A Medição da taxa de crescimento das bactérias é uma técnica microbiológica fundamental, e tem uso generalizado na pesquisa básica, bem como em aplicações agrícolas e industriais.as bactérias estão entre as formas de vida mais abundantes na Terra, estando presentes em todos os ecossistemas, incluindo o corpo humano. Certas espécies bacterianas são também geneticamente altamente tratáveis e têm sido utilizadas como modelos de investigação ou para produzir produtos naturais ou sintéticos à escala industrial., No entanto, nem todas as espécies bacterianas podem ser cultivadas no laboratório. Para aqueles que podem, Uma característica importante é a taxa de multiplicação, ou “cinética de crescimento”.A Medição da taxa de crescimento de uma cultura bacteriana pode informar os cientistas sobre suas funções fisiológicas e metabólicas, e também é útil para obter um número preciso de células das bactérias para aplicações a jusante.,este vídeo irá introduzir os princípios por trás da análise da taxa de crescimento bacteriano, demonstrar um protocolo para caracterizar a taxa de crescimento com uma “curva de crescimento”, e, finalmente, explorar várias aplicações de ciência ambiental para medir a cinética de crescimento bacteriano.as bactérias geralmente reproduzem-se assexuadamente, multiplicando-se pela fissão binária simples onde uma célula parental se divide em duas células filhas idênticas., Sob condições de crescimento favoráveis, onde os nutrientes estão disponíveis em abundância e parâmetros ambientais, como a temperatura, são todos conducentes ao crescimento, a taxa de multiplicação excede em muito a taxa de mortalidade. Isto resulta em crescimento exponencial.pode obter-se uma curva de crescimento através da medição da quantidade de bactérias numa cultura em função do tempo. O crescimento de bactérias em uma cultura líquida em condições ótimas produz uma curva de crescimento com uma forma característica que pode ser dividida em várias fases., A curva começa com uma” fase de lag”, quando o crescimento é lento, enquanto as bactérias se adaptam às condições de cultura. Em seguida, o “log” ou “fase exponencial”, quando as bactérias experimentam crescimento exponencial. O crescimento eventualmente pára quando os nutrientes se esgotam e os resíduos se acumulam, resultando em uma “fase estacionária”. Finalmente, uma vez que a taxa de multiplicação é ultrapassada pela taxa de morte celular, a cultura entra na “fase de morte”.,
para construir uma curva de crescimento, o número de bactérias num frasco de cultura líquida é contado em diferentes pontos temporais ao longo de um determinado período de cultura. As contagens bacterianas podem ser obtidas por vários métodos diferentes. Uma abordagem comum é medir a densidade óptica – ou” OD ” – 600, que é a absorvância de luz da solução bacteriana em um comprimento de onda de 600 nm.
outro método é determinar a” UFC”, ou unidades formadoras de colónias, por mililitro da cultura., Devido à natureza clonal do crescimento bacteriano, uma bactéria em uma cultura pode teoricamente expandir-se em uma colônia observável em uma placa de ágar. Por chapeamento de uma série de diluições de uma cultura bacteriana para chegar a uma concentração bacteriana onde individuais, discreto colônias pode ser observado, um método chamado de “diluição em série de placas”, a colônia de contagem pode ser usado para fazer-se calcular a concentração bacteriana em termos de UFC por mL.,
Agora que você entende como o crescimento bacteriano pode ser analisado, vamos passar por um protocolo para a realização de análise da curva de crescimento em culturas puras de um modelo bacteriano bem estabelecido, Escherichia coli, usando o método de revestimento de diluição em série.num balão de 50 mL com uma única colónia de E. coli, inocular 20 mL de caldo de soja tripticase pré-esterilizado, ou TSB, um dia antes da colheita do ponto Temporal.incubar a cultura durante a noite a 37 ° C com agitação. Para a E. coli, isto resultaria numa população em fase estacionária de aproximadamente 109 UFC / mL.,no dia seguinte, inocular 100 µL de cultura nocturna em 250 mL de TSB num balão de 500 mL. Misture cuidadosamente. Isto produz uma cultura diluída de aproximadamente 4 x 105 UFC / mL. Conservar 5 mL desta cultura diluída num tubo de cultura. Esta é a alíquota do ponto de tempo 0, ou T0. Refrigerar imediatamente a 4 °c.
incubar o volume restante da cultura a 37 °C com agitação. A cada hora que se segue até às 8 h, recolher alíquotas de 5 mL da cultura. Designar estas amostras T1 A T8 e armazená-las a 4 °C até à sua utilização.,no dia da experiência, retire as alíquotas dos pontos temporais de E. coli do frigorífico e mantenha-as em gelo. Utilizar tubos de microfuge esterilizados, cada um com 900 µL de solução salina estéril, para estabelecer uma série de diluição para cada alíquota de acordo com o quadro seguinte.misture bem a cultura T0 através de um vórtice suave, adicionando então 100 µL ao tubo a da sua série de diluição, fazendo uma diluição de 1 em 10 ou 10-1. Tubo de vórtice a para misturar, e utilizando uma ponta de pipeta fresca, adicionar 100 µL do tubo a ao tubo B, fazendo a diluição de 1 em 100 ou 10-2.,repetir o processo para cada alíquota de cultura e fazer as séries de diluição adequadas de acordo com o quadro 2. Uma vez feitas as séries de diluição para todas as amostras do ponto Temporal, ter o número adequado de placas de ágar de soja tripticase esterilizadas preparadas para revestimento bacteriano.
