Kemiske reagenser og antistoffer
Bee venom collection
venom blev indsamlet ved hjælp af arbejdere eller dronninger fra flere forskellige populationer af Apid bier., Venom prøver, der er indsamlet fra Europæiske honningbier (Apis mellifera) og buff-tailed humlebier (Bombus terrestris audax) stammer fra Perth (Australien), Dublin (Irland) og London (England). Honningbiegift blev opsamlet fra 30 arbejdere i hver af tre forskellige kolonier fra en apiary eller gård som beskrevet. Honningbien gift fra Australien blev indsamlet fra en bigård, som vedligeholdes af Center for Integrativ Bee Research (CIBER), der ligger på University of Western Australia (UWA: -31.980151, 115.817919)., Honningbien gift fra Irland blev indsamlet fra en koloni på en bigård på Trinity College Dublin (53.343933, -6.254635), og de to andre kolonier fra gårde i nærheden Glasnevin (53.383245, -6.276333) og Blanchardstown (53.384220, -6.375979). Honningbi og bumblebee gift fra England blev indsamlet ved Royal Holloway University of London (51.425626, -0.562987). Bumblebee venom blev indsamlet fra 20 medarbejdere fra hver af 2 kommercielt købt kolonier, med enkelt-værelse med queensize-humlebier fra hver af disse to kolonier, der anvendes til indsamling af dronning bumblebee venom., Uafhængige biologiske masterblandinger blev fremstillet ved at holde giften fra forskellige kolonier adskilt, med giften fra 312 bier samlet i alt.
Glandular gift blev opsamlet ved manuel dissektion. Bier blev fanget nær indgangen til bikuben til honningbier eller direkte fra kolonien for humle og bedøvet med kuldio .id og kølet på is. Stingapparatet blev dissekeret fra hvert individ; derefter blev giftkirtlen fjernet og anbragt i fosfatbufret saltvand (PBS)., Kirtlerne blev gennemboret med en Terumo nål (25 g 5 5/8) og centrifugeret (13.000 g, 10 min, 4.C), og supernatanten opsamlet, indeholdende gift i flydende suspension. Protein koncentration for hver master mix blev kvantificeret med et Rengøringsmiddel, der er Kompatibel Protein Indhold (Bio-Rad), måling af absorbans ved 750 nm, med et Årtusinde Videnskab BioTek PowerWave XS2 (Gen 5 1.11 Software, Version 1.11.5). Hver Masterblanding blev derefter justeret og opbevaret ved -80 C. C.,
cellelinjer og-kultur-forhold
Alle cellelinjer blev købt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), undtagen for HEK293FT celler, der blev købt fra Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Australien), SUM149 og SUM159, der blev indhentet fra Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA), og T11 og B. 15 celler, der er venligst stillet til rådighed af Charles Perou og Lyuba Varticovski fra University of North Carolina i Chapel Hill og National Institutes of Health, hhv. T11 og B. 15 er meget velkarakteriserede cellelinjer37, 38.,
celler blev inkuberet ved 37 and C og 5% CO2 og suppleret med 1% antibiotika–antimykotisk. Hdfa (normal primary adult human dermal fibroblast) celler blev dyrket i DMEM med 10% føtal bovint serum (FBS). MCF 10A og MCF-12A (human mamma udødeliggjort epitelceller, nontransformed) blev opretholdt i DMEM/F-12 med kosttilskud (5% føtalt hest serum, 20 ng/mL epidermal growth factor, 10 µg/µL insulin, for 100 ng/mL kolera toxin, og 500 ng/mL hydrocortison). NIH / 3T3 (murine embryonale fibroblast) celler blev opretholdt i DMEM med 10% FBS., HEK293FT (humane embryonale nyre 293 celler stabilt udtrykke SV40 store T-antigen) blev dyrket i DMEM med 10% FBS og kosttilskud (1% glutamin og 0,4 mg/mL G418 Geneticin, Gibco). MCF7 (human luminal En brystkræft) blev opretholdt i MEM α med 10% FBS og kosttilskud (1% hver af natrium pyruvat, natriumbicarbonat, og væsentlige aminosyrer). T-47D og andr-75-1 (begge humane luminale a brystkræft) blev dyrket i RPMI med 10% FBS. MDA-MB-231 (human claudin-lav brystkræft) blev dyrket i DMEM med 10% FBS., SUM149 (human basal-lignende brystkræft) blev dyrket i F-12 med 10% FBS. SUM159 (human claudin-lav brystkræft) blev dyrket i F-12 med 5% FBS og kosttilskud (5 µg/mL insulin og 1 µg/mL hydrocortison). MDA-MB-453 (human HER2-beriget brystkræft) blev dyrket i DMEM med 10% FBS. SKBR3 (human HER2-beriget brystkræft) blev dyrket i RPMI med 10% FBS og 1% natriumpyruvat. p53− T11 (murine claudin-lav brystkræft) blev opretholdt i RPMI 1640 medium med 10% FBS. BRCA− B. 15 (murine basal-lignende brystkræft) blev opretholdt i RPMI 1640 medium med 10% FBS.,
