Kemialliset reagenssit ja vasta-aineet
Bee venom-kokoelma
venom on kerätty käyttäen työntekijöiden tai queens useista eri populaatioiden Apid mehiläisiä., Myrkky näytteitä kerätään Euroopan mehiläisten (Apis mellifera) ja buff-tailed kimalaisia (Bombus terrestris audax) peräisin Perth (Australia), Dublin (Irlanti), ja Lontoossa (Englannissa). Mehiläisten myrkkyä kerättiin 30 työntekijältä kustakin kolmesta eri pesäkkeestä mehiläistarhasta tai maatilalta kuvatulla tavalla. Mehiläinen myrkky alkaen Australia oli kerätty mehiläispesä ylläpitää Centre for Integrative Bee Research (CIBER), joka sijaitsee University of Western Australia (UWA: -31.980151, 115.817919)., Mehiläinen myrkky Irlannista oli kerätty yksi siirtomaa klo mehiläispesä at Trinity College Dublin (53.343933, -6.254635), ja muut kaksi siirtomaita tilojen lähellä Helsinki (53.383245, -6.276333) ja Blanchardstown (53.384220, -6.375979). Honeybee ja kimalainen myrkky Englannista kerättiin Lontoon Royal Hollowayn yliopistossa (51.425626, -0.562987). Mehiläinen myrkky oli kerätty 20 työntekijää kustakin 2 kaupallisesti ostaa siirtomaita, single-kuningatar kimalaisia kustakin näistä kahdesta siirtokuntia, joita käytetään kokoelma kuningatar mehiläinen myrkky., Riippumaton biologinen master-seokset valmistettiin pitämällä myrkky eri siirtomaita erillinen, myrkky 312 mehiläiset keränneet yhteensä.
Rauhasmyrkky kerättiin käsin dissektiolla. Mehiläiset olivat vangiksi lähellä sisäänkäynnin pesää mehiläisiä, tai suoraan siirtomaa kimalaisia, ja nukutettuna kanssa hiilidioksidia ja jäähdytetty jäillä. Pistinlaite leikeltiin jokaisesta yksilöstä; sitten myrkkyrauhanen poistettiin ja sijoitettiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS)., Rauhaset olivat lävistetty Terumo Neula (25 G × 5/8) ja sentrifugoidaan (13,000 g, 10 min, 4 °C) ja supernatantti kerätään, sisältävät myrkkyä neste jousitus. Proteiinin pitoisuus jokainen master mix oli määrällisesti Pesuaineella Yhteensopiva Proteiinin Määritys (Bio-Rad), mittaamalla absorbanssi 750 nm: n kanssa Millennium Tiede BioTek power wave XS2 (Gen 5 1.11 Software, Versio 1.11.5). Kukin master mix merkittiin sitten alikventiksi ja säilytettiin -80 °C: ssa.,
solulinjoissa ja kulttuurin olosuhteet
Kaikki solulinjat olivat ostettu American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), lukuun ottamatta HEK293FT soluja, jotka oli ostettu Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australia), SUM149 ja SUM159, että saatiin Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA), ja T11 ja B. 15 soluja, jotka olivat ystävällisesti Charles Perou ja Lyuba Varticovski päässä University of North Carolina at Chapel Hill ja National Institutes of Health, vastaavasti. T11 ja B. 15 ovat hyvin luonnehdittuja solulinjoja 37, 38.,
Solut inkuboitiin 37 °C: ssa ja 5% CO2 ja täydennetty 1% antibiootti–antimycotic. HDFa (normaali ensisijainen aikuisen ihmisen ihon fibroblastien) soluja viljeltiin vuonna DMEM 10% naudan sikiön seerumia (FBS). MCF-10A-ja MCF-12A (ihmisen rintarauhasen ikuistettu epiteelisolujen, nontransformed) olivat voimassa, DMEM/F-12-lisäravinteet (5% sikiön hevosen seerumia, 20 ng/mL epidermaalinen kasvutekijä, 10 µg/µL insuliinia, 100 ng/mL koleratoksiinin, ja 500 ng/mL, hydrokortisoni). NIH/3T3 (hiiren alkion fibroblasti-solut) oli voimassa DMEM, jossa 10% FBS., HEK293FT (ihmisen alkion munuaisten 293-solujen vakaasti ilmaista SV40 large T-antigen) oli sivistynyt DMEM, jossa 10% FBS ja lisäravinteet (1% glutamiinia ja 0,4 mg/mL G418 Geneticin, Gibco). MCF7 (ihmisen luminal rintasyöpä) oli voimassa MEM-α, jossa 10% FBS ja lisäravinteet (kukin 1% natrium-pyruvaatti, natriumbikarbonaattia, ja ei-välttämättömiä aminohappoja). T-47D-ja ZR-75-1 (sekä ihmisten luminal rintasyöpä) viljeltiin vuonna RPMI, jossa 10% FBS. MDA-MB-231 (ihmisen claudiini-Alhainen rintasyöpä) viljeltiin DMEM: ssä 10% FBS: llä., SUM149 (ihmisen tyvitumainen rintasyöpä) viljeltiin F-12: ssa 10% FBS: llä. SUM159 (ihmisen claudin-alhainen rintasyöpä) oli viljellyt F-12-5% FBS ja lisäravinteet (5 µg/mL insuliinia ja 1 µg/mL, hydrokortisoni). MDA-MB-453 (ihmisen HER2-rikastettu rintasyöpä) oli sivistynyt DMEM, jossa 10% FBS. SKBR3 (ihmisen HER2-rikastettu rintasyöpä) oli sivistynyt RPMI, jossa 10% FBS ja 1% natrium pyruvaatiksi. p53-T11 (murine claudin-Alhainen rintasyöpä) säilyi rpmi 1640-väliaineessa 10% FBS: llä. BRCA-B. 15 (hiiren basaalimainen rintasyöpä) säilyi rpmi 1640-väliaineessa 10% FBS: llä.,
Solu-elinkelpoisuus määritykset
Solujen elävyys määritettiin Luminescent Solujen Elävyys Määrityksen mukaan toimittajan pöytäkirjan. Solut olivat päällystetty 96-sekä kulttuuri-levyt ja inkuboidaan 37 °C: ssa ja 5% CO2, 24 s. Annos–vaste-kokeet, media oli hävitettävä ja korvattava laitteeseen, jossa on ilmoitettu pitoisuudet mehiläinen myrkky tai peptidi ja viljellyt 24 h., Solun elinkelpoisuuden yli 60 min, soluja hoidettiin IC50: een, joka mehiläisen myrkky tai melittin jokainen solu line lyhyen ajan välein 1 s, ja elinkelpoisuus määräytyy välittömästi hoidon jälkeen. Elinkelpoisuuden määrittämiseksi soluja inkuboitiin CellTiter-Glo (CTG) 2,0 reagenssilla 10 minuutin ajan. Solujen elinkelpoisuus kvantifioitiin mittaamalla luminesenssi EnVision 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer) – laitteella. Kokeet tehtiin biologisilla replikaateilla (n = 3).,
Tuotannon ensisijainen monoklonaalinen vasta-aine vastaan melittin
Vasta-aineiden tuotantoa tehtiin mukaisesti protokollia hyväksynyt Eläinten Eettisen Komitean Harry Perkins Institute of Medical Research. Naaraspuoliset A / J-hiiret rokotettiin Australiassa kerätyllä hunajamyrkyllä. Hiiret saivat vatsaonteloon injektio 12 µg myrkky Täysin Freund on Adjuvanttia (Difco), jonka jälkeen vauhtia Epätäydellinen Freund Adjuvantti on Päivä 29 ja vesipitoinen lisätä PBS 7 µg/hiiri Päivä 49. Hiiristä vuoti verta päivänä 60, ja seraa testasi ELISA., Paras vaste tehostettiin 7 µg hunajamyrkkyä PBS: ssä 4 päivää ennen fuusiota. Pernan solut fuusioitiin Sp2 / O myeloomasoluihin standardimenetelmien mukaisesti82. Vasta-aineita sisältävät supernatantit seulottiin ELISA-menetelmällä. Hybridoma-klooni 3b9 valittiin jatkotutkimuksiin. Vasta-aine tuotettiin kasvattamalla hybridoma-soluja bioreaktoreissa Hybridoma-seerumista vapaassa väliaineessa (Gibco). Vasta-aine puhdistettiin proteiini G-Sefaroosikromatografialla. Puhdistettu vasta-aine dialysoitiin PBS: ssä (pH 7,3). Vasta-aine oli vastedes nimitystä anti-melittin vasta-aine (3B9).,
Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA)
