiculul a fost normalizat la 100%., În cazul în care este adecvat și ca inculpat în textul principal, semnificația statistică a fost determinată folosind nepereche two-tailed testul Student, nepereche one-way ANOVA cu a lui Tukey HSD test post hoc corectat pentru comparații multiple, două-way ANOVA cu măsurători repetate urmate de Sidak sau multiple Tukey-kramer-test de comparație, sau un model liniar generalizat (GLM). Pentru toate testele, diferențele au fost considerate semnificative la p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), și p < 0.001 (***).,
Rezumatul raportării
informații suplimentare despre proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul raportării cercetării naturii legat de acest articol.
Leave a Reply