mätning av bakteriernas tillväxttakt är en grundläggande mikrobiologisk teknik och har utbredd användning inom såväl grundforskning som inom jordbruks-och industritillämpningar.
bakterier är bland de mest rikliga livsformerna på jorden, som är närvarande i alla ekosystem, inklusive människokroppen. Vissa bakteriearter är också genetiskt mycket traktabla och har utnyttjats som forskningsmodeller eller för att producera naturliga eller syntetiska produkter i industriell skala., Men inte alla bakteriearter kan odlas i labbet. För dem som kan är en viktig egenskap multiplikationshastigheten eller ”tillväxtkinetik”.
mätning av bakteriekulturens tillväxttakt kan informera forskare om deras fysiologiska och metaboliska funktioner, och är också användbar för att erhålla ett exakt cellnummer av bakterierna för nedströmsapplikationer.,
den här videon kommer att introducera principerna bakom analys av bakterietillväxt, visa ett protokoll för att karakterisera tillväxttakten med en ”tillväxtkurva” och slutligen utforska flera miljövetenskapliga applikationer för mätning av bakterieväxtkinetik.
bakterier reproducerar i allmänhet asexuellt, multipliceras med enkel binär fission där en föräldracell delas upp i två identiska dotterceller., Under gynnsamma tillväxtförhållanden där näringsämnen finns i överflöd och miljöparametrar som temperatur bidrar alla till tillväxt, överstiger multiplikationshastigheten långt dödsgraden. Detta resulterar i exponentiell tillväxt.
genom att mäta mängden bakterier i en kultur som en funktion av tiden kan en tillväxtkurva erhållas. Växande bakterier i en flytande kultur under optimala förhållanden ger en tillväxtkurva med en karakteristisk form som kan delas in i olika faser., Kurvan börjar med en ”lagfas”, när tillväxten är långsam medan bakterierna blir acklimatiserade till odlingsförhållandena. Nästa är” log ”eller” exponentiell fas”, när bakterierna upplever exponentiell tillväxt. Tillväxt stannar så småningom när näringsämnen blir utarmade och avfallsprodukter ackumuleras, vilket resulterar i en ”stationär fas”. Slutligen, när graden av multiplikation är överkörd av celldöd, går kulturen in i”dödsfasen”.,
för att konstruera en tillväxtkurva räknas bakterietal i en kolv med flytande kultur vid olika tidpunkter under en viss odlingsperiod. Bakterietal kan erhållas med ett antal olika metoder. Ett vanligt tillvägagångssätt är att mäta optisk densitet-eller ” od ” – 600, vilket är bakterielösningens absorbansen av ljus vid en våglängd av 600 nm.
en annan metod är att bestämma ”CFU”, eller kolonibildande enheter, per milliliter av kulturen., På grund av bakterietillväxtens klonala natur kan en bakterie i en kultur teoretiskt expandera till en observerbar koloni på en agarplatta. Genom att placera en serie utspädningar av en bakteriekultur för att nå en bakteriekoncentration där individuella, diskreta kolonier kan observeras, en metod som kallas ”seriell utspädningsplatering”, kan koloniantalet användas för att beräkna bakteriekoncentrationen i termer av CFU per mL.,
nu när du förstår hur bakteriell tillväxt kan analyseras, låt oss gå igenom ett protokoll för att genomföra tillväxtkurvananalys på rena kulturer av en väletablerad bakteriemodell, Escherichia coli, med hjälp av den seriella utspädningsplateringsmetoden.
en dag före tidpunktsuppsamlingen, ympade 20 mL försteriliserad trypticas sojabuljong eller TSB, medium i en 50 mL kolv med en enda koloni av E. coli.
inkubera kulturen över natten vid 37 ° C med skakning. För E. coli skulle detta resultera i en stationär faspopulation på cirka 109 CFU/mL.,
Följande dag vaccineras 100 µL över natten till 250 mL TSB i en 500 mL kolv. Blanda noggrant. Detta ger en utspädd kultur på cirka 4 x 105 CFU / mL. Förvara 5 mL av denna utspädda kultur i ett kulturrör. Detta är alikvot från tidpunkt 0, eller T0. Kyl omedelbart vid 4 ° C.
inkubera den återstående volymen av odlingen vid 37 ° C med skakning. Vid varje timme efteråt i upp till 8 h, samla 5 mL alikvot från kulturen. Beteckna dessa prov T1 till T8 och förvara dem alla vid 4 °C tills de används.,
på experimentets dag, ta bort E. coli-tidpunkten alikvoter från kylskåpet och håll dem på is. Använd sterila mikrofugerör, var och en med 900 µL steril saltlösning, för att upprätta en utspädningsserie för varje alikvot enligt följande tabell.
blanda T0-kulturen väl genom att försiktigt virvla, tillsätt sedan 100 µL till rör A i utspädningsserien, vilket gör en 1-in-10 eller 10-1 utspädning. Virvelrör A för att blanda, och med en ny pipettspets, tillsätt 100 µL rör A till rör B, vilket gör 1-in-100 eller 10-2 utspädning.,
upprepa processen för varje kultur alikvot och gör lämpliga utspädningsserier enligt Tabell 2. När utspädningsserien för alla tidpunktsprover har gjorts, har lämpligt antal sterila trypticas sojaagarplattor förberedda för bakteriell plätering.