Myrkyn ja peptidit olivat kullattu ulos selkeä käyrä-pohjainen 96-kuoppalevylle 5 µg/mL karbonaatti puskuri ja inkuboitiin 4 °C: ssa 24 h. Neste poistettiin, ja levyt pestiin kolme kertaa liuos 0,05% TWEEN-20 (”Tween-20,” Sigma-Aldrich) PBS. Ensisijainen vasta-aineita lisättiin kuoppiin 1:2 laimennokset alkaen 10 µg/mL liuotinta (0.1% naudan seerumin albumiini (BSA) PBS), ja inkuboitiin 1 h huoneenlämmössä. Ensisijainen vasta-aineet poistettiin, ja levyt pestiin kolme kertaa vuonna 0.,05% Tween-20 PBS: ssä. Se polyklonaalisia vuohen anti-hiiri IgG-γ-ketju-erityisiä sekundaarinen vasta-aine lisättiin kuoppiin (1:1000 liuotinta) ja inkuboitiin 1 h huoneenlämmössä. Ensisijainen vasta-aineet poistettiin, ja levyt pestiin kolme kertaa 0,05% Tween-20 PBS. ELISA-kehittää puskuri, ratkaisu puhdistettua vettä, joka sisältää 10% sitruunahappoa (pH 4.2), 2% ABTS, ja 0,1% H2O2, lisättiin kuoppiin, ja levyt olivat inkuboitiin pimeässä huoneenlämmössä 15 min., Absorbanssi kirjattiin 405 nm: ssä käyttäen VICTOR Light plate reader Wallac 1420 Manager-ohjelmistoa (PerkinElmer). Ohjaus oli hiiren monoklonaalinen IgG-vasta-aine (28/00 8C1-6), joka reagoi ihmisen IL-12, sovelletaan melittin peptidi ELISA-levylle. Kokeet tehtiin biologisilla replikaateilla (n = 3).
Anti-melittin vasta kilpailun kokeiluja
HDFa ja SUM159 solut olivat päällystetty 96-sekä kulttuuri-levyt ja inkuboidaan 37 °C: ssa ja 5% CO2, 24 s., Kasvavia pitoisuuksia anti-melittin vasta olivat inkuboitiin kanssa IC50-pitoisuudet mehiläisen myrkky tai melittin kunkin solun rivi 1 h huoneenlämmössä, ja sitten lisätään solujen 24 h. Solujen elävyys määritettiin kuvattu ”Solujen elävyys määritykset”. Kokeet tehtiin biologisilla replikaateilla (n = 3).
Western blot
Solut olivat kullattu päälle 6-kuoppalevyillä, kun tiheys 300 000 solua/kuoppa ja inkuboidaan 37 °C: ssa ja 5% CO2, 24 s., Soluviljelmäkokeet tehtiin kuvatulla tavalla, ja sitten noudatettiin tavanomaista länsimaista blot-protokollaa, kuten tässä on kuvattu. Solut pestiin kylmällä PBS: llä ja lyysattiin kylmällä proteiinia lysis buffer (2% natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 125 mmol/L Tris-HCl, pH 6,8). Näytteet sonikoitiin 10 s 10 mA, ja proteiinin pitoisuudet laskea kanssa Pesuainetta Yhteensopiva Proteiinin Määritys (Bio-Rad). Yhtä paljon proteiineja sekoitettiin loading buffer (Laemmli Sample Buffer, Bio-Rad), johon pelkistin ditiotreitolia (DTT)., Proteiini näytteet olivat denaturoitu kiehuvaa 95 °C 5 min, ladataan Mini-MUUNTAUTUMISKYKYINEN betonielementtien geelejä (Bio-Rad) ja alistettiin elektroforeesi 100 V, ja sitten siirrettiin PVDF-kalvoja (Bio-Rad) kanssa Trans-Blot Turbo siirtojärjestelmä (Bio-Rad) 7 min. Kalvot olivat rauhoitettuna TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) ja 5% rasvatonta maitoa estää epäspesifinen sitova. Kalvot olivat inkuboidaan yön yli 4 °C-ensisijainen vasta-aineita laimennettiin 3% BSA ja 0,02% natriumatsidia., Signaali havaittiin Luminata Crescendo Länsi-HRP-Alustan (Milliporen) kanssa ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) käynnissä Image Lab-Ohjelmisto (Bio-Rad, Versio 6). Läntiset blotit johdettiin samasta kokeesta ja käsiteltiin rinnakkain. Läntisten blottien kuvaamattomat skannaukset toimitetaan täydentävissä viikunoissa. 10–15.