cellelevedygtighed assays
Cellelevedygtighed blev bestemt af luminescerende Cellelevedygtighed Assay i henhold til leverandørens protokol. Cellerne var belagt i 96-brønds kultur-plader og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 24 timer. For dosis–respons-analyser, medier blev kasseret og erstattet med medier, der indeholder angivet koncentrationer af bee venom eller peptid-og kulturperler i 24 timer., For cellelevedygtigheden over 60 minutter blev celler behandlet med IC50 af honningbiegift eller melittin for hver cellelinie i korte tidsintervaller over 1 time, og levedygtigheden blev bestemt umiddelbart efter behandlingen. For at bestemme levedygtighed blev celler inkuberet med CellTiter-Glo (CTG) 2.0 reagens i 10 minutter. Cellelevedygtighed blev kvantificeret ved at måle luminescens ved hjælp af en EnVision 2102 Multilabel læser (PerkinElmer). Eksperimenter blev udført i biologiske replikater (n = 3).,
produktion af et primært monoklonalt antistof mod melittin
antistofproduktion blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af Animal Ethics Committee fra Harry Perkins Institute of Medical Research. Kvindelige A / J-mus blev immuniseret med honningbiegift opsamlet i Australien. Mus modtaget intraperitoneal injektion af 12 µg venom i Komplet Freund s Adjuvans (Difco), efterfulgt af et løft i Ufuldstændig Freund s Adjuvans på Dag 29, og en vandig løft i PBS på 7 µg/mus på Dag 49. Mus blødte på dag 60, og sera blev testet af ELISA., Den bedste responder blev boostet med 7 µg honningbiegift i PBS 4 dage før fusion. Miltceller blev fusioneret med SP2 / o myelomceller i henhold til standardprocedurer82. Antistofholdige supernatanter blev screenet af ELISA. Hybridoma clone 3B9 blev udvalgt til yderligere undersøgelse. Antistoffet blev produceret ved dyrkning af hybridomacellerne i bioreaktorer i Hybridomas serumfrit Medium (Gibco). Antistoffet blev oprenset ved protein g-Sepharosechromatografi. Renset antistof blev dialyseret i PBS (pH 7.3). Antistoffet blev herefter omtalt som anti-melittin-antistoffet (3B9).,
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Venoms og peptider var belagt ud i klare kurve-baseret 96-brønds plader på 5 µg/mL i carbonat buffer og inkuberes ved 4 °C i 24 h. Væsken fjernes, og pladerne vaskes tre gange i en opløsning på 0,05% TWEEN-20 (“Tween-20,” Sigma-Aldrich) i PBS. De primære antistoffer blev sat til brøndene med 1: 2 fortyndinger startende fra 10 µg / mL i fortyndingsmiddel (0,1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS) og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. De primære antistoffer blev fjernet, og pladerne vaskes tre gange i 0.,05% T 20een-20 i PBS. Den polyklonale ged anti-mus IgG y-kædespecifikke sekundære antistof blev tilsat til brøndene (1:1000 i fortyndingsmiddel) og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. De primære antistoffer blev fjernet, og pladerne vaskes tre gange i 0,05% t .een-20 i PBS. ELISA-udviklende buffer, en opløsning af renset vand indeholdende 10% citronsyre (pH 4,2), 2% ABTS og 0,1% H2O2, blev tilsat til brøndene, og plader blev inkuberet i mørke ved stuetemperatur i 15 minutter., Absorbans blev registreret ved 405 nm ved hjælp af VICTOR Light plate reader med Perallac 1420 Manager Soft .are (PerkinElmer). Kontrollen var musens monoklonale IgG-antistof (28/00 8C1-6), der reagerer med human IL-12, påført melittinpeptidet på ELISA-pladen. Eksperimenter blev udført i biologiske replikater (n = 3).