3 utspädningar av varje tidpunktskultur kommer att pläteras i tre exemplar enligt följande tabell. Märk plattorna därefter. Pipettera sedan 100 µL av varje lämpligt utspädd kultur på mitten av respektive agarplatta., Flame-sterilisera en ” L ” – formad glasstav, kyla genom att röra stången till agar bort från inokulatet och sprida omedelbart vätskan över agarytan. Observera att en fördröjning i spridningen kan leda till bakteriell överväxt på platsen för ympningen.
Fortsätt plätera varje utspädningsserie för alla 9 tidpunktskulturer, flamsterilisera glasspridningsstången mellan varje utspädningsserie.
när plattorna har fått torka i några minuter, invertera och placera dem i inkubatorn 37 °C över natten. Efter denna tillväxtperiod kan plattor lagras vid 4 ° C.,
efter inkubation över natten av utspädningsplattorna, undersöka dem för kontaminering och enhetlighet av kolonier. För varje tidpunktskultur, välj en utspädning för vilken det finns mellan 30-300 kolonier per platta. Räkna antalet kolonier på var och en av trepartsplattorna för denna utspädning.
beräkna koncentrationen av bakterier i den ursprungliga odlingen vid varje tidpunkt i cfu / mL med hjälp av det genomsnittliga antalet kolonier för varje utspädning och utspädningsfaktorn. Till exempel, om det finns i genomsnitt 30 kolonier från triplicatplattan som erhållits från 0.,1 mL av 10-4, eller 1-i-10,000, utspädning, då skulle det finnas 30 dividerat med 0.1 mL multiplicerat med 10,000, eller 3 miljoner CFU/mL.
med användning av den bakteriekoncentration som beräknas för varje tidpunkt, rita ett diagram över basen-10 loggen av bakteriekoncentrationerna, i cfu / mL, mot tiden i timmar. Ur diagrammet, identifiera loggfasen av tillväxten av den ursprungliga bakteriekulturen och välj två av tidpunkterna inom loggfasen, och beteckna den första av dessa tidpunkter som t = 0., Beräkna den genomsnittliga generationstiden med hjälp av ekvationen X är lika med 2 till kraften av n multiplicerat med X0 där X är bakteriekoncentrationen vid tiden t, X0 är den ursprungliga koncentrationen vid t= 0, och n är antalet generationer som har förflutit mellan de två tidpunkterna.
anta till exempel att X0 är 1000 CFU/mL, och vid t = 6 h är koncentrationen 16 000 cfu/mL. Med hjälp av ekvationen får vi att 4 generationer har inträffat inom 6 h, vilket ger en generationstid på 6 dividerat med 4 eller 1,5 h per generation.,
mätning av bakterietillväxt kinetik är grundläggande för många tillämpningar för forskning, jordbruk eller bioengineering ändamål.
en användning för att känna till bakterietillväxthastigheten är att tillåta att en exakt mängd av en bakteriekultur erhålls för att ympa en annan kultur eller ett annat medium. Till exempel måste vissa grödor, såsom baljväxter, odlas med symbiotiska bakterier som kallas rhizobia som koloniserar växternas rötter för att bilda knölar och ”fixa” kväveomvandlande atmosfäriskt kväve till ammoniak som kan utnyttjas av växten., För jordbruksapplikationer tillsätts en känd mängd rhizobi till ett torvbaserat kolmedium, som sedan används för att ympa baljväxtfrön för att fastställa växtens bakteriella symbios.
Tillväxtanalys kan också användas för att identifiera bakteriearter som kan försämra industriavfall och eventuellt generera värdefulla biprodukter. I det här exemplet undersökte forskare hur Tillväxtmedier kompletterade med svartlut, en avfallsprodukt från trämassa och pappersproduktion, påverkade tillväxten av ett miljömikrobialisolat.,
bakterierna visade inte bara ökad tillväxt med svartlut, men visade också ett ”difasiskt” tillväxtmönster, vilket indikerar närvaron av mer än en kolkälla i svartlut som bakterierna kan metabolisera. Individuella komponenter av svartlut kan sedan extraheras för mer detaljerad Tillväxtanalys.
slutligen är tillväxttaktmätningar också användbara för att karakterisera bakterier som har konstruerats för särskilda industriella ändamål, till exempel för sanering av oljeföroreningar., Här skapade forskare genetiskt konstruerade bakteriestammar som innehåller enzymer för att försämra kolvätekomponenterna i olja. Tillväxtanalys utfördes till exempel för att verifiera att de konstruerade bakterierna har ökat tillväxttakten än normala bakterier i närvaro av giftiga kolväten, vilket indikerar förbättrad tolerans som gör det möjligt för de konstruerade bakterierna att utföra sin föroreningsrensningsfunktion.
Du har just tittat på joves video om att analysera bakterietillväxthastigheter med tillväxtkurvor., Du bör nu förstå bakteriekulturens olika tillväxtfaser, hur man utför ett experiment för att få en tillväxtkurva med hjälp av tidpunktsuppsamling och serieutspädning och hur Tillväxtanalys kan tillämpas på forskning och industriella ändamål. Som alltid, tack för att titta på!
Leave a Reply