scanning electron microscope mikrobiologian ja diagnoosi tartuntatauti

tuottaa sähköä johtava pinta SEM, biologisia näytteitä ovat usein päällystetty käyttämällä ohut kalvo, haihtuminen tai katodipölyynnystä hiiltä tai metallia tyhjiössä päällystysterät, joka vaatii ennen kuivumista näytteen. Tämä pinnoite prosessi voi hämärtää hieno ultraääni yksityiskohtia, riippuen paksuus kerros talletettu (yleensä 2-20 nm)., Nämä perinteiset menettelyt on vaikea suorittaa tyypillisiä mikrobiologiset näytteet, jotka ovat yleensä keskeytykset pieniä biologisia hiukkasia vedessä (<100 nm useimmat virukset, tai osa-mikrometrin kokoluokassa monet bakteerit, sienet ja loiset). Lisäksi ongelmana on, että mikrobit kiinnostusta potilaan yksilöihin tai ympäristöön näytteet voivat olla läsnä suhteellisen pieninä pitoisuuksina, joten havainto heistä pinnalla vaikeaa.,

tässä raportissa kuvataan menetelmiä keskittyen mikrobien keskeytykset SEM havainto siitä, pre-päällystetty suodatin alustoille. Me osoittavat, että, sen sijaan, että pauke pinnoite, ionisen nesteen (1-butyyli-3-methylimidazolium tetrafluoroborate), laimennettiin vedellä voidaan käyttää nopeasti soluttautua mikrobiologinen SEM-näyte, muodostaen elektroni-lucent johtava pinta, joka estää näytteen latauksen ja antaa hyviä tuloksia mikrobien näytteet (Kuva. 1)., Ioniset nesteet ovat erittäin johtava suoloja, jotka pysyvät nestemäisessä olomuodossa huoneenlämmössä ja on merkityksetön höyrynpaine (≤5 × 10-9 Torr). Alle korkea tyhjiö ehtoja moderni SEM (≤1 × 10-6 Torr) ioniset nesteet pysyy nestemäisessä tilassa ja ei haihdu käytön aikana, mutta silti conductive19,20,21,22,23. Hyödyllisin ioniset nesteet sovellukset biologisten SEM on sähkönjohtavuus noin 100 mScm−1, ovat sähkökemiallisesti vakaa (ottaa sähkökemiallinen ikkuna noin 5,8 V), samoin kuin on vesiliukoinen ja helposti synthesised24., Ionisia nesteitä, joilla nämä ominaisuudet ovat olleet aiemmin osoittaneet, antaa SEM-kuva kontrasti verrattavissa käyttö metalli-ja hiili pinnoite kun käytetään eristävä specimens19,25. He ovat myös olleet käytetyt varten makroskooppinen kuvantaminen biologisia näytteitä, kuten merilevä -, kudos-viljellyt solut ja tiivistetty chromosomes20,21,22. Johtava substraattien, kuten indium-tina-oksidi -, alumiini-folio, tai metallista päällystetty coverslips on käytetty estämään charging20, kuitenkin, nämä materiaalit eivät sovellu suodattamalla SEM-tutkimusten mikrobeja., Huomasimme, että parhaan tuloksen käyttämällä ionisen nesteen kanssa subsellulaarisia esineitä, kuten virusten tai bakteerien flagellae, ennen pinnoite polykarbonaatti suodattimet alumiini tai kulta oli tarpeen. Meillä ei havaita näyte drift käytettäessä ionista nestettä värjätään biologisia näytteitä, koska ne olivat hyvin tuettu suorittaa kalvo käytetään alkuperäisen suodatus prosessi. SPI-pore polykarbonaatti suodattimet ovat hydrofiilisiä ja pysyy niin sen jälkeen metalli pinnoite, mikä tekee niistä ihanteellisen alustan kanssa sammutettua biologisia näytteitä., Ioninen neste värjäys voidaan suorittaa myös sisällä biologista turvallisuutta kaappiin, joka tarjoaa nopea ja turvallinen vaihtoehto pauke pinnoite työskenneltäessä tarttuva näytteitä, koska tyhjiö pinnoite laitteet voivat aiheuttaa aerosolien ja ei ole helposti contained20,21,22. Meillä on tyylikkäästi ratkaista ongelman keskittämällä näyte ja estää latauksen, metalli-pinnoite suodattimen substraatin itse ennen hakemista biologinen näyte (Kuva. 2). Näytteiden ohutkalvopinnoituksen puuttuessa vaadittiin myös tunkeutumista ioninesteisiin latauksen välttämiseksi., Tulokset ovat verrattavissa käyttää SEM kanssa pauke pinnoite ja TEM käyttäen negatiivinen värjäys tekniikka (Kuvat 1 ja 2: Täydentävä Viikunat S1–S5). Ultrasuodatus on tärkeä askel, sillä se auttaa poistamaan roskia, jotka voivat hämärtää biologisissa näytteissä esiintyvien virusten tai bakteerien yksityiskohtia. Nykyisessä raportissa, osoitamme selvää, kuvantaminen virusten ja bakteerien flagellae vuonna päällystämätön SEM-näytteet, jotka aiemmin edellytti nestehukka ja pauke pinnoite saavuttaa, mikä laajentaa tarkkuus ja valikoima mikrobien näytteitä, joka voi olla tutkittu SEM.,

Vertailu perinteisen pauke pinnoite SEM-näytteen valmistus menetelmät (paneelit vasemmalla puolella), jossa ioninen neste hoito (centre paneelit) ja perinteisen TEM (paneelit oikealla puolella) havainnointiin mikrobeja: (a) Leptospira biflexa, (b) Salmonella Senftenberg, (c) vaccinia-ja (d) Ebola-virus. Vasemmanpuoleisissa paneeleissa olevat SEM-kuvat olivat kullalla päällystetyistä näytteistä, jotka oli päällystetty pelkillä päällystämättömillä suodattimilla., Kuvat centre paneelit olivat yksilöitä hoidettiin ionisen nesteen jälkeen laskeuma pre-päällystetty alumiini suodattimet. Oikealla puolella TEM-kuvat samankaltaisista näytteistä, jotka on valmistettu metyyliamiini tungstate – negatiivisella värjäyksellä.

Valmistelu biologisten näytteiden SEM.

a) suodatinyksikön komponentit esitetään ennen asennusta., Inset SEM-kuvassa on kullalla päällystetty suodatin korkealla suurennoksella ennen näytteen levittämistä. Huomaa, että suodatin on puhdas ja huokoset ovat selvästi nähtävissä. (B) suodatinyksikkö näkyy asennuksen jälkeen ja käytettäessä ruiskupumppua bioturvallisuuskaapissa (c,d). D-kirjaimen sininen nuoli osoittaa suodatinyksikköön. E) kuvat suodattimista, joiden päällä on haihtunut metallia. AL: n paksuus on 18 nm ja 9 nm ja Au on 27 nm ja 9 nm paksu. Molempien metallien suodattimessa AL: n ja Au: n paksuus on vastaavasti 18 nm ja 27 nm., (f) SEM ja (g) vastaava alkuaine kartta syntyy X-ray microanalysis alueen samanlainen esiin pilkullinen suorakulmio (e). (s–k) SEM-kuvia Salmonella värjätään ioninen neste, joka kuvaa vaikutus eri metalli tyypit ja paksuus metallin haihtunut lopullinen tallennetut kuvat (s Al 9 nm, i Au 9 nm, j Al 18 nm, k Au 27 nm). Punaiset nuolet viittaavat flagellaeen.

kuvia bakteerit värjätään ioninen neste oli tasaisempi pinta topografia kuin ne, jotka olivat kuivattu ja sputteroitiin., Kokomittausten mukaan kuivuneet yksilöt kutistuivat noin 10-20 prosenttia (Taulukko 1). Tulkitsemme pinta perusteellisesti kuivattu, sputteroitiin bakteerit, kuten rypistymistä soluseinän kutistumisen sijaan havainto lisää ominaisuuksia, jotka ovat läsnä in vivo: nämä rypyt ovat siten todennäköisesti esineitä, koska kuivaus. Bakteeri flagellae olivat myös selvästi näkyvissä ioninen neste kohtelu suorittaa substraattien (Fig. 1, Täydentävä Kuva. S3). Tulokset olivat verrattavissa sem-sputter-pinnoitteella ja TEM-negatiivisella värjäyksellä havaittuihin tuloksiin.,

Ionic liquid tekniikoita voidaan myös käyttää turvallisesti tarttuva taudinaiheuttajia, biologisesti sisälsi SEM-kotelo, jonka luonnehdinta romaanin tartunnanaiheuttajien kunnossa lähempänä heidän sammutettua ”luonnontilassa” kuin tavanomaisilla näytteen valmistelu techniques8. Tapauksessa tämän tutkimuksen perinteisiin pöytäkirjan mukana dehydraatio etanolissa sarja, jonka jälkeen ilma kuivaus ja metalli pinnoite ennen SEM-kuvantamisessa., Ioninesteprotokollassa biologisessa näytteessä oli pisara 1-butyyli-3-metyyli-imidatsoliumtetrafluoriboraattia, joka oli sijoitettu suoraan siihen. Ylimääräisen nesteen poistoon tarkoitetun blottauksen jälkeen märkä näyte laitettiin suoraan SEM: ään. Tarttuvien näytteiden käsittelyssä tarvitaan tavanomaiseen menettelyyn ylimääräinen aldehydin kiinnitysvaihe, jotta vältetään tarttuvien aerosolien riski, joka voi syntyä sputteripinnoitusprosessin aikana., Tämä korjaus vaihe ei ole pakollinen, jossa ioninen neste tekniikka, koska näyte voidaan käsitellä biologinen eristäminen huppu ja sitten sijoittaa suoraan SEM-biologisesti sisälsi SEM enclosure8, kuvantaminen on korjaamatta, sammutettua valtio, joka on paljon lähempänä natiivi valtion organismin. Mikroskopia täydentää perinteisiä diagnostisia testejä, jotka voivat neiti romaani tai variantti strains3,26,27,28 ja voi nopeasti tunnistaa tyypin organismin hetkellä ohjaavat valintaa enemmän erityisiä tests29., Elektronimikroskopia vaatii kuitenkin yleensä pienhiukkaspitoisuuden, jotta mikrobit voidaan tunnistaa luotettavasti. Virusten osalta tämä on 105-106 virushiukkasta/mL4,5. Suodatustekniikoilla sekä TEM-että SEM-viruksia voidaan tehdä jopa 5000 hiukkasella7.

Ioninen neste värjäys pre-päällystetty suodattimet on laajasti sovellettavissa mihin tahansa biologinen näyte, joka voi hyötyä suodatus keskittyä hiukkasia kiinnostusta., Käyttö metalli päällystetty suodattimet, joissa on enemmän kuin yksi tyyppi pinnoite eri alueilla, jonka avulla valitaan, kumpi näistä päällysteet antaa optimaalisen tuloksia tarkkailemalla tietyn mallin tai erityisiä ominaisuuksia ja auttaa säästää aikaa (Fig. 2 A, e-k). Esimerkiksi, kun ioninen neste värjäys bakteeri flagellae ilmestyi kirkkaampi vastaan Al-päällystetyn substraatin päälle, kun taas Au-päällystetty alue suodatin kontrasti on päinvastainen ja flagellae ilmestyi tummempia (Kuva. 2h-k)., Samoin kuvia Ebola-virus ja Leptospira biflexa osoitti hyvää laatua topografisia yksityiskohtia, kun kuvaamisen kanssa alumiini päällystetty suodatin, mutta biologinen materiaali oli vähemmän yksityiskohtia ja ilmestyi tumma tasainen siluetti, kun kuvaamisen kulta-päällystetty suodattimet (Täydentävä Viikunat S4 ja S5). Ehdotamme, että tämä johtuu siitä, että keskiasteen electron emission signaalin Au verrattuna Al. Tässä tutkimuksessa keräsimme SEM-kuvia toissijainen electron-ilmaisin, joka on yleisimmin käytetty rutiininomainen kuvantaminen biologisia näytteitä., SEM, toissijainen electron päästöjen kerroin (δ) on suhteellisen vakio riippumatta siitä, atomi numero. Poikkeuksena on kuitenkin AU, jolle δ on lähes kaksinkertainen Aliin ja moniin muihin alkuaineisiin verrattuna. Arvo δ on myös vaikuttaa säteen energia: 20 kV, δ on 0,1 Al ja 0,2 Au30. Mittaamalla intensiteetti toissijainen electron kuvat otettu 4 kV sekä Al ja Au samassa kuvassa (Fig. 2f), me laskea signaalin Au olevan 2,1 kertaa intensiteetti Al, joka on lähellä, että odotettavissa teoriassa., Kanssa tallennetut kuvat yksilöiden gold päällystetty suodattimet, tulkitsemme tuloksia kuin tuottaa liian paljon kontrastia taustasta alustan, joka yleensä hämärtää hienoja yksityiskohtia, kuten flagellae, jotka näyttävät kuin ”siluetteja” kirkas tausta. Kuitenkin, ioninen neste soluttautunut mikrobit ja alumiini päällystetty suodatin, on vastaavia päästöjen kertoimet, jolloin kontrasti on suurelta osin topografia sijaan erot koostumuksesta, jolloin enemmän hienoja yksityiskohtia nähtäväksi.,

suodattimien esipinnoitus metallilla ei vaikuttanut huokoskokoihin eikä suodattimien suodatuskapasiteettiin (Kuva. 2). Koko ioninen neste värjäyksen protokolla voidaan suorittaa standardi laboratorio penkki noin 15 minuuttia ja sopii sisällä bioturvallisuutta kaappi (Kuva. 2C, d). Vuonna pauke pinnoite SEM, liian ohut kerros aiheuttaa huono johtuminen ja latauksen, kun taas liian paksu kerros peittää hienoja yksityiskohtia., Paksuus on käyttää pre-pinnoite substraatteja, voi olla paljon suurempi kuin sputter pinnoitteet tyypillisesti käytetään biologisia näytteitä, varmistaa hyvä johtavuus, niin kauan kuin suodatin huokoset eivät ole tukossa. (Kuva. 2e-k, täydentävä Kuva. S2).

tässä tutkimuksessa käytimme pinnoitteet 18 ja 27 nm ja Al Au vastaavasti, koska nämä vahvuuksina todettiin olevan riittävä estämään lataus, verrattuna päällystämätön suodattimet (Supplementary Fig. S2). Alustat, joilla oli nämä vähimmäispaksuudet, oli helppo valita, koska ne olivat näkyvissä kiiltävänä metallipinnoituksena., Kun pinnoitteet alle 27 nm Au tai 18 nm Al olivat läsnä, ne oli läpinäkymätön tai taulu-valkoinen ulkonäkö (Kuva. 2). Kanssa ionic liquid värjäystä käyttämällä näitä metalli-päällystetty suodattimet, meillä oli mahdollisuus visualisoida hyvin rakenteellisia yksityiskohtia bakteerit, kuten flagellae Salmonella, jotka ovat 20 nm halkaisijaltaan, SEM (Fig. 2j, k, täydentävä Kuva. S3).,

saatujen tulosten kanssa suodatus ja yksinkertainen ionisen nesteen tunkeutuminen varten SEM ovat hyvin vertailukelpoisia laatu kuin tavanomainen pauke pinnoite SEM ja negatiivinen värjäytyminen TEM erilaisia bakteeri-ja virusperäisen yksilöitä, mukaan lukien Leptospira, Salmonella, vaccinia-virus ja Ebola-virus (Kuva. 1, Täydentävä Kuva. S3-S5) 7,16,31,32. Huomasimme, että siellä oli paljon vähemmän kutistuminen ioninen neste soluttautunut bakteerit ja virukset verrattuna sekä kuivattu sputteroitiin SEM valmisteet ja TEM negatiivinen värjätään kuvia (Taulukko 1)., Kaikissa tapauksissa mitat kuivattu SEM pauke-pinnoitettu ja negatiivinen-petsattu TEM mikrobit olivat 9,9% 18,9% pienempi kuin ioninen neste kohdella yksilöitä (Taulukko 1). Aiemmassa tutkimuksessa olemme kuvaamisen frozen-lasitetut Ebola-viruksen kryo-elektronimikroskopia halkaisija Ebola-virus mitattiin 96-98 nm16, joka on hyvin samanlainen arvo 98,5 ± 10.2 nm halkaisija on mitattu samaa näytettä käsitelty ionic liquid tässä tutkimuksessa., Tämä edelleen osoittaa, että määrä ioninen neste soluttautunut näytteet ovat verrattavissa mitattu alle jäädytetty sammutettua ehtoja ja tarkasti heijastaa täysin sammutettua native valtion Ebola-virus. Sillä bacilliform rakenne, 10 prosentin alennus mitat vastaa 27% tilavuuden pieneneminen johtuu nestehukka, vaikka romahdus ja madaltumista lieriön muotoinen merkitsisi vielä suurempaa veden menetystä., On selvää, että tämä litistyminen ja romahtaminen johtuu nestehukka on läsnä jossain määrin kaikissa kuvia sputter päällystetty viruksia ja bakteereja (Kuva. 1).

vaikka kuvat näyttävät suhteellisen samanlaisilta, näyttää kultaputteripinnoite antavan hieman enemmän kontrastia kuin ionineste. Toinen havaittavissa oleva ero on vähemmän pinnan karheus bakteerisoluseinät ioni neste värjätään kuvia. Tämä näkyy salmonellan kuvissa (Kuva. 1, Täydentävä Kuva. S3)., Nämä kuvat on selkeä kuvioitu ja ryppyinen ulkonäkö pinnalla sputteroitiin bakteeri-soluja ja sileä ulkonäkö solun seinät ioninen neste soluttautunut valmisteet. Ehdotamme, että tämä havaittu ero on pitkälti seurausta menetys solujen turgor, koska nestehukka ja tilavuus tappio pauke-pinnoitettu yksilöitä ja siten ryppyjä voi itse asiassa olla esine tai ominaisuus, joka on korostunut nestehukka., Todisteet tälle tulee siitä, että muita hienoja rakenteita, kuten flagellae, ovat selvästi näkyvissä (ja samanlainen ulkonäkö) sekä pauke-pinnoitettu ja ionisen nesteen kohdella yksilöitä. Aiempien bakteerien sputteripinnoituksella tehtyjen tutkimusten tuloksia on siis ehkä tulkittava varovaisesti uudelleen mahdollisten nestehukka-vaikutusten valossa.

ioninen neste menettely esitetään tässä tutkimuksessa on nopea ja toistettavissa, koska näyte suodattimet voidaan valmistaa etukäteen., Kun ioninen neste on hyvin matala höyrynpaine, lisäetuna on se, että kuivaus esineitä, kuten kutistuminen, ryppyjä tai halkeamia, jotka voivat esiintyä SEM havainto on välttää (Taulukko 1, Täydentävä Kuva. S3). Tulevaisuudessa odotamme kehittää erilaisia suodatin pinnoitteet parantaa SEM-tekniikoita käyttäen ioninen neste värjäys biologisten mallien kerrostuneen koko alue.