Anti-melittin antistof konkurrence eksperimenter
HDFa og SUM159 celler var belagt i 96-brønds kultur-plader og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 24 timer., Stigende koncentrationer af anti-melittin-antistoffet blev inkuberet med IC50-koncentrationerne af honningbiegift eller melittin for hver cellelinie i 1 time ved stuetemperatur og derefter tilsat til cellerne i 24 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt som beskrevet i “cellelevedygtighedsanalyser”. Eksperimenter blev udført i biologiske replikater (n = 3).
Westernestern blot
celler blev belagt på 6-brønds plader ved en densitet på 300.000 celler / brønd og inkuberet ved 37.C og 5% CO2 i 24 timer., Cellekulturforsøg blev udført som beskrevet, og derefter blev standard Westernestern blot-protokollen fulgt som beskrevet heri. Cellerne blev vasket med kold PBS og lyseret med kold proteinlys buffer (2% natriumdodecylsulfat (SDS), 125 mmol/L Tris-HCl, pH 6,8). Prøver blev sonikeret i 10 s ved 10 mA, og proteinkoncentrationer kvantificeret med det Vaskemiddelkompatibel Proteinassay (Bio-Rad). Lige store mængder proteiner blev blandet med loading buffer (Laemmli prøve Buffer, Bio-Rad) suppleret med reduktionsmidlet dithiothreitol (DTT)., Protein prøver blev denatureret ved kogning ved 95 °C i 5 min, lagt i Mini-PROTEAN færdigstøbte geler (Bio-Rad) og udsat for en elektroforese ved 100 V, og derefter overført til PVDF membraner (Bio-Rad) med den Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) i 7 min. Membraner blev inkuberet med TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, og 0,1% Tween-20) med 5% nonfat mælk til at blokere for uspecifik binding. Membraner var inkuberes natten over ved 4 °C, med primære antistoffer, der er fortyndet i 3% BSA og 0,02% natriumazid., Signalet blev opdaget med Luminata Crescendo Vestlige HRP Substrate (Milipore) med ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad), der kører Billede Lab Software (Bio-Rad, Version 6). Vestlige blots blev afledt af det samme eksperiment og behandlet parallelt. Ubeskårne scanninger af de vestlige blots findes i supplerende figner. 10–15.
flowcytometri
Apoptose og nekrose blev vurderet ved hjælp af Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit jeg (BD Biosciences) i henhold til producentens protokol. SUM159 celler blev belagt i 6-brønds kulturplader i 24 timer., Medier blev derefter kasseret og erstattet med medier indeholdende honningbiegift eller melittin (IC50-koncentrationer) og dyrket i 60 minutter. Cellerne blev indsamlet med trypsin og medier, og centrifugeres (1000g, 5 min, 24 °C), vaskes med koldt PBS, centrifugeres (1000g, 5 min, 24 °C), og resuspenderet i 1× bindende buffer. Celler blev fremstillet til en koncentration på 1 million celler / mL i 1 binding bindingsbuffer. Prøverne blev inkuberet med FITC og PI (5 µL af hver) i mørke i 15 minutter., Tilstedeværelsen af levende, døde, apoptotic, eller nekrotiske celler, der blev vurderet med BD Accuri C6-Typen (BD Biosciences, San Jose, USA) med BD Accuri C6 software, og analyseret med FlowJo™ (Ashland, USA, Version af Windows 7). Eksperimenter blev udført i biologiske replikater (n = 3). Gating-strategierne er præsenteret i supplerende fig. 16.