3 diluições de cada cultura de ponto Temporal serão revestidas em triplicado de acordo com a tabela seguinte. Rotular as placas de acordo. Em seguida, pipetar 100 µL de cada cultura adequadamente diluída no centro da respectiva placa de ágar., Esterilizar uma haste de vidro em forma de “L”, arrefecer tocando a haste ao ágar longe do inóculo, e espalhar imediatamente o líquido sobre a superfície do ágar. Por favor, note que um atraso na propagação pode resultar em crescimento bacteriano excessivo no local da inoculação.continuar a revestir cada série de diluição para todas as 9 culturas de pontos temporais, esterilizando a haste de vidro entre cada série de diluição.uma vez que as placas tenham sido deixadas secar durante alguns minutos, invertê-las e colocá-las na incubadora de 37 °C durante a noite. Após este período de crescimento, as placas podem ser armazenadas a 4 °C.,após incubação das placas de diluição durante a noite, examiná-las-á para detectar a contaminação e a uniformidade das Colónias. Para cada cultura do ponto Temporal, escolher uma diluição para a qual existam entre 30-300 colónias por placa. Contar o número de colónias em cada uma das placas triplicadas para essa diluição.calcular a concentração de bactérias na cultura original em cada ponto Temporal em UFC/mL, utilizando o número médio de colónias para cada diluição e o factor de diluição. Por exemplo, se houver, em média, 30 colónias a partir da placa triplicada obtida a partir de 0.,1 mL da diluição 10-4 ou 1-em-10.000, então haveria 30 divididos por 0, 1 mL multiplicado por 10. 000, ou 3 milhões de ufc/mL.utilizando a concentração bacteriana calculada para cada ponto Temporal, traçar um gráfico da base-10 log das concentrações bacterianas, em UFC/mL, contra o tempo em horas. A partir do grafo, identificar a fase log de crescimento da cultura bacteriana original e escolher dois dos pontos de Tempo dentro da fase log, designando o primeiro desses pontos de tempo como t = 0., Calcular o tempo de geração médio usando a equação X é igual a 2 para a potência de n multiplicada por X0, onde X é a concentração bacteriana no tempo t, X0 é a concentração inicial em t = 0, e n é o número de gerações que decorreram entre os dois pontos de tempo.
por exemplo, suponha que X0 seja 1.000 UFC/mL, e em t = 6 h, a concentração é de 16. 000 UFC / mL. Usando a equação, obtemos que 4 gerações ocorreram dentro de 6 h, o que dá um tempo de geração de 6 dividido por 4 ou 1,5 h por geração.,A Medição da cinética de crescimento bacteriano é fundamental para muitas aplicações para fins de pesquisa, agricultura ou Bioengenharia.
uma utilização para conhecer a taxa de crescimento bacteriano é permitir uma quantidade precisa de uma cultura bacteriana a ser obtida para inocular outra cultura ou meio. Por exemplo, certas culturas, como leguminosas, precisam ser cultivadas com bactérias simbióticas conhecidas como rhizobia que colonizam as raízes das plantas para formar nódulos e “fixar” nitrogênio – convertendo nitrogênio atmosférico em amônia que pode ser utilizado pela planta., Para aplicações agrícolas, uma quantidade conhecida de rizobia é adicionada a um meio de carbono à base de turfa, que é então usado para inocular sementes de leguminosas para estabelecer a simbiose vegetal-bacteriana.a análise de crescimento também pode ser usada para identificar espécies bacterianas que podem degradar resíduos industriais e possivelmente gerar subprodutos valiosos. Neste exemplo, pesquisadores investigaram como os meios de crescimento complementados com licor preto, um produto de resíduos de pasta de madeira e produção de papel, afetou o crescimento de um isolado microbiano ambiental.,
a bactéria não só demonstrou aumento do crescimento com licor negro, mas também mostrou um padrão de crescimento “difásico”, indicando a presença de mais de uma fonte de carbono em licor negro que a bactéria pode metabolizar. Os componentes individuais do licor negro poderiam então ser extraídos para uma análise mais detalhada do crescimento.finalmente, as medições da taxa de crescimento também são úteis para caracterizar bactérias que foram projetadas para fins industriais específicos, por exemplo, para a recuperação da poluição por hidrocarbonetos., Aqui, os cientistas criaram estirpes bacterianas geneticamente modificadas que contêm enzimas para degradar os componentes de hidrocarbonetos do petróleo. A análise de crescimento foi realizada, por exemplo, para verificar que a bactéria projetada aumentou a taxa de crescimento do que as bactérias normais na presença de hidrocarbonetos tóxicos, indicando maior tolerância que permitirá que as bactérias projetadas para executar sua função de limpeza da poluição.acabou de ver o vídeo do JoVE a analisar as taxas de crescimento bacteriano com curvas de crescimento., Você deve agora entender as diferentes fases de crescimento das culturas bacterianas, como realizar um experimento para obter uma curva de crescimento usando a coleta de pontos de tempo e revestimento de diluição em série, e como a análise de crescimento pode ser aplicada à pesquisa e propósitos industriais. Como sempre, obrigado por assistir!
Leave a Reply