virtaussytometria
Apoptoosi ja nekroosi arvioitiin käyttämällä Anneksiini V-FITC Apoptoosin Detection Kit-I (BD Biosciences) valmistajan mukaan on pöytäkirja. SUM159-solut päällystettiin 6-kaivoviljelylevyillä 24 tunnin ajan., Media oli sitten heitetään pois ja korvataan media, joka sisältää mehiläisen myrkky tai melittin (IC50-pitoisuudet) ja viljellyt 60 min. Solut kerättiin trypsiinillä ja media, ja sentrifugoidaan (1000g, 5 min, 24 °C), pestiin kylmällä PBS, sentrifugoidaan (1000g, 5 min, 24 °C), ja on sekoitettava uudelleen 1× sitova puskuri. Solut valmistettiin 1 miljoonan solun/mL pitoisuudeksi 1× sitova puskuri. Näytteitä inkuboitiin FITC: n ja PI: n (5 µL kutakin) kanssa pimeässä 15 minuutin ajan., Läsnäolo elävät, kuolleet, apoptoottisten, tai nekroottisen solujen arvioitiin BD Accuri C6 Cytometer (BD Biosciences, San Jose, USA) kanssa BD Accuri C6-ohjelmisto, ja analysoidaan FlowJo™ (Ashland, YHDYSVALLAT, Windows 7-Versio). Kokeet tehtiin biologisilla replikaateilla (n = 3). Gating strategiat on esitetty täydentävä Kuva. 16.
Live-solujen mikroskopia
SKBR3 solut olivat kullattu lasi-bottom microwell astia (10 × 35 mm, MatTek) ja inkuboitiin 24 h., Microwell-astia jätettiin tasapainottumaan NIKON Eclipse Ti confocal-mikroskoopilla vaihe-top-inkubaatiokammio (37 °C ja 5% CO2) 20 min. 20× tavoitteena oli käyttää Kohler linjaus, ja kuvat on otettu minuutin välein, 10 min ennen ja 1 s jälkeen hoidon IC50: een, joka mehiläisen myrkky on kerätty Australiassa., Kirjoittajat myöntävät, tilat ja tieteellistä ja teknistä apua tarjoamia National Imaging Laitos, Kansallisen tutkimusyhteistyön Infrastruktuurin Strategia (NCRIS) ominaisuus, samoin kuin Australian Mikroskopia & Microanalysis tutkimuslaitos, sekä Centre for Microscopy, Karakterisointi ja Analyysi (CMCA), UWA, laitoksen rahoittama Yliopisto, Valtion ja Kansainyhteisön Hallitusten.,
Scanning electron microscopy
Lasi coverslips (12 mm: n halkaisija, Menzel, Thermo Fisher Scientific) oli päällystetty poly-l-lysiini hydrobromide (Sigma-Aldrich) 20 min ja sitten pestään kahdesti puhdistettua vettä. SUM159 solut olivat kullattu päälle lasi dioja, kun tiheys 62500 solua/kuoppa ja inkuboidaan 37 °C: ssa ja 5% CO2, 24 s. Solut pestiin kaksi kertaa PBS: llä ja käsiteltiin sitten ajoneuvo tai IC50-pitoisuudet mehiläinen myrkky ja melittin 1 h., Solut pestiin kahdesti PBS: llä, sitten ne kiinnitettiin 4% formaldehydillä PBS: ssä 25 min: n ajan ja pestiin sitten uudelleen kolme kertaa PBS: llä. Valmisteltaessa mikroskopia, näytteet upotettiin 2.5% glutaraldehydi ja olivat inkuboitiin 4 °C: ssa 2 h. Näytteet pestään deionisoidulla vedellä ja upotetaan kasvavia pitoisuuksia etanolia (50%, 70%, 95%, 100%, ja sitten 100% absoluuttinen ”kuiva” etanoli). Jokaisen upotuksen välissä näytteet kuivuivat erikoisessa mikrossa (PELCO, BioWave 34700 Laboratory Microwave System)., Nestehukka prosessi on tehty Kriittisen Pisteen Kuivaus Laitteet E3000 korvata etanolia näytteen kanssa ylikriittinen CO2. Jalostetut coverslipit asennettiin SEM-kiinnikkeisiin (ProSciTech) hiililapuilla. Näytteet olivat päällystetty 3-nm platinum, jotta ne sähköisesti johtavia ennen visualisoidaan alle skannaus elektronimikroskoopilla (Zeiss 1555 VP-FESEM) klo CMCA, UWA. Kuvat otettiin linssin sisäisellä ilmaisimella 2,6-mm työetäisyydellä, 30-µm aukolla ja 5 kV: n kiihdytysjännitteellä., Kuvat analysoitiin kuvaanalyysiohjelmistolla Fidži (ImageJ) 83.
Immunofluoresenssi
Lasi coverslips (12 mm: n halkaisija, Menzel, Thermo Fisher Scientific) sijoitettiin 24-kuoppalevyillä ja pinnoitettu poly-l-lysiiniä (Sigma-Aldrich) 20 min ja sitten pestään kahdesti puhdistettua vettä. SUM159 solut olivat kullattu päälle lasi dioja ja inkuboidaan 37 °C: ssa ja 5% CO2, 24 s. Soluja hoidettiin 30 min ajoneuvon, tai IC50: een, joka mehiläisen myrkky, melittin, RGD1-melittin, ja vastaa molaarinen pitoisuus kuin melittin DEDE-melittin., Solut pestiin kahdesti PBS: llä, sitten ne kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 25 min ja pestiin sitten uudelleen kolme kertaa PBS: llä. Epäspesifinen vasta-aineiden sitoutuminen estettiin käyttämällä 5%: n normaalia Vuohiseerumia (Thermo Fisher Scientific) PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Ensisijainen vasta-aineita lisättiin soluja, mukaan lukien monoklonaalinen anti-melittin vasta-aine (5 µg/mL) ja 1:500 anti-EGFR (Abcam). Näytteet inkuboitiin kevyesti keinuen 4 °C: ssa yön yli., Solut pestiin kolme kertaa PBS: llä, ja sitten inkuboitiin 1:500 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse vasta toissijainen, 1:500 Alexa Fluor 594 vuohen anti-kani vasta toissijainen, ja Hoechst (1:5000) PBS huoneenlämmössä 1 h. Näytteet pestiin kolme kertaa PBS: llä ja asennettu päälle lasi coverslips kanssa SlowFade Diamond Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific). Diat olivat kuvaamisen avulla confocal fluoresenssi Nikon Ti-E käänteismikroskooppi. Kuvat otettiin 20× ilmatavoitteen (NA 0.,75), ja jaksollinen heräte käyttäen aallonpituudella 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (Alexa Fluor 488 sekundaarinen vasta-aine), ja 561 nm (Alexa Fluor 594 sekundaarinen vasta-aine). Kuvat kerättiin NIS-C Elements-ohjelmistolla ja käsiteltiin Fidžillä (ImageJ) CMCA83: ssa.
Bioluminesenssi resonance energy transfer (BRET)
– Reseptori–ligandi-vuorovaikutukset arvioitiin BRETIN kanssa, käyttämällä samanlaista menetelmää kuin on kuvattu previously84,85., BRET liittyy nonradiative energian siirto (dipoli–dipoli) kahden proteiineja tai molekyylien kiinnostaa merkitty joko luovuttajan luciferase tai tunnustaja fluorophore jälkeen substraatin hapetus, jonka luciferase ja myöhemmät päästöt light54. FITC-tunnisteet ovat konjugoitu N päähän melittin (FITC-melittin) ja DEDE-melittin (FITC–DEDE-melittin). HEK293 soluja vakaasti ilmaista SV40 large T-antigen (HEK293FT) olivat kullattu päälle 6-kuoppalevyillä, kun tiheys on 550000 solua/no 24 h., HEK293FT-solut siirrettiin plasmideilla, jotka sisältävät cDNA: ta NanoLuc-EGFR: lle Fugenen avulla. Lyhyesti, plasmidi ekspressio oli inkuboitiin 10 min huoneenlämmössä sekoitus transfektion reagenssi-ja seerumin-ilmainen DMEM suhteessa 10 ng/µL NanoLuc-EGFR: 4 µL FuGENE: 100 µL SFM. Seokseen lisättiin HEK293FT solujen lopullinen pitoisuus 10 ng/µL NanoLuc-EGFR kohti 6-kuoppalevyn, ja soluja inkuboitiin 24 h. Solut pestiin PBS: llä ja irrottaa trypsiinillä, sitten kerätään media, joka sisältää 5% vasikan sikiön seerumia fenolipunainen-ilmainen DMEM., Solut olivat kullattu 50 000 solua/kuoppa osaksi poly-l-lysiini-päällystetty 96-hyvin valkoinen levyt ja inkuboitiin 24 h. Sekä kylläisyyttä ja liike BRET määritykset, kaksi suodatinta käytettiin samanaikaisesti mitata lyhyen ja pitkän aallonpituuden luminesenssi, joka vastaa emissioaallonpituudet luovuttajan ja vastaanottajan molekyylejä, vastaavasti.