levende cellemikroskopi
SKBR3-celler blev belagt i en glasbund mikrobrøndskål (10 35 35 mm, MatTek) og inkuberet i 24 timer., Mikrobrøndskålen blev efterladt til at ækvilibrere i et NIKON Eclipse Ti konfokalt mikroskopstadium-inkubationskammer (37 and C og 5% CO2) i 20 minutter. 20× mål blev brugt med Kohler tilpasning, og billeder blev taget hvert minut fra 10 min før til 1 time efter behandling med IC50 af honningbien gift indsamlet i Australien., Forfatterne takker de faciliteter og videnskabelig og teknisk bistand, der tilbydes af de Nationale Imaging Facilitet, et Nationalt forskningssamarbejde Infrastruktur Strategi (NCRIS) kapacitet, samt den Australske Mikroskopi & Mikroanalyse Forskning Facilitet, begge ved Center for Mikroskopi, Karakterisering og Analyse (CMCA), UWA et anlæg, der er finansieret af Universitetet, Staten og Commonwealth-landenes Regeringer.,
Scanning elektron mikroskopi
Glas coverslips (12 mm diameter, Menzel, Thermo Fisher Scientific) var belagt med poly-l-lysin hydrobromid (Sigma-Aldrich) i 20 minutter og derefter vaskes to gange med renset vand. SUM159 celler blev forgyldt på objektglas ved en densitet på 62,500 celler/godt og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 24 timer. Cellerne blev vasket to gange med PBS og derefter behandlet med køretøjet eller IC50 koncentrationer af honningbien gift og melittin i 1 time., Cellerne blev vasket to gange med PBS, derefter fikseret med 4% formaldehyd i PBS i 25 minutter, og derefter vasket igen tre gange med PBS. Som forberedelse til mikroskopi, de prøver, der blev nedsænket i 2,5% glutaraldehyd og blev inkuberet ved 4 °C i 2 timer. De prøver, der blev skyllet med demineraliseret vand og nedsænkes i stigende koncentrationer af ethanol (50%, 70%, 95%, 100%, og derefter 100% absolut “tør” ethanol). Mellem hver nedsænkning blev prøverne dehydreret i en specialiseret mikrobølgeovn (PELCO, Bio .ave 34700 Laboratory Micro Microwaveave System)., Dehydrering proces blev afsluttet med et kritisk punkt Tørringsapparat E3000 at erstatte ethanol i prøven med superkritisk CO2. De behandlede dækglas blev monteret på SEM mounts (ProSciTech) med carbon tabs. De prøver, der var belagt med 3-nm platinum for at gøre dem elektronisk ledende før der visualiseres under scanning elektron mikroskop (Zeiss 1555 VP-FESEM) på CMCA, UWA. Billeder blev taget med in-lens detektoren på 2,6 mm arbejdsafstand, 30 µm blænde og en accelerationsspænding på 5 kv., Billeder blev analyseret med billedanalysesoft .aren FIJI (ImageJ)83.
Immunofluorescens
Glas coverslips (12 mm diameter, Menzel, Thermo Fisher Scientific) blev placeret i 24-brønds plader og belagt med poly-l-lysin (Sigma-Aldrich) i 20 minutter og derefter vaskes to gange med renset vand. SUM159 celler blev forgyldt på objektglas og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 24 timer. Celler, der blev behandlet i 30 min med køretøjet, eller IC50 af honningbien gift, melittin, RGD1-melittin, og den tilsvarende molær koncentration som melittin for DEDE-melittin., Cellerne blev vasket to gange med PBS, derefter fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 25 minutter, og derefter vasket igen tre gange med PBS. Uspecifik antistofbinding blev blokeret under anvendelse af 5% normalt Gedeserum (Thermo Fisher Scientific) i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Primære antistoffer blev sat til cellerne, herunder Det monoklonale anti-melittin-antistof (5 µg/mL) og 1:500 anti-EGFR (Abcam). Prøverne blev inkuberet med skånsom svingning ved 4 C C natten over., Cellerne blev vasket tre gange med PBS, og derefter inkuberes i 1:500 af Alexa Fluor 488 ged anti-mus sekundære antistof, 1:500 af Alexa Fluor 594 gede-anti-kanin sekundære antistof, og Hoechst (1:5000) i PBS ved stuetemperatur i 1 time. Prøverne blev vasket tre gange med PBS og monteret på glas coverslips med SlowFade Diamant Antiblegemiddel Medium (Thermo Fisher Scientific). Lysbilleder blev afbildet under anvendelse af det konfokale fluorescens Nikon Ti-e inverterede mikroskop. Billeder blev taget ved hjælp af en 20 air luft mål (NA 0.,75), og sekventiel excitation ved hjælp af lys med bølgelængder på 405 nm (Hoechst 34580), 488 nm (Alexa Fluor 488 sekundære antistof), og 561 nm (Alexa Fluor 594 sekundære antistof). Billeder blev indsamlet ved hjælp af Nis-C Elements-Soft .are og behandlet ved hjælp af FIJI (ImageJ) på CMCA83.
