Mittaus kasvuvauhti bakteerit on keskeinen mikrobiologiset tekniikka, ja on laajalti käyttää perustutkimukseen sekä maatalouden ja teollisuuden sovelluksiin.
bakteerit kuuluvat maapallon runsaimpiin eliömuotoihin, joita esiintyy jokaisessa ekosysteemissä, myös ihmiselimistössä. Tietyt bakteeri-lajit ovat myös geneettisesti erittäin mukautuva, ja on valjastettu kuten tutkimus-malleja tai tuottaa luonnollisia tai synteettisiä tuotteita teollisessa mittakaavassa., Kaikkia bakteerilajeja ei kuitenkaan voida viljellä laboratoriossa. Niille, jotka voivat, tärkeä ominaisuus on kertolaskun nopeus eli”kasvukinetiikka”.
Mittaus bakteeri-kulttuurin kasvu voi ilmoittaa tutkijat niiden fysiologisia ja metabolisia toimintoja, ja se on myös hyödyllistä saada tarkka solujen määrä bakteereja loppupään sovelluksiin.,
Tämä video esittelee periaatteet bakteerien kasvu analyysi, osoittaa, pöytäkirjan kuvaavat kasvuvauhti kanssa ”kasvukäyrä”, ja lopuksi, tutkia useita ympäristötiede sovelluksia, mittaus-bakteerien kasvun kinetiikkaan.
Bakteerit yleensä lisääntyvät suvuttomasti, kertomalla yksinkertainen binary fissio, jossa yksi vanhempien solu jakautuu kaksi samanlaista tytär soluja., Suotuisissa kasvuoloissa, joissa ravinteita on saatavilla runsaasti ja ympäristön parametrit, kuten lämpötila ovat kaikki omiaan kasvu, korko, joka saadaan kertomalla paljon suurempi kuolleisuus. Tämä johtaa eksponentiaaliseen kasvuun.
mittaamalla bakteerimäärän viljelmässä ajan funktiona saadaan kasvukäyrä. Kasvavat bakteerit neste kulttuuri optimaalisissa olosuhteissa tuottaa kasvua käyrä, jolla on tunnusomainen muoto, joka voidaan jakaa eri vaiheisiin., Käyrä alkaa ”lag-vaiheen”, kun kasvu on hidasta, kun bakteerit tulee totutettu kulttuuri ehtoja. Seuraava on ” log ”tai” eksponentiaalinen vaihe”, jolloin bakteerit kokevat eksponentiaalisen kasvun. Kasvu pysähtyy lopulta, kun ravinteet ehtyvät ja jätetuotteet kasautuvat, jolloin tuloksena on ”stationäärivaihe”. Nyt, kun korko saadaan kertomalla on ohittanut määrä solun kuoleman, kulttuuri siirtyy ”kuolema vaihe”.,
rakentaa kasvua käyrä -, bakteeri-numerot pulloon nestettä kulttuuri lasketaan eri ajankohtina yli tietyn ajan viljelemällä. Bakteerimäärät voidaan saada useilla eri menetelmillä. Yksi yleinen tapa on mitata optinen tiheys – tai ”OD” – 600, joka on bakteeri-ratkaisu on absorbanssi valon aallonpituudella 600 nm.
toinen menetelmä on määrittää ”PMY” eli yhdyskuntamuodostusyksiköt viljelmän millilitraa kohti., Koska klonaalinen luonne bakteerien kasvua, yksi bakteeri, viljely voi teoriassa laajentua yksi havaittavissa siirtomaa agar levy. Pinnoittamalla sarjan laimennokset bakteeri-kulttuuri päästä bakteeri pitoisuus, jossa yksittäisiä, erillisiä pesäkkeitä voi olla havaittu, menetelmää, jota kutsutaan ”serial laimennus pinnoitus”, colony count voidaan käyttää takaisin-laskea bakteerien pitoisuus kannalta PMY / mL.,
Nyt, että ymmärrät, miten bakteerien kasvua voidaan analysoida, mennään läpi protokolla suorittaa kasvukäyrä analyysi puhtaat viljelmät vakiintunut bakteeri-malli, Escherichia coli, käyttämällä serial laimennus pinnoitus menetelmä.
Yksi päivä ennen kuin aika kohta kokoelma, rokottaa 20 mL pre-steriloitu trypticase soy broth, tai TSB, medium 50 mL: n pulloon, jossa on yksi siirtomaa E. coli.
inkuboi kulttuuria yön yli 37 °C: ssa ravistamalla. E. coli-bakteerin osalta tämä johtaisi noin 109 PMY/mL: n stationäärifaasiväestöön.,
seuraava päivä, rokottaa 100 µL yön yli kulttuuri-250 mL: aan TSB-500 mL: n mittapulloon. Sekoita huolellisesti. Tämä tuottaa laimennetun viljelmän, joka on noin 4 x 105 PMY / mL. Säilytä 5 mL tätä laimennettua viljelmää viljelyputkessa. Tämä on määräosa aikapisteestä 0 eli T0. Säilytä jääkaapissa välittömästi 4 °C.
inkuboi loput viljelmän tilavuudesta 37 °C: ssa ravistamalla. Joka tunti sen jälkeen jopa 8 tunnin ajan, kerää 5 mL alikvotteja kulttuurista. Nimetään nämä näytteet T1-T8 ja säilytetään ne kaikki 4 ° C: ssa käyttöön asti.,
päivän kokeilu, poistaa E. coli ajankohtana alikvoottia jääkaapista ja pitää ne jäällä. Käytä steriilejä mikrofugiputket, kukin 900 µL steriiliä suolaliuosta, perustaa laimennus-sarja kunkin määräosan mukaan seuraavassa taulukossa.