reaaliaikainen ligandin assosiaation kinetiikka kokeiluja, media poistettiin soluista, jotka olivat sitten inkuboitiin 50 µL/kaivo NanoLuc alustan furimazine lopullinen pitoisuus 10 µM, laimennettiin Hank ’ s Balanced Salt Solution (hankin puskuroitu suolaliuos, hbss)., Tämän jälkeen solut tasapainotettiin CLARIOstar plate reader (BMG Labtech, Australia) 5 minuutin ajan basal-lukemien kirjaamiseksi. Myös ligandien (TAMRA-EGR, FITC-melittin, ja FITC–DEDE-melittin) olivat sitten lisätään erilaisia oikea lopulliset pitoisuudet, ja NanoBRET tallenteet otetaan joka 90 s 60 min 37 °C. kylläisyyttä kokeiluja, media poistettiin soluista, ja erilaisia pitoisuuksia TAMRA-EGR, FITC-melittin, ja FITC–DEDE-melittin lisätty läsnäolo tai puuttuminen kilpailevat pitoisuus (1 µM) siitä leimaamaton EGR: n ja inkuboidaan 37 °C: ssa 60 min pimeässä., Furimatsiinia lisättiin lopullisessa pitoisuudessa 10 µM. Äänitykset tehtiin LUMIstar Omegan (BMG Labtech, Australia) avulla. Tiedot esitetään ”raw BRET-suhteena”, joka saadaan pitkän aallonpituuden päästön (acceptor) suhteesta lyhyen aallonpituuden päästöön (luovuttaja). Kokeet tehtiin biologisilla replikaateilla (n = 3).
Analyysi yhdistettynä lääkkeen vaikutuksia
Mehiläisen myrkky tai melittin oli yhdessä dosetakselin ja antaa pitoisuudet ilmoitettu nonconstant suhde T11 solujen 24 h., Solujen elinkelpoisuutta arvioitiin käyttämällä CellTiter-Glo: ta, kuten edellä mainittiin. Yhdistetty vaikutus mehiläinen myrkky tai melittin dosetakselilla arvioitiin mediaani annos-vaikutus-menetelmää käyttäen CompuSyn Ohjelmisto (ComboSyn). Tämä menetelmä määrittää CI perusteella vaikutus on yhdistelmä välillä kaksi agenttia (missä CI < 1 on synergistinen, CI > 1 on vihamielinen, ja CI = 1 on lisäaine)56. Kokeet tehtiin biologisilla replikaateilla (n = 3).,
Eläinten malli ja hoitoja
Näiden eläinten kokeet suoritettiin mukaisesti protokollia hyväksynyt Eläinten Eettinen toimikunta UWA. Simuloida kehittynyt malli claudin-alhainen rintasyöpä, 2.5 × 105 T11 solut olivat keskeytetty in serum-vapaa media-ja BD Matrigel Matriisi Korkea Pitoisuus (BD Bioscience) 1:1-suhteessa yhteensä tilavuus oli 100 µL ja ihonalaisena injektiona kyljet 5-viikkoa vanhoja BALB/cJ naisilla (Animal Resources Centre, WA, Australia) käyttämällä 26 G: n neula., Myös T11 käytetyt solut olivat lentivirally transduced kanssa ZsGreen-luciferase rakentaa ja lajitellaan kolme kertaa saavuttaa rikastamiseen parempi kuin 99% luciferase-positiivisia soluja. Melittin hyllytettiin Milli-Q-vedessä + 5% dekstroosissa. Docetaxel (jauheena) keskeytettiin 25% TWEEN 80 (Sigma-Aldrich), ja 75% seoksen 15.25:84.75 (v/v) ratkaisu absoluuttista etanolia ja puhdistettua vettä ja säilytetään -20 °C. Välittömästi ennen hoitoja, docetaxel oli juuri laimennettiin Milli-Q-vettä + 5% dekstroosi tarvitaan lopullinen pitoisuus., Kolme päivää T11-kasvainten (~50 mm3) syntymisen jälkeen hiiret satunnaistettiin 4 ryhmään (n = 12 hiirtä/ryhmä). Hoidot olivat ruiskutetaan intratumorally päivinä 3, 5, 7, 9, 11, 13, ja 15 post rokotus T11 soluja, ajoneuvon, melittin (5 mg/kg), dosetakselia (7 mg/kg), tai yhdistelmä melittin (5 mg/kg) ja doketakselin (7 mg/kg). Eläimiä seurattiin kasvaimen koon välein 2 päivää, ja volyymit lasketaan muutettu ellipsoid kaava (tilavuus = width2 × pituus/2). Eläimet uhrattiin inhimillisesti, kun kasvaimet saavuttivat 800 mm3.,