Bioluminescensresonans energioverførsel (BRET)
Receptor–ligand interaktioner blev vurderet med BRET ved anvendelse af en metode svarende til den tidligere beskrevne 84,85., BRET indebærer nonradiative overførsel af energi (dipol–dipol) mellem to proteiner eller molekyler, der er af interesse, der er mærket med enten en donor luciferase eller en acceptor fluorophore efter substrat oxidation af luciferase og den efterfølgende udledning af light54. FITC-tags, der er konjugeret til N-terminus af melittin (FITC-melittin) og DEDE-melittin (FITC–DEDE-melittin). HEK293 celler stabilt udtrykker SV40 store t antigen (HEK293FT) blev belagt på 6-brønds plader ved en densitet på 550.000 celler/brønd i 24 timer., HEK293FT-celler blev transficeret med plasmider indeholdende cDNA til NanoLuc-EGFR under anvendelse af FuGENE. Kort plasmid cDNA blev inkuberet i 10 min ved stuetemperatur med en blanding af transfektion reagens og serum-gratis DMEM i et forhold på 10 ng/µL NanoLuc-EGFR: 4 µL FuGENE: 100 µL af bæredygtig skovforvaltning. Mix blev tilføjet til HEK293FT celler i en endelig koncentration på 10 ng/µL NanoLuc-EGFR per godt af 6-brønds plade, og celler inkuberes i 24 timer. Cellerne blev vasket med PBS og fritliggende med trypsin, så der er indsamlet i medier, der indeholder 5% føtalt kalveserum i phenol red-gratis DMEM., Cellerne blev forgyldt på 50,000 celler/godt ind i poly-l-lysin-coatede 96-brønds hvide plader og inkuberes i 24 timer. For både mætning og kinetiske BRET analyser, med to filtre, der blev brugt til samtidigt at måle den korte og den lange bølgelængde luminescens, der svarer til udledningen bølgelængder af donor-og acceptor-molekyler, hhv.
For real-time ligand association kinetik eksperimenter, medierne blev fjernet fra cellerne, som derefter inkuberes med 50 µL/brønd på NanoLuc substrat furimazine til en endelig koncentration på 10 µM, der er fortyndet i Hank ‘ s Balanced Salt Solution (HBSS)., Cellerne blev derefter ækvilibreret i CLARIOstar-pladelæseren (BMG Labtech, Australien) i 5 minutter for at registrere basale aflæsninger. De ligander (TAMRA-FONDEN, FITC-melittin, og FITC–DEDE-melittin) blev derefter tilføjet til en række korrekte endelige koncentrationer, og NanoBRET optagelser taget alle 90 s for 60 min ved 37 °C. For mætning eksperimenter, medierne blev fjernet fra cellerne, og en række koncentrationer af TAMRA-FONDEN, FITC-melittin, og FITC–DEDE-melittin tilføjet i tilstedeværelsen eller fraværet af en konkurrerende koncentration (1 µM) af være uden navn EGF og inkuberes ved 37 °C i op til 60 min i mørke., Furima .in blev tilsat ved en slutkoncentration på 10 µM. Optagelser blev lavet ved hjælp af LUMIstar omega (BMG Labtech, Australien). Data præsenteres som” RA.BRET ratio”, der stammer fra forholdet mellem langbølgelængdemissionen (acceptor) over kortbølgelængdemissionen (donor). Eksperimenter blev udført i biologiske replikater (n = 3).
Analyse af kombineret bivirkninger
Honeybee venom eller melittin blev kombineret med docetaxel og administreres ved de koncentrationer, der er angivet i en nonconstant forhold i T11 celler i 24 timer., Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af CellTiter-Glo som tidligere nævnt. Den kombinerede effekt af honningbien gift eller melittin med docetaxel blev vurderet af median dosis-effekt metode ved hjælp af CompuSyn Software (ComboSyn). Denne metode afgør, at en CI baseret på effekten af en kombination mellem to agenter (hvor CI < 1 er synergistiske, CI > 1 er antagonistiske, og CI = 1 er additiv)56. Eksperimenter blev udført i biologiske replikater (n = 3).,
dyremodel og behandlinger
disse dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af UAA ‘ s Dyreetikudvalg. For at simulere en avanceret model af claudin-lav brystkræft, 2.5 × 105 T11 celler blev suspenderet i serum-gratis medier og BD Matrigel Matrix Høj Koncentration (BD Bioscience) i forholdet 1:1 til et samlet volumen på 100 µL og injiceres subkutant i flankerne af 5-uge-gamle BALB/cJ kvinder (Dyr Ressourcer Center, WA, Australien) ved hjælp af en 26-G nål., De anvendte T11-celler blev lentiviralt transduceret med constructsgreen-luciferase-konstruktionen og sorteret tre gange for at opnå en berigelse, der var bedre end 99% af luciferase-positive celler. Melittin blev suspenderet i Milli-water vand + 5% de .trose. Docetaxel (i pulverform) var suspenderet i 25% TWEEN 80 (Sigma-Aldrich), og 75% af en blanding af 15.25:84.75 (v/v) opløsning af absolut ethanol og renset vand og opbevares ved -20 °C. Umiddelbart før de behandlinger, docetaxel var frisk fortyndet i Milli-Q vand + 5% dextrose på den ønskede endelige koncentration., Tre dage efter genereringen af T11-tumorer (~50 mm3) blev mus randomiseret i 4 grupper (n = 12 mus/gruppe). De behandlinger, der blev injiceret intratumorally på dage, 3, 5, 7, 9, 11, 13, og 15 indlæg podning af T11-celler, med køretøjet, melittin (5 mg/kg), docetaxel (7 mg/kg), eller en kombination af melittin (5 mg/kg) og docetaxel (7 mg/kg). Dyr blev overvåget for tumorstørrelse hver 2. dag og mængder beregnet ved den modificerede ellipsoidformel (volumen = bredde2.længde/2). Dyr blev humant ofret, da tumorerne nåede 800 mm3.,
immunhistokemisk analyse af tumorer
tumorvæv blev fikseret i 4% paraformaldehyd, vasket tre gange i PBS og efterladt i 70% ethanol. Tumorer blev indlejret i paraffin, og 5-µm sektioner blev fremstillet. For hematoxylin/eosin farvning, slides var afvoksede, hydreret ved hjælp af en faldende løsning bank af ethanol, der er farvet med Gill ‘ s hematoxylin, dehydreret bruge 70% ethanol, der er farvet med eosin, yderligere dehydreret med 100% ethanol, ryddet ved hjælp af toluen og monteret i coverslips hjælp Acrymount IHC montering medier (StatLab)., Tumorcelle-apoptose blev bestemt i vævssektioner ved TUNEL-assay (In Situ-Celledøddetekteringssæt, Roche).
Bioluminescens billedbehandling
til præcist At spore ændringer i in vivo tumor vækst med de behandlinger, vi udfører bioluminescens analysen ved hjælp af en Skydelære IVIS Lumina II imaging system på CMCA, UWA. Analyserne blev udført hver 2. dag efter dannelsen af tumorer. Mus blev injiceret intraperitonealt med 200 µL D-Luciferin (Cayman Chemical) i den endelige koncentration på 150 mg/kg opløst i PBS, inden de blev bedøvet ved 4% isofluran., Når de var bedøvet, blev mus anbragt inde i det forvarmede kammer i bioluminescensbilledet og afbildet 7-12 minutter efter injektion under 2% isofluran, indtil bioluminescenssignalintensiteten havde nået en stabil tilstand.
statistisk analyse
alle data blev afledt af flere eksperimenter udført i det mindste i tre eksemplarer. Statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism V8 (GraphPad Soft .are Inc .), Office 365 (Microsoft), og SPSS Predictive Analytics Software (IBM, Version 26)., For cellelevedygtighedsanalyserne blev data normaliseret til den gennemsnitlige luminescens af køretøjets tilstand, som blev betragtet som 100% levedygtighed, med IC50 ‘ erne afledt i GraphPad prisme. For immunhistokemi i de behandlede T11-tumorer til påvisning af p – HER2 (Tyr1248) og p-EGFR (Tyr1068) blev køretøjet normaliseret til 100%., Hvor det er relevant, og som nævnt i hovedteksten, statistiske signifikans blev bestemt ved hjælp af uparrede to-halet Student ‘s t-tests, uparret en-vejs ANOVA med Tyrkiet’ s HSD post-hoc test korrektion for multiple sammenligninger, to-vejs VARIANSANALYSE med gentagne målinger efterfulgt af Sidak eller Tyrkiet er flere-sammenligning test, eller en generaliseret lineær model (GLM). For alle prøver, forskelle, der blev anset som signifikant på p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), og p < 0.001 (***).,
Rapporteringsoversigt
yderligere oplysninger om forskningsdesign er tilgængelige i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.
Leave a Reply