La medición de la tasa de crecimiento de bacterias es una técnica microbiológica fundamental, y tiene un uso generalizado en la investigación básica, así como en aplicaciones agrícolas e industriales.
Las bacterias se encuentran entre las formas de vida más abundantes en la Tierra, estando presentes en todos los ecosistemas, incluido el cuerpo humano. Ciertas especies bacterianas también son genéticamente altamente manejables, y se han aprovechado como modelos de investigación o para producir productos naturales o sintéticos a escala industrial., Sin embargo, no todas las especies bacterianas se pueden cultivar en el laboratorio. Para aquellos que pueden, Una característica importante es la tasa de multiplicación, o «cinética de crecimiento».
La medición de la tasa de crecimiento de un cultivo bacteriano puede informar a los científicos sobre sus funciones fisiológicas y metabólicas, y también es útil para obtener un número preciso de células de las bacterias para aplicaciones posteriores.,
este video presentará los principios detrás del análisis de la tasa de crecimiento bacteriano, demostrará un protocolo para caracterizar la tasa de crecimiento con una «curva de crecimiento» y, finalmente, explorará varias aplicaciones de la ciencia ambiental para medir la cinética de crecimiento bacteriano.
Las bacterias generalmente se reproducen asexualmente, multiplicándose por fisión binaria simple donde una célula parental se divide en dos células hijas idénticas., Bajo condiciones favorables de crecimiento donde los nutrientes están disponibles en abundancia y los parámetros ambientales como la temperatura son todos propicios para el crecimiento, la tasa de multiplicación supera con creces la tasa de mortalidad. Esto resulta en un crecimiento exponencial.
midiendo la cantidad de bacterias en un cultivo en función del tiempo, se puede obtener una curva de crecimiento. El crecimiento de bacterias en un cultivo líquido en condiciones óptimas produce una curva de crecimiento con una forma característica que se puede dividir en varias fases., La curva comienza con una» fase de retraso», cuando el crecimiento es lento mientras las bacterias se aclimatan a las condiciones de cultivo. El siguiente es el » log » o «fase exponencial», cuando las bacterias experimentan un crecimiento exponencial. El crecimiento eventualmente se detiene una vez que los nutrientes se agotan y los productos de desecho se acumulan, lo que resulta en una «fase estacionaria». Finalmente, una vez que la tasa de multiplicación es superada por la tasa de muerte celular, el cultivo entra en la «fase de muerte».,
para construir una curva de crecimiento, los números bacterianos en un frasco de cultivo líquido se cuentan en diferentes momentos durante un cierto período de cultivo. Los recuentos bacterianos se pueden obtener por varios métodos diferentes. Un enfoque común es medir la densidad óptica – u» OD » – 600, que es la absorbancia de luz de la solución bacteriana a una longitud de onda de 600 nm.
otro método es determinar la «UFC», o unidades formadoras de colonias, por mililitro del cultivo., Debido a la naturaleza clonal del crecimiento bacteriano, una bacteria en un cultivo puede teóricamente expandirse en una colonia observable en una placa de agar. Al platear una serie de diluciones de un cultivo bacteriano para alcanzar una concentración bacteriana donde se pueden observar colonias individuales y discretas, un método llamado «plating de dilución en serie», el recuento de colonias se puede usar para calcular la concentración bacteriana en términos de UFC por mL.,
ahora que entiende cómo se puede analizar el crecimiento bacteriano, pasemos por un protocolo para realizar el análisis de la curva de crecimiento en cultivos puros de un modelo bacteriano bien establecido, Escherichia coli, utilizando el método de recubrimiento de dilución en serie.
un día antes de la recogida, inocular 20 mL de caldo de soja tripticasa preesterilizado, o TSB, en un matraz de 50 mL con una sola colonia de E. coli.
incubar el cultivo durante la noche a 37 °C con agitación. Para E. coli, esto daría lugar a una población en fase estacionaria de aproximadamente 109 UFC / mL.,
al día siguiente, inocular 100 µL del cultivo nocturno en 250 mL de TSB en un matraz de 500 mL. Mezclar bien. Esto produce un cultivo diluido de aproximadamente 4 x 105 UFC / mL. Almacene 5 mL de este cultivo diluido en un tubo de cultivo. Esta es la alícuota del punto de tiempo 0, o T0. Refrigerar inmediatamente a 4 °c.
incubar el volumen restante del cultivo a 37 °C con agitación. Después, cada hora durante un máximo de 8 h, recoger alícuotas de 5 mL del cultivo. Designe estas muestras de T1 A T8 y guárdelas todas a 4 °C hasta su uso.,
el día del experimento, retire las alícuotas de punto de tiempo de E. coli del refrigerador y manténgalas en hielo. Utilizar tubos de microfusión estériles, cada uno con 900 µL de solución salina estéril, para establecer una serie de dilución para cada alícuota de acuerdo con la tabla siguiente.
mezcle bien el cultivo T0 haciendo un vórtice suave, luego agregue 100 µL al tubo A de su serie de dilución, haciendo una dilución 1 en 10 o 10-1. Tubo de vórtice A para mezclar, y usando una punta de pipeta fresca, agregue 100 µL de tubo A al tubo B, haciendo la dilución 1 en 100, o 10-2.,
repetir el proceso para cada alícuota de cultivo y realizar la serie de dilución adecuada según la Tabla 2. Una vez que se haya realizado la serie de dilución para todas las muestras de punto de tiempo, tenga el número apropiado de placas de agar de soja tripticasa estériles preparadas para el recubrimiento bacteriano.
3 diluciones de cada cultivo de punto de tiempo se chaparán por triplicado de acuerdo con la siguiente tabla. Etiquete las placas en consecuencia. A continuación, pipetee 100 µL de cada cultivo diluido adecuadamente en el Centro de la placa de agar correspondiente., Llama-esterilizar una barra de vidrio en forma de «L», enfriar tocando la barra al agar lejos del inóculo, y difundir inmediatamente el líquido sobre la superficie de agar. Tenga en cuenta que un retraso en la propagación podría resultar en un sobrecrecimiento bacteriano en el lugar de la inoculación.
continúe plateando cada serie de dilución para los 9 cultivos de punto de tiempo, esterilizando la varilla de expansión de vidrio entre cada serie de dilución.
una vez que las placas se hayan dejado secar durante unos minutos, invierta y colóquelas en la incubadora de 37 °C durante la noche. Después de este período de crecimiento, las placas se pueden almacenar a 4 °C.,
después de la incubación nocturna de las placas de dilución, examínelas en busca de contaminación y uniformidad de las colonias. Para cada cultivo de punto de tiempo, elija una dilución para la que haya entre 30-300 colonias por placa. Cuente el número de colonias en cada una de las placas triplicadas para esa dilución.
utilizando el número medio de colonias para cada dilución y el factor de dilución, calcular la concentración de bacterias en el cultivo original en cada momento en UFC/mL. Por ejemplo, si hay en promedio 30 colonias del conjunto de placas triplicadas obtenidas a partir de 0.,1 mL de la dilución 10-4, o 1 en 10.000, entonces habría 30 dividido por 0,1 mL multiplicado por 10.000, o 3 millones de UFC / mL.
utilizando la concentración bacteriana calculada para cada punto de tiempo, trazar un gráfico de la base-10 log de las concentraciones bacterianas, en UFC/mL, contra el tiempo en horas. A partir del gráfico, identifique la fase logarítmica de crecimiento del cultivo bacteriano original y elija dos de los puntos de tiempo dentro de la fase logarítmica, designando el primero de estos puntos de tiempo como t = 0., Calcular el tiempo medio de generación utilizando la ecuación X es igual a 2 a la potencia de n multiplicado por X0 donde X es la concentración bacteriana en el tiempo t, X0 es la concentración inicial en t = 0 , y n es el número de generaciones que ha transcurrido entre los dos puntos de tiempo.
por ejemplo, supongamos que X0 es 1.000 UFC / mL, y en t = 6 h, la concentración es de 16.000 UFC/mL. Usando la ecuación, obtenemos que 4 generaciones han ocurrido dentro de 6 h, lo que da un tiempo de generación de 6 dividido por 4 o 1.5 h por generación.,
La medición de la cinética de crecimiento bacteriano es fundamental para muchas aplicaciones con fines de investigación, agricultura o Bioingeniería.
un uso para conocer la tasa de crecimiento bacteriano es permitir que se obtenga una cantidad precisa de un cultivo bacteriano para inocular otro cultivo o medio. Por ejemplo, ciertos cultivos, como las leguminosas, deben cultivarse con bacterias simbióticas conocidas como rizobias que colonizan las raíces de las plantas para formar nódulos y «fijar» nitrógeno, convirtiendo el nitrógeno atmosférico en amoníaco que puede ser utilizado por la planta., Para aplicaciones agrícolas, se agrega una cantidad conocida de rizobia a un medio de carbono a base de turba, que luego se usa para inocular semillas de leguminosas para establecer la simbiosis planta-bacteria.
El análisis de crecimiento también se puede utilizar para identificar especies bacterianas que pueden degradar los desechos industriales y posiblemente generar subproductos valiosos. En este ejemplo, los investigadores investigaron cómo los medios de cultivo complementados con licor negro, un producto de desecho de la producción de pulpa de madera y papel, afectaron el crecimiento de un aislado microbiano ambiental.,
Las bacterias no solo demostraron un mayor crecimiento con licor negro, sino que también mostraron un patrón de crecimiento» difásico», lo que indica la presencia de más de una fuente de carbono en el licor negro que las bacterias pueden metabolizar. Los componentes individuales del licor negro podrían extraerse para un análisis de crecimiento más detallado.
finalmente, las mediciones de la tasa de crecimiento también son útiles para caracterizar bacterias que han sido diseñadas para fines industriales particulares, por ejemplo, para la remediación de la contaminación por petróleo., Aquí, los científicos crearon cepas bacterianas genéticamente modificadas que contienen enzimas para degradar los componentes hidrocarbonados del aceite. Se realizó un análisis de crecimiento, por ejemplo, para verificar que las bacterias diseñadas han aumentado la tasa de crecimiento que las bacterias normales en presencia de hidrocarburos tóxicos, lo que indica una mejor tolerancia que permitirá que las bacterias diseñadas realicen su función de limpieza de la contaminación.
acabas de ver el video de JoVE sobre el análisis de las tasas de crecimiento bacteriano con curvas de crecimiento., Ahora debe comprender las diferentes fases de crecimiento de los cultivos bacterianos, cómo realizar un experimento para obtener una curva de crecimiento utilizando la recolección de puntos de tiempo y el recubrimiento de dilución en serie, y cómo el análisis de crecimiento se puede aplicar a fines industriales y de investigación. Como siempre, gracias por mirar!
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