Pentru a produce un conductor electric de suprafață pentru SEM, specimene biologice sunt adesea acoperite cu un strat subțire de evaporare sau pulverizare de carbon sau metal în vid coater, care necesită o prealabilă deshidratare a epruvetei. Acest proces de acoperire poate ascunde detalii ultrastructurale fine, în funcție de grosimea stratului depus (de obicei 2-20 nm)., Aceste proceduri convenționale sunt dificil de a efectua, pe tipic microbiologice exemplare, care sunt, de obicei, suspensii de mici particule biologice în apă (<100 nm pentru cele mai multe virusuri, sau în sub-micrometru gama de dimensiuni pentru multe bacterii, fungi și paraziți). O problemă suplimentară este că microbii interesați de specimenele pacientului sau de probele de mediu pot fi prezenți în concentrații relativ scăzute, ceea ce face dificilă observarea lor pe o suprafață.,în acest raport descriem metodele de concentrare a suspensiilor microbiene pentru observarea SEM pe substraturi filtrante pre-acoperite. Vom arăta că, în loc de acoperire prin pulverizare, un lichid ionic (1-butil-3-methylimidazolium tetrafluoroborate) diluat în apă poate fi folosit pentru a rapid infiltreze un microbiologice SEM proba, formând un electron-lucent suprafață conductoare, care previne specimen de încărcare și dă rezultate bune cu microbiene exemplare (Fig. 1)., Lichidele ionice sunt săruri cu conductivitate ridicată care rămân în stare lichidă la temperatura camerei și au o presiune neglijabilă a vaporilor (≤5 × 10-9 Torr). Sub vid înaintat condiții moderne de SEM (≤1 × 10-6 Torr) lichide ionice rămâne în stare lichidă și nu se evaporă în timpul funcționării, în timp ce încă fiind conductive19,20,21,22,23. Cele mai utile lichide ionice pentru aplicații biologice SEM au o conductivitate electrică de aproximativ 100 de mScm−1, sunt electrochimic stabil (având un electrochimice fereastră de aproximativ 5,8 V), precum și ca fiind solubil în apă și sunt ușor de synthesised24., S-a demonstrat anterior că lichidele ionice cu aceste proprietăți oferă un contrast de imagine SEM comparabil cu utilizarea stratului de metal și carbon atunci când sunt utilizate cu specimene izolante19,25. Au fost, de asemenea, folosit pentru macroscopic imagistica de specimene biologice, cum ar fi alge marine, tesuturi, celule de cultură și condensat chromosomes20,21,22. Pentru a preveni încărcarea20 au fost utilizate substraturi Conductive, cum ar fi oxidul de indiu-staniu, folia de aluminiu sau capacele acoperite cu metal, cu toate acestea, aceste materiale nu sunt potrivite pentru filtrarea pentru investigațiile SEM ale microbilor., Am descoperit că, pentru rezultate optime folosind lichid ionic cu obiecte subcelulare, cum ar fi viruși sau flageluri bacteriene, a fost necesară acoperirea prealabilă a filtrelor din policarbonat cu aluminiu sau aur. Nu am detectat niciun drift de specimene atunci când folosim specimene biologice colorate cu lichid ionic, deoarece acestea au fost bine susținute de membrana conductoare utilizată în timpul procesului de filtrare inițială. Filtrele din policarbonat SPI-pori sunt hidrofile și rămân astfel după acoperirea metalică, ceea ce le face un substrat ideal pentru a lucra cu probe biologice hidratate., Ionic lichid de colorare pot fi, de asemenea, realizată într-un termen biologic cabinet de securitate, oferind o rapidă și sigură alternativă de acoperire prin pulverizare atunci când se lucrează cu infecțioase probe, de vid, echipamente de acoperire poate provoca aerosoli și nu este ușor de contained20,21,22. Am rezolvat elegant problema concentrării probei și a prevenirii încărcării, prin acoperirea metalică a substratului filtrului însuși înainte de aplicarea probei biologice (Fig. 2). În absența acoperirii subțiri a probelor, a fost necesară și infiltrarea cu lichide ionice pentru a evita încărcarea., Rezultatele sunt comparabile cu utilizarea SEM cu acoperire prin pulverizare și TEM folosind tehnica de colorare negativă (Figurile 1 și 2: figurile suplimentare S1–S5). Ultra-filtrarea este un pas important, deoarece ajută la îndepărtarea resturilor care pot ascunde detaliile virușilor sau bacteriilor prezente în probele biologice. În raportul actual, demonstrăm imagini clare ale virusurilor și flagelelor bacteriene în specimene sem neacoperite, care au necesitat anterior deshidratarea și acoperirea prin pulverizare, extinzând astfel rezoluția și gama de probe microbiene care pot fi investigate cu SEM.,
Pregătirea probelor biologice pentru SEM.
(a) componentele unității de filtrare sunt prezentate înainte de asamblare., Imaginea inset SEM prezintă un filtru acoperit cu aur la mărire mare înainte de aplicarea unui specimen. Rețineți că filtrul este curat și porii sunt clar evidenți. (b) unitatea de filtrare este prezentată după asamblare și în utilizare cu o pompă de seringă într-un dulap de biosecuritate (c,d). Săgeata albastră din (d) indică unitatea de filtrare. (e) imagini ale filtrelor care au evaporat metalul pe ele. Grosimea Al este de 18 nm și 9 nm, iar UA este de 27 nm și 9 nm grosime. Pentru filtrul cu ambele metale grosimea Al și Au Sunt 18 nm și 27 nm, respectiv., (f) SEM și (g) harta elementară corespunzătoare generată de microanaliza cu raze X a unei regiuni similare cu cea evidențiată de dreptunghiul punctat de la (e). (h-k) imagini SEM ale salmonelei colorate cu lichid ionic care ilustrează efectul diferitelor tipuri de metale și grosimea metalului evaporat asupra imaginilor finale înregistrate (h al 9 nm, i Au 9 nm, j Al 18 nm, K Au 27 nm). Săgețile roșii indică flageluri.
imaginile bacteriilor colorate cu lichid ionic au avut o topografie de suprafață mai fină decât cele care au fost deshidratate și acoperite cu pulverizare., Măsurătorile de mărime arată că exemplarele deshidratate s-au redus cu aproximativ 10-20% (Tabelul 1). Interpretăm detaliile suprafeței pe bacteriile deshidratate, acoperite cu pulverizare, ca o încrețire a peretelui celular datorită contracției, mai degrabă decât observarea caracteristicilor suplimentare care sunt prezente in vivo: aceste riduri sunt astfel susceptibile de a fi artefacte datorită uscării. Flagelele bacteriene au fost, de asemenea, vizibile în mod clar cu tratamentul lichid ionic pe substraturile conductoare (Fig. 1, Fig Suplimentar. S3). Aceste rezultate au fost comparabile cu cele pe care le-am observat cu acoperire SEM-sputter și colorare TEM-negativ.,
de lichid Ionic tehnici pot fi, de asemenea, utilizate în condiții de siguranță cu agenți patogeni infecțioși, într-o biologic cuprinse SEM cabina, care permite caracterizarea de noi agenți infecțioși într-o stare aproape de a lor hidratat „limba de stat” decât prin convenționale de pregătire a probelor techniques8. În cazul acestei investigații, protocolul nostru convențional a implicat deshidratarea în serii de etanol, urmată de uscarea aerului și acoperirea metalului înainte de imagistica SEM., Pentru protocolul lichid ionic, proba biologică a avut o picătură de soluție apoasă 2,5% de tetrafluoroborat de 1-butil-3-metilimidazoliu plasat direct pe ea. După blotting pentru a elimina excesul de lichid proba umedă a fost apoi plasat direct în SEM. În cazul probelor infecțioase, este necesară o etapă suplimentară de fixare a aldehidei pentru procedura convențională pentru a evita riscul de aerosoli infecțioși care ar putea fi generați în timpul procesului de acoperire prin pulverizare., Această repararea pas nu este necesar cu lichid ionic tehnica, de proba pot fi prelucrate într-un biologic izolare capotă și apoi să fie plasate direct într-un SEM într-un biologic cuprinse SEM enclosure8, pentru imagini într-un nefixate, hidratat stat, care este mult mai aproape de starea inițială a organismului. Microscopie completează convenționale teste de diagnostic care pot lipsi roman sau varianta strains3,26,27,28 și poate identifica rapid tipul de organism prezent, directoare selectarea mai specifice tests29., Cu toate acestea, microscopia electronică necesită de obicei o concentrație minimă de particule pentru identificarea fiabilă a microbilor. Pentru viruși, aceasta este cuprinsă între 105 și 106 particule de virus/mL4,5. Cu ajutorul tehnicilor de filtrare, atât TEM cât și SEM de virusuri pot fi efectuate cu cel puțin 5000 de particule pe eșantion7.colorarea cu lichid Ionic pe filtrele pre-acoperite este aplicabilă pe scară largă oricărei probe biologice care poate beneficia de filtrare pentru a concentra particule de interes., Utilizarea filtrelor metalice acoperite cu mai mult de un tip de acoperire pe diferite zone permite selectarea oricăruia dintre aceste acoperiri dă rezultate optime pentru observarea unui anumit specimen sau caracteristici specifice și ajută la economisirea timpului (Fig. 2a, E-k). De exemplu, după ionic lichid de colorare bacteriene flagellae apărut mai luminos împotriva Al-substrat acoperit, în timp ce pe Au-zona acoperită de filtru contrastul este inversat și flagellae apărut mai inchisa (Fig. 2h-k)., În mod similar, imagini de virusul Ebola și Leptospira biflexa arătat de bună calitate topografice de detaliu atunci când sonda cu aluminiu acoperite cu filtru, dar materialul biologic a avut mai puțin de detaliu și a apărut ca un întuneric plat silueta când sonda pe strat de aur de filtre (Suplimentare Smochine S4 și S5). Propunem ca acest lucru să se datoreze semnalului de emisie secundară de electroni mai mare de la Au comparativ cu Al. În această investigație am colectat imagini SEM cu detectorul secundar de electroni, care este cel mai frecvent utilizat pentru imagistica de rutină cu specimene biologice., În SEM, coeficientul de emisie secundară de electroni (δ) este relativ constant indiferent de numărul atomic. Cu toate acestea, o excepție este Cu Au, pentru care δ este aproape de două ori mai mare decât Al și multe alte elemente. Valoarea δ este, de asemenea, afectată de energia fasciculului: la 20 kV, δ este 0,1 pentru Al și 0,2 pentru Au30. Prin măsurarea intensității în imagini electronice secundare realizate la 4 kV atât cu Al cât și cu Au în aceeași imagine (Fig. 2F), am calculat semnalul de la UA să fie de 2,1 ori intensitatea Al, care este aproape de cea așteptată teoretic., Cu imagini înregistrate de exemplare pe strat de aur de filtre, vom interpreta rezultatele ca produce prea mult contrast de fundal substrat, care au avut tendința de a ascunde detalii fine, cum ar fi flagellae care apar ca un „siluete”, pe un fundal luminos. Cu toate acestea, microbii infiltrați cu lichid ionic și filtrul acoperit cu aluminiu au coeficienți de emisie similari, astfel contrastul se datorează în mare parte topografiei, mai degrabă decât diferențelor de compoziție a materialului, permițând vizualizarea mai multor detalii fine.,Pre-acoperirea filtrelor cu metal nu a afectat dimensiunile porilor sau capacitatea de filtrare a filtrelor (Fig. 2). Întregul protocol de colorare a lichidului ionic poate fi realizat pe o bancă standard de laborator în aproximativ 15 minute și se potrivește în interiorul unui dulap de biosecuritate (Fig. 2C, d). În stratul de pulverizare pentru SEM, un strat prea subțire provoacă o conducere și o încărcare slabă, în timp ce un strat prea gros ascunde detalii fine., Grosimea utilizată pentru pre-acoperirea substraturilor poate fi mult mai mare decât acoperirile de pulverizare utilizate în mod obișnuit pentru specimene biologice, pentru a asigura o bună conductivitate, atât timp cât porii filtrului nu sunt blocați. (Fig. 2e-k, suplimentar Fig. S2).
în această investigație am folosit acoperiri de 18 și 27 nm pentru Al și respectiv Au, deoarece aceste grosimi s-au dovedit a fi suficiente pentru a preveni încărcarea, în comparație cu filtrele neacoperite (Fig suplimentar. S2). Substraturile cu aceste grosimi minime au fost selectate cu ușurință, deoarece erau vizibile ca o acoperire metalică strălucitoare., Când au fost prezente acoperiri mai mici de 27 nm pentru Au sau 18 nm pentru Al, acestea au avut un aspect opac sau alb-plat (Fig. 2). Cu colorarea lichidului ionic folosind aceste filtre acoperite cu metal, am putut vizualiza detaliile structurale fine ale bacteriilor, cum ar fi flagelele de Salmonella, care au un diametru de 20 nm, prin SEM (Fig. 2J, k, suplimentar Fig. S3).,rezultatele obținute prin filtrare și infiltrare lichidă Ionică simplă pentru SEM sunt foarte comparabile în calitate cu cele obținute prin acoperire convențională prin pulverizare în SEM și colorare negativă în TEM pentru o varietate de specimene bacteriene și virale, inclusiv Leptospira, Salmonella, virusul vaccinia și virusul Ebola (Fig. 1, Fig Suplimentar. S3-S5)7,16,31,32. Am constatat că a existat o contracție mult mai mică a bacteriilor și virusurilor infiltrate în lichid ionic, comparativ atât cu preparatele sem acoperite cu pulverizare deshidratată, cât și cu imaginile colorate negativ TEM (Tabelul 1)., În toate cazurile, dimensiunile microbilor TEM deshidratați acoperiți cu SEM și colorați negativ au fost de la 9,9% la 18,9% mai mici decât specimenele tratate cu lichid ionic (Tabelul 1). Într-o anchetă anterioară am fotografiat congelate-vitrificate virusul Ebola prin crio-microscopie electronică diametrul de virusul Ebola a fost măsurată ca 96-98 nm16 care este foarte similar cu o valoare de 98,5 ± 10.2 nm pentru diametrul măsurat de același exemplarele tratate cu lichid ionic în studiul de față., Acest lucru demonstrează în continuare că volumele probelor infiltrate cu lichid ionic sunt comparabile cu cele măsurate în condiții hidratate înghețate și reflectă îndeaproape starea nativă complet hidratată a virusului Ebola. Pentru o structură baciliformă, o reducere de 10% a dimensiunilor este echivalentă cu o reducere de 27% a volumului datorată deshidratării, deși colapsul și aplatizarea formei cilindrice ar implica un grad și mai mare de pierdere a apei., Este clar că această aplatizare și colaps din cauza deshidratării este prezentă într-o oarecare măsură în toate imaginile virusurilor și bacteriilor acoperite cu pulverizare (Fig. 1).deși imaginile par relativ similare, acoperirea cu pulverizare de aur pare să dea un contrast puțin mai mare decât lichidul ionic. O altă diferență observabilă este mai mică de rugozitatea suprafeței pereților celulelor bacteriene din imaginile colorate cu lichid ionic. Acest lucru poate fi văzut în imaginile salmonelei (Fig. 1, Fig Suplimentar. S3)., În aceste imagini există un aspect clar texturat și încrețit pe suprafața celulelor bacteriene acoperite cu pulverizare și un aspect neted pe pereții celulari ai preparatelor infiltrate cu lichid ionic. Propunem ca această diferență observată să fie în mare măsură rezultatul pierderii turgorului celular datorită deshidratării și pierderii de volum în specimenele acoperite cu pulverizare și astfel ridurile pot fi de fapt un artefact sau o caracteristică accentuată de deshidratare., Dovezi pentru acest lucru vine din faptul că alte structuri, cum ar fi flagellae, sunt în mod clar vizibile (și de aspect similar) în ambele bolborosi filmat și lichid ionic tratat de exemplare. Astfel, rezultatele studiilor anterioare care utilizează acoperirea cu pulverizare a bacteriilor pot fi re-interpretate cu precauție în lumina posibilelor efecte de deshidratare.procedura lichidului ionic prezentată în această investigație este rapidă și reproductibilă, deoarece filtrele pentru specimene pot fi pregătite în avans., Deoarece lichidul ionic are o presiune foarte scăzută a vaporilor, un beneficiu suplimentar este acela că se evită Artefactele de uscare, cum ar fi contracția, încrețirea sau fisurarea care pot apărea în timpul observării SEM (Tabelul 1, fig. S3). În viitor, anticipăm dezvoltarea unei varietăți de tipuri diferite de acoperiri de filtrare pentru a îmbunătăți în continuare tehnicile SEM folosind colorarea lichidă ionică pentru specimene biologice din gama de dimensiuni nanometrice.
Leave a Reply