Sekoita T0 kulttuurin hyvin varovasti vortexing, sitten lisätään 100 µL Putki On sen laimennoksen sarja, joten 1-10, tai 10-1 laimennus. Pyörreputki a sekoitetaan ja lisätään tuoretta pipetin kärkeä käyttäen 100 µL Putkea A putkeen B, jolloin saadaan 1-in-100 tai 10-2-laimennus.,
toista prosessi kunkin viljelmän osalta ja tee sopiva laimennussarja taulukon 2 mukaisesti. Kun laimennussarja on tehty kaikkien aikapistenäytteiden osalta, valmistakaa sopiva määrä steriilejä tryptikaasisoija-agar-levyjä bakteeripinnoitusta varten.
3 laimennosta kunkin aikapisteviljelmän pinnoitetaan kolmena kappaleena seuraavan taulukon mukaisesti. Merkitse levyt vastaavasti. Tämän jälkeen pipetoidaan 100 µL kutakin asianmukaisesti laimennettua viljelmää kunkin agar-levyn keskelle., Liekki-steriloida ”L”-muotoinen lasi sauva, viileä koskettaa sauva agar päässä siirrosainetta, ja välittömästi levitä nestettä yli agar-alustalle. Huomaa, että leviämisen viivästyminen voi johtaa bakteerien liikakasvuun rokotuspaikan kohdalla.
Jatka pinnoitus kukin laimennus-sarjan kaikki 9 ajankohtana kulttuureissa, liekki-sterilointia lasi levittää sauva jokaisen laimennoksen sarja.
kun levyjen on annettu kuivua muutaman minuutin ajan, käännä ja aseta ne yön yli 37 °C: n hautomoon. Tämän kasvukauden jälkeen levyt voidaan säilyttää 4 °C: ssa.,
kun laimennuslevyt on haudottu yön yli, tutkitaan ne kontaminaation ja pesäkkeiden yhdenmukaisuuden varalta. Valitse jokaisesta aikapisteviljelmästä laimennos, johon on 30-300 pesäkettä levyä kohden. Lasketaan kuhunkin kolmikantalevyyn kuuluvien siirtomaiden lukumäärä kyseistä laimennusta varten.
Käyttäminen tarkoittaa pesäkkeiden määrä jokaisesta laimennus-ja laimennuskerroin, laskea pitoisuus bakteerien alkuperäisen kulttuurin kunakin ajankohtana vuonna PMY/mL. Esimerkiksi, jos kolmikantalevysarjasta on keskimäärin 30 pesäkettä, jotka on saatu 0: sta.,1 mL 10-4-tai 1-in-10,000-laimennusta, sitten olisi 30 jaettuna 0,1 mL: lla kerrottuna 10,000: lla tai 3 miljoonalla PMY/mL.
Käyttämällä bakteerien pitoisuus laskettuna kunakin ajankohtana, tontti kuvaaja base-10 log bakteerien pitoisuudet, vuonna PMY/mL, suhteessa aikaan tunteina. Kuvaaja, tunnistaa kirjautuminen kasvuvaihe alkuperäinen bakteeri-kulttuuri ja poimia kaksi kertaa pistettä sisällä log-vaihe, nimetään ensimmäinen näistä ajankohtina t = 0., Laskea keskimääräinen sukupolven ajan käyttäen yhtälöä X = 2 potenssiin n kerrottuna X0, missä X on bakteeri pitoisuus hetkellä t, X0 on alkuperäisen pitoisuus, t = 0, ja n on määrä, että sukupolvien välillä on kulunut kaksi kertaa pistettä.
esimerkiksi, oletetaan, että X0 on 1000 PMY/mL, ja t = 6 h, pitoisuus oli 16 000 PMY/mL. Käyttämällä yhtälöä, saadaan, että 4 sukupolvea on tapahtunut 6 h, joka antaa sukupolven aika 6 jaettuna 4 tai 1.5 h per sukupolvi.,
bakteerien kasvukinetiikan mittaaminen on olennaista monille tutkimus -, maatalous-tai biotekniikkasovelluksille.
Yksi käyttää tietäen, että bakteerien kasvu on mahdollistaa tarkka määrä bakteeri-kulttuuri saadaan rokottaa toisen kulttuurin tai keskisuuria. Esimerkiksi tiettyjä kasveja, kuten palkokasveja, täytyy olla kasvanut symbioottinen bakteerit tunnetaan rhizobia, että asuttaa kasvien juuret muodostavat kyhmyjä ja ”fix” typpeä muuntaa ilmakehän typpeä ammoniakiksi, joka voidaan hyödyntää kasvi., Maatalouden sovelluksia, tunnettu määrä rhizobia on lisätty turvetta-pohjainen hiili medium, jota käytetään sitten rokottaa palkokasvien siemenet perustaa kasvi-bakteeri-symbioosi.
kