réactifs chimiques et anticorps
collection de venin d’abeille
Le venin a été recueilli à l’aide d’ouvrières ou de reines provenant de plusieurs populations différentes d’abeilles apidés., Des échantillons de venin prélevés sur des abeilles européennes (Apis mellifera) et des bourdons à queue chamois (Bombus terrestris audax) provenaient de Perth (Australie), Dublin (Irlande) et Londres (Angleterre). Le venin d’abeille a été recueilli auprès de 30 travailleurs de chacune des trois colonies différentes d’un rucher ou d’une ferme comme décrit. Le venin D’abeille D’Australie a été prélevé dans un rucher entretenu par le centre de recherche intégrative sur les abeilles (CIBER), situé à L’Université D’Australie Occidentale (UWA: -31.980151, 115.817919)., Le venin D’abeille D’Irlande a été recueilli dans une colonie dans un rucher du Trinity College de Dublin (53.343933, -6.254635), et les deux autres colonies dans des fermes près de Glasnevin (53.383245, -6.276333) et Blanchardstown (53.384220, -6.375979). Le venin D’abeille et de bourdon D’Angleterre a été collecté à la Royal Holloway University de Londres (51.425626, -0.562987). Le venin de Bourdon a été collecté auprès de 20 travailleurs de chacune des 2 colonies achetées dans le commerce, les bourdons à une seule reine de chacune de ces deux colonies étant utilisés pour la collecte du venin de bourdon reine., Des mélanges maîtres biologiques indépendants ont été préparés en gardant le venin de différentes colonies séparées, avec le venin de 312 abeilles collectées au total.
Le Venin glandulaire a été recueilli par dissection manuelle. Les abeilles ont été capturées près de l’entrée de la ruche pour les abeilles domestiques, ou directement de la colonie pour les bourdons, et anesthésiées avec du dioxyde de carbone et réfrigérées sur de la glace. L’appareil de piqûre a été disséqué de chaque individu; puis la glande à venin a été enlevée et placée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)., Les glandes ont été percées avec une aiguille Terumo (25 g × 5/8) et centrifugées (13 000 g, 10 min, 4 °C), et le surnageant recueilli, contenant du venin en suspension liquide. La concentration en protéines de chaque mélange maître a été quantifiée avec un test de protéines compatible avec les détergents (Bio-Rad), mesurant l’absorbance à 750 nm avec un Millennium Science BioTek PowerWave XS2 (logiciel Gen 5 1.11, Version 1.11.5). Chaque mélange maître a ensuite été aliquoté et stocké à -80 °C.,
lignées cellulaires et conditions de culture
toutes les lignées cellulaires ont été achetées à L’American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), à l’exception des cellules HEK293FT qui ont été achetées à Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australie), SUM149 et SUM159 qui ont été obtenues à partir D’Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA), et Chapel Hill et National Institutes of Health, respectivement. T11 et B. 15 sont des lignées cellulaires très bien caractérisées37,38.,
Les cellules ont été incubées à 37 °C et 5% de CO2 et complétées par 1% d’antibiotique–antimycotique. Des cellules HDFa (fibroblaste dermique humain adulte primaire normal) ont été cultivées dans le DMEM avec 10% de sérum foetal bovin (FBS). MCF 10a et MCF-12A (cellules épithéliales immortalisées mammaires humaines, non transformées) ont été maintenues dans le DMEM/F-12 avec des suppléments (5% de sérum de cheval fœtal, 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique, 10 µg/µL d’insuline, 100 ng/mL de toxine cholérique et 500 ng/mL d’hydrocortisone). Les cellules NIH/3T3 (fibroblastes embryonnaires murins) ont été maintenues dans le DMEM avec 10% de FBS., HEK293FT (human embryonic kidney 293 cells stably expressing the SV40 large T antigen) a été cultivé dans le DMEM avec 10% de FBS et des suppléments (1% de glutamine et 0,4 mg/mL G418 Geneticin, Gibco). MCF7 (human luminal a breast cancer) a été maintenu dans mem α Avec 10% de FBS et des suppléments (1% chacun de pyruvate de sodium, de bicarbonate de sodium et d’acides aminés non essentiels). T – 47D et ZR-75-1 (tous deux atteints d’un cancer du sein luminal a chez l’homme) ont été cultivés dans un RPMI avec 10% de FBS. MDA-MB-231 (Claudine humaine-cancer du sein faible) a été cultivé dans le DMEM avec 10% de FBS., SUM149 (cancer du sein de type basal humain) a été cultivé dans F-12 avec 10% de FBS. SUM159 (Claudine humaine-cancer du sein faible) a été cultivé dans F – 12 avec 5% de FBS et des suppléments (5 µg/mL d’insuline et 1 µg/mL d’hydrocortisone). MDA-MB – 453 (cancer du sein enrichi en HER2 humain) a été cultivé dans le DMEM avec 10% de FBS. SKBR3 (cancer du sein enrichi en HER2 humain) a été cultivé dans du RPMI avec 10% de FBS et 1% de pyruvate de sodium. p53-T11 (Claudine murine-faible cancer du sein) a été maintenu dans le milieu RPMI 1640 avec 10% de FBS. BRCA-B. 15 (cancer du sein de type basal murin) a été maintenu en milieu RPMI 1640 avec 10% de FBS.,
essais de viabilité cellulaire
la viabilité cellulaire a été déterminée par L’essai de viabilité cellulaire luminescente selon le protocole du fournisseur. Les cellules ont été plaquées dans des plaques de culture de 96 puits et incubées à 37 °C et 5% de CO2 pendant 24 h. Pour les essais dose–réponse, les milieux ont été jetés et remplacés par des milieux contenant des concentrations indiquées de venin d’abeille ou de peptide et mis en culture pendant 24 h., Pour la viabilité cellulaire sur 60 min, les cellules ont été traitées avec la CI50 de venin d’abeille ou de mélittine pour chaque lignée cellulaire pendant de courts intervalles de temps sur 1 h, et la viabilité a été déterminée immédiatement après le traitement. Pour déterminer la viabilité, les cellules ont été incubées avec le réactif CellTiter-Glo (CTG) 2.0 pendant 10 min. La viabilité cellulaire a été quantifiée en mesurant la luminescence à l’aide D’un lecteur Multilabel EnVision 2102 (PerkinElmer). Des expériences ont été menées dans des répliques biologiques (n = 3).,
Production d’un anticorps monoclonal primaire contre la mélittine
La production D’anticorps a été réalisée conformément aux protocoles approuvés par le Comité D’éthique animale de L’Institut Harry Perkins de recherche médicale. Des souris a/J femelles ont été immunisées avec du venin d’abeille recueilli en Australie. Les souris ont reçu des injections intrapéritonéales de 12 µg de venin dans L’Adjuvant complet de Freund (Difco), suivies d’une augmentation de L’Adjuvant incomplet de Freund le jour 29 et d’une augmentation aqueuse de PBS à 7 µg/souris le jour 49. Les souris ont été saignées au jour 60 et les sérums ont été testés par ELISA., Le meilleur répondant a été boosté avec 7 µg de venin d’abeille dans le PBS 4 jours avant la fusion. Les cellules de la rate ont été fusionnées avec des cellules de myélome Sp2/O selon des procédures normales82. Les surnageants contenant des anticorps ont été dépistés par ELISA. Le clone 3B9 d’Hybridoma a été sélectionné pour une étude plus approfondie. L’anticorps a été produit en cultivant les cellules d’hybridome dans des bioréacteurs en milieu sans sérum D’hybridome (Gibco). L’anticorps a été purifié par chromatographie de la protéine G-Sepharose. L’anticorps purifié a été dialysé dans le PBS (pH 7,3). L’anticorps est désormais appelé anticorps anti-mélittine (3B9).,
dosage Immunosorbant enzymatique (ELISA)
Les Venins et les peptides ont été plaqués dans des plaques de 96 puits à 5 µg / mL dans un tampon de carbonate et incubés à 4 °C pendant 24 h. Le liquide a été retiré et les plaques lavées trois fois dans une solution de 0,05% TWEEN-20 (« Tween-20,” Sigma-Aldrich) dans du PBS. Les anticorps primaires ont été ajoutés aux puits avec des dilutions 1: 2 à partir de 10 µg/mL dans le diluant (0,1% d’albumine sérique bovine (BSA) dans le PBS) et incubés pendant 1 h à température ambiante. Les anticorps primaires ont été enlevés et les plaques lavées trois fois en 0.,05% Tween-20 en PBS. L’anticorps secondaire polyclonal IgG γ-chain-specific de chèvre anti-souris a été ajouté aux puits (1:1000 dans le diluant) et incubé pendant 1 h à température ambiante. Les anticorps primaires ont été retirés et les plaques lavées trois fois dans 0,05% Tween-20 dans le PBS. Elisa-developing buffer, une solution d’eau purifiée contenant 10% d’acide citrique (pH 4,2), 2% D’ABTS et 0,1% D’H2O2, a été ajoutée aux puits, et les plaques ont été incubées dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 min., L’Absorbance a été enregistrée à 405 nm à l’aide du lecteur de plaque lumineuse VICTOR avec le logiciel Wallac 1420 Manager (PerkinElmer). Le témoin était l’anticorps IgG monoclonal de souris (28/00 8C1-6) qui réagit avec l’il-12 humain, appliqué au peptide de mélittine sur la plaque ELISA. Des expériences ont été menées dans des répliques biologiques (n = 3).
expériences de compétition d’anticorps anti-mélittine
des cellules HDFa et SUM159 ont été plaquées dans des plaques de culture de 96 puits et incubées à 37 °C et 5% de CO2 pendant 24 h., Les concentrations croissantes de l’anticorps anti-mélittine ont été incubées avec les concentrations CI50 de venin D’abeille ou de mélittine pour chaque lignée cellulaire pendant 1 h à température ambiante, puis ajoutées aux cellules pendant 24 h. La viabilité cellulaire a été déterminée comme décrit dans « tests de viabilité cellulaire”. Des expériences ont été menées dans des répliques biologiques (n = 3).
Western blot
Les cellules ont été plaquées sur des plaques à 6 puits à une densité de 300 000 cellules/puits et incubées à 37 °C et 5% de CO2 pendant 24 h., Des expériences de culture cellulaire ont été menées comme décrit, puis le protocole standard Western blot a été suivi comme décrit ici. Les cellules ont été lavées avec du PBS à froid et lysées avec un tampon de lyse de protéines à froid (2% de dodécylsulfate de sodium (SDS), 125 mmol/L de Tris-HCl, pH 6,8). Les échantillons ont été soniqués pendant 10 s à 10 mA, et les concentrations de protéines ont été quantifiées avec le dosage des protéines compatibles avec les détergents (Bio-Rad). Des quantités égales de protéines ont été mélangées avec un tampon de charge (tampon D’échantillon Laemmli, Bio-Rad) complété par l’agent réducteur dithiothréitol (DTT)., Les échantillons de protéines ont été dénaturés par ébullition à 95 °C pendant 5 min, chargés dans des gels préfabriqués mini-protéiques (Bio-Rad) et soumis à une électrophorèse à 100 V, puis transférés dans des membranes PVDF (Bio-Rad) avec le système de transfert Turbo Trans-Blot (Bio-Rad) pendant 7 min. Les Membranes ont été incubées avec du TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl et 0,1% Tween-20) avec 5% de lait non gras pour bloquer la liaison non spécifique. Les Membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 °C avec les anticorps primaires dilués dans 3% de BSA et 0,02% d’azoture de sodium., Le signal a été détecté avec Luminata Crescendo Western HRP substrat (Millipore) avec le ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) en cours D’exécution Image Lab logiciel (Bio-Rad, Version 6). Les Western blots ont été dérivés de la même expérience et traités en parallèle. Des scans non coupés des Western blots sont fournis dans des figues supplémentaires. 10–15.
cytométrie en flux
L’apoptose et la nécrose ont été évaluées à l’aide du kit de détection D’apoptose I de L’annexine V-FITC (BD Biosciences) conformément au Protocole du fabricant. Les cellules SUM159 ont été plaquées dans des plaques de culture à 6 puits pendant 24 h., Les milieux ont ensuite été jetés et remplacés par des milieux contenant du venin d’abeille ou de la mélittine (concentrations de CI50) et mis en culture pendant 60 min. Les cellules ont été collectées avec de la trypsine et des milieux, et centrifugées (1000g, 5 min, 24 °C), lavées avec du PBS froid, centrifugées (1000g, 5 min, 24 °C) et remises en suspension dans un tampon de liaison 1×. Les cellules ont été préparées à une concentration de 1 million de cellules/mL dans un tampon de liaison 1×. Les échantillons ont été incubés avec FITC et PI (5 µL de chacun) dans l’obscurité pendant 15 min., La présence de cellules vivantes, mortes, apoptotiques ou nécrotiques a été évaluée avec le Cytomètre BD Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, USA) avec le logiciel BD Accuri C6, et analysée avec FlowJo™ (Ashland, USA, Windows Version 7). Des expériences ont été menées dans des répliques biologiques (n = 3). Les stratégies de déclenchement sont présentées dans la Fig. 16.
microscopie à cellules vivantes
Les cellules SKBR3 ont été plaquées dans un plat à micro-ondes à fond de verre (10 × 35 mm, MatTek) et incubées pendant 24 h., Le micro-ondes a été laissé à l’équilibre dans une chambre d’incubation supérieure du microscope confocal NIKON Eclipse Ti (37 °C et 5% de CO2) pendant 20 min. L’objectif 20× a été utilisé avec L’alignement de Kohler, et les images ont été prises toutes les minutes de 10 min avant à 1 h après le traitement avec L’IC50 du venin d’abeille recueilli en Australie., Les auteurs reconnaissent les installations et l’assistance scientifique et technique offertes par le National Imaging Facility, une capacité de la National Collaborative Research Infrastructure Strategy (NCRIS), ainsi que l’Australian Microscopy & Microanalysis Research Facility, tous deux au Centre for Microscopy, Characterization and Analysis (CMCA), UWA, une installation financée par L’université, les gouvernements des États et du Commonwealth.,
microscopie électronique à balayage
Les lamelles de verre (Diamètre 12 mm, Menzel, Thermo Fisher Scientific) ont été recouvertes d’hydrobromure de poly-L-lysine (Sigma-Aldrich) pendant 20 min, puis lavées deux fois avec de l’eau purifiée. Les cellules SUM159 ont été plaquées sur les lames de verre à une densité de 62 500 cellules / puits et incubées à 37 °C et 5% de CO2 pendant 24 h. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, puis traitées avec des concentrations de venin D’abeille et de mélittine de véhicule ou IC50 pendant 1 h., Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, puis fixées avec 4% de formaldéhyde dans du PBS pendant 25 min, puis lavées à nouveau trois fois avec du PBS. En préparation à la microscopie, les échantillons ont été immergés dans 2,5% de glutaraldéhyde et incubés à 4 °C pendant 2 h. Les échantillons ont été lavés avec de l’eau désionisée et immergés dans des concentrations croissantes d’éthanol (50%, 70%, 95%, 100%, et puis 100% d’éthanol « sec » absolu). Entre chaque immersion, les échantillons ont été déshydratés dans un micro-ondes spécialisé (PELCO, BioWave 34700 Laboratory Microwave System)., Le processus de déshydratation a été complété avec un appareil de séchage à point critique E3000 pour remplacer l’éthanol dans l’échantillon par du CO2 supercritique. Les lamelles traitées ont été montées sur des supports SEM (ProSciTech) avec des languettes en carbone. Les échantillons ont été recouverts de platine 3 nm pour les rendre électroniquement conducteurs avant d’être visualisés au microscope électronique à balayage (Zeiss 1555 VP-FESEM) au CMCA, UWA. Les Images ont été prises avec le détecteur intégré à l’objectif à une distance de travail de 2,6 mm, une ouverture de 30 µm et une tension d’accélération de 5 kV., Les Images ont été analysées avec le logiciel D’analyse D’images FIJI (ImageJ)83.
Immunofluorescence
des lamelles de verre (Diamètre 12 mm, Menzel, Thermo Fisher Scientific) ont été placées dans des plaques de 24 puits et recouvertes de poly-L-lysine (Sigma-Aldrich) pendant 20 min, puis lavées deux fois avec de l’eau purifiée. Les cellules SUM159 ont été plaquées sur les lames de verre et incubées à 37 °C et 5% de CO2 pendant 24 h. Les cellules ont été traitées pendant 30 min avec le véhicule, ou la CI50 du venin d’abeille, la mélittine, la RGD1-mélittine, et la concentration molaire équivalente à la mélittine pour la DÉDE-mélittine., Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, puis fixées avec 4% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 25 min, puis lavées à nouveau trois fois avec du PBS. La liaison aux anticorps non spécifiques a été bloquée à l’aide de sérum de chèvre Normal à 5% (Thermo Fisher Scientific) dans le PBS pendant 1 h à température ambiante. Des anticorps primaires ont été ajoutés aux cellules, y compris l’anticorps monoclonal anti-mélittine (5 µg/mL) et 1:500 d’anti-EGFR (Abcam). Les échantillons ont été incubés avec un léger balancement à 4 °C pendant la nuit., Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS, puis incubées avec 1:500 D’anticorps secondaire Alexa Fluor 488 goat anti-mouse, 1:500 D’anticorps secondaire Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit, et Hoechst (1:5000) dans du PBS à température ambiante pendant 1 h. Les échantillons ont été lavés trois fois avec du PBS et montés sur des lamelles en verre avec un agent de montage AntiFade Diamond SlowFade (Thermo Fisher Scientific). Les diapositives ont été imagées à l’aide du microscope inversé à fluorescence confocale Nikon Ti-E. Les Images ont été prises à l’aide d’un objectif 20× air (NA 0.,75), et l’excitation séquentielle en utilisant des longueurs d’onde de 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (Alexa Fluor 488 anticorps secondaire), et 561 nm (Alexa Fluor 594 anticorps secondaire). Les Images ont été collectées à l’aide du logiciel Nis-C Elements et traitées à L’aide de FIJI (ImageJ) au CMCA83.
transfert D’énergie par résonance de bioluminescence (BRET)
les interactions récepteur–ligand ont été évaluées avec BRET, en utilisant une méthode similaire à celle décrite antérieurement84,85., BRET implique le transfert non radiatif d’énergie (dipôle–dipôle) entre deux protéines ou molécules d’intérêt marquées avec une luciférase donneuse ou un fluorophore accepteur après oxydation du substrat par la luciférase et émission subséquente de lumière54. Les étiquettes FITC ont été conjuguées à L’extrémité N de la mélittine (FITC-melittin) et de la DÉDE-mélittine (FITC–DÉDE-melittin). Les cellules HEK293 exprimant de manière stable le grand antigène T SV40 (HEK293FT) ont été plaquées sur des plaques à 6 puits à une densité de 550 000 cellules/puits pendant 24 h., Les cellules HEK293FT ont été transfectées avec des plasmides contenant de l’ADNc pour le NanoLuc-EGFR à L’aide de Fugène. Brièvement, l’ADNc plasmidique a été incubé pendant 10 min à température ambiante avec un mélange de réactif de transfection et de DMEM sans sérum dans un rapport de 10 ng/µL NanoLuc-EGFR: 4 µL de Fugène: 100 µL de SFM. Le mélange a été ajouté aux cellules HEK293FT à une concentration finale de 10 ng / µL NanoLuc-EGFR par puits de la plaque de 6 puits, et les cellules incubées pendant 24 h. Les cellules ont été lavées avec du PBS et Détachées avec de la trypsine, puis recueillies dans un milieu contenant 5% de sérum de veau fœtal dans du DMEM sans phénol rouge. , Les cellules ont été plaquées à 50 000 cellules/puits dans des plaques blanches à 96 puits revêtues de poly-L-lysine et incubées pendant 24 h. Pour les tests de saturation et de BRET cinétique, deux filtres ont été utilisés pour mesurer simultanément la luminescence à courte et longue longueur d’onde correspondant aux longueurs d’onde d’émission des molécules donneuses et acceptrices, respectivement.
pour des expériences de cinétique d’association de ligands en temps réel, le milieu a été retiré des cellules, qui ont ensuite été incubées avec 50 µL/puits du substrat nanoluc furimazine jusqu’à une concentration finale de 10 µM diluée dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS)., Les cellules ont ensuite été équilibrées dans le lecteur de plaques CLARIOstar (BMG Labtech, Australie) pendant 5 min pour enregistrer les lectures basales. Les ligands (TAMRA-EGF, FITC-melittin, et FITC–DEDE-melittin) ont ensuite été ajoutés à une gamme de concentrations finales correctes, et des enregistrements NanoBRET pris toutes les 90 s pendant 60 min à 37 °C. Pour les expériences de saturation, le milieu a été retiré des cellules, et une gamme de concentrations de TAMRA-EGF, FITC-melittin, et FITC–DEDE-melittin ajouté en présence ou 37 °C pendant 60 Min dans L’obscurité., La Furimazine a été ajoutée à une concentration finale de 10 µM. Les enregistrements ont été réalisés à L’aide du LUMIstar Omega (BMG Labtech, Australie). Les données sont présentées comme le « rapport de BRET brut », dérivé du rapport de l’émission à longue longueur d’onde (accepteur) sur l’émission à courte longueur d’onde (donneur). Des expériences ont été menées dans des répliques biologiques (n = 3).
analyse des effets combinés du médicament
Le Venin D’abeille ou la mélittine a été associé au docétaxel et administré aux concentrations indiquées dans un rapport non constant dans les cellules T11 pendant 24 h., La viabilité cellulaire a été évaluée à L’aide de CellTiter-Glo comme mentionné précédemment. L’effet combiné du venin d’abeille ou de la mélittine avec le docétaxel a été évalué par la méthode dose-effet médiane à l’aide du logiciel CompuSyn (ComboSyn). Cette méthode détermine un CI basé sur l’effet d’une combinaison entre deux agents (où CI < 1 est synergique, CI > 1 est antagoniste et CI = 1 est additif)56. Des expériences ont été menées dans des répliques biologiques (n = 3).,
modèle Animal et traitements
ces expériences animales ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité D’éthique animale de L’UWA. Pour simuler un modèle avancé de cancer du sein à faible teneur en Claudine, 2,5 × 105 cellules T11 ont été suspendues dans un milieu sans sérum et dans une matrice BD Matrigel à forte Concentration (BD Bioscience) dans un rapport de 1:1 à un volume total de 100 µL et injectées par voie sous-cutanée dans les flancs de femelles BALB/cJ âgées de 5 semaines (Animal Resources Centre, WA, Australie) à l’aide d’une aiguille de 26 g., Les cellules T11 utilisées ont été transduites lentiviralement avec la construction zsgreen-luciférase et triées trois fois pour obtenir un enrichissement supérieur à 99% des cellules luciférases positives. La mélittine a été mise en suspension dans de L’eau Milli-Q + 5% de dextrose. Le docétaxel (en poudre) a été mis en suspension dans 25% TWEEN 80 (Sigma-Aldrich) et 75% d’un mélange de solution 15,25:84,75 (v/v) d’éthanol absolu et d’eau purifiée et maintenu à -20 °C. immédiatement avant les traitements, le docétaxel a été fraîchement dilué dans de L’eau Milli-Q + 5% de dextrose à la concentration finale requise., Trois jours après la génération de tumeurs T11 (~50 mm3), les souris ont été randomisées en 4 groupes (n = 12 souris/groupe). Les traitements ont été injectés par voie intratumorale les jours 3, 5, 7, 9, 11, 13, et 15 post inoculation de cellules T11, avec véhicule, mélittine (5 mg/kg), docétaxel (7 mg/kg), ou une combinaison de mélittine (5 mg/kg) et docétaxel (7 mg/kg). Les animaux ont été surveillés pour la taille de la tumeur tous les 2 jours, et les volumes calculés par la formule ellipsoïde modifiée (volume = width2 × length/2). Les animaux ont été sacrifiés humainement lorsque les tumeurs ont atteint 800 mm3.,
analyse immunohistochimique des tumeurs
Les tissus tumoraux ont été fixés dans 4% de paraformaldéhyde, lavés trois fois dans du PBS et laissés dans 70% d’éthanol. Les tumeurs ont été incorporées dans de la paraffine et des sections de 5 µm ont été préparées. Pour la coloration à l’hématoxyline / éosine, les lames ont été déshydratées, hydratées à l’aide d’une banque de solution Décroissante d’éthanol, colorées à l’hématoxyline de Gill, déshydratées à l’aide d’éthanol à 70%, colorées à l’éosine, déshydratées à l’aide d’éthanol à 100%, nettoyées à l’aide de toluène et montées dans des lamelles, L’apoptose des cellules tumorales a été déterminée dans des coupes tissulaires par analyse TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche).
imagerie par Bioluminescence
pour suivre avec précision les changements dans la croissance tumorale in vivo avec les traitements, nous avons effectué une analyse de bioluminescence à l’aide du système D’imagerie Caliper IVIS Lumina II au CMCA, UWA. Les analyses ont été effectuées tous les 2 jours après la génération de tumeurs. Des souris ont été injectées par voie intrapéritonéale avec 200 µL de D-luciférine (Cayman Chemical) à la concentration finale de 150 mg/kg dissous dans le PBS avant d’être anesthésiées à 4% d’isoflurane., Une fois anesthésiées, les souris ont été placées à l’intérieur de la chambre préchauffée de l’imageur de bioluminescence et imagées 7-12 min après l’injection, sous 2% d’isoflurane, jusqu’à ce que l’intensité du signal de bioluminescence ait atteint un État d’équilibre.
analyse statistique
toutes les données ont été tirées de plusieurs expériences menées au moins en trois exemplaires. Des analyses statistiques ont été effectuées avec GraphPad Prism v8 (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft) et Logiciel D’analyse prédictive SPSS (IBM, Version 26)., Pour les essais de viabilité cellulaire, les données ont été normalisées à la luminescence moyenne de l’état du véhicule, considérée comme viable à 100%, avec les IC50 dérivées dans le prisme GraphPad. Pour l’immunohistochimie dans les tumeurs T11 traitées pour détecter p-HER2 (Tyr1248) et p-EGFR (Tyr1068), véhicule a été normalisé à 100%., Le cas échéant et comme indiqué dans le texte principal, la signification statistique a été déterminée à l’aide de tests T de Student à deux queues non appariés, D’ANOVA unidirectionnelle non appariée avec le test post hoc HSD de Tukey corrigeant pour des comparaisons multiples, D’ANOVA à deux voies avec des mesures répétées suivies du test de comparaison multiple de Sidak ou Pour tous les essais, les différences ont été considérées significatives à p < 0.05 (*), p < 0.01 ( * * ) et p < 0.001 (***).,
Résumé du rapport
de plus amples renseignements sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé du rapport de recherche sur la Nature lié à cet article.
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