Immunohistokemiallinen analyysi kasvaimia
Kasvain kudosten olivat kiinteä 4% paraformaldehydi, pestiin kolme kertaa PBS: llä, ja jäljellä 70% etanolia. Kasvaimet upotettiin parafiiniin ja valmistettiin 5-µm: n pätkiä. Esimerkiksi hematoksyliini – /eosiini värjäys, diat olivat vahat poistettu, hydrattu käyttäen vähentämällä ratkaisu pankki etanolia, värjätään Gillin hematoksyliinillä, kuivattu käyttää 70-prosenttista etanolia, värjätään eosiini, edelleen kuivalle avulla 100% etanoli, tyhjennetään käyttäen tolueenia, ja asennettu coverslips käyttäen Acrymount IHC asennus media (StatLab)., Kasvainsoluapoptoosi määritettiin kudososioissa TUNEL-määrityksellä (In Situ Cell death Detection Kit, Roche).
Bioluminesenssi imaging
seurata tarkasti muutoksia in vivo kasvaimen kasvua hoitoja, me suoriteta bioluminescence analyysi käyttäen Jarrusatula IVIS Lumina II imaging järjestelmän CMCA, UWA. Analyysit tehtiin 2 päivän välein kasvainten syntymisen jälkeen. Hiiret olivat injektoitiin intraperitoneaalisesti 200 µL D-Luciferin (Cayman Chemical) lopullinen pitoisuus 150 mg/kg liuotettiin PBS ennen nukutettiin 4% isofluraani., Kun nukutetaan, hiiret olivat sijoitettu prewarmed jaoston bioluminescence lämpökamera ja kuvaamisen 7-12 min injektion jälkeen, alle 2% isofluraani, kunnes bioluminescence signaalin voimakkuus oli saavuttanut vakaan tilan.
tilastoanalyysi
kaikki tiedot on saatu useista kokeista, jotka on tehty ainakin kolmena kappaleena. Tilastolliset analyysit tehtiin GraphPad Prism v8: lla (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft) ja SPSS Predictive Analytics-ohjelmisto (IBM, versio 26)., Solu-elinkelpoisuus määritykset, tiedot olivat normalisoitu keskimääräinen luminesenssi ajoneuvon kunto, joka pidettiin 100% kannattavuuden kanssa IC50s saatu GraphPad Prism-ohjelmaan. Hoidettujen T11-kasvainten immunohistokemian P-HER2: n (Tyr1248) ja P-EGFR: n (Tyr1068) havaitsemiseksi ajoneuvo normalisoitiin 100 prosenttiin., Tarvittaessa ja kuten syytteeseen pääasiassa tekstiä, tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttämällä pariton kaksi-tailed studentin t-testit, parittomia one-way ANOVA with Tukey HSD post hoc-testi korjattu useita vertailuja, kaksisuuntainen ANOVA, jossa toistuvat toimenpiteet, jonka jälkeen Sidak tai Tukey ’ s multiple comparison-testi, tai yleinen lineaarinen malli (GLM). Kaikissa testeissä, ero oli merkitsevä p < 0.05 (*), p < 0.01 ( * * ) ja p < 0.001 (***).,
Raportointi yhteenveto
lisätietoja tutkimuksen suunnittelu on saatavilla Luonne, Tutkimuksen Raportointi Yhteenveto liittyvät tämän artikkelin.
Leave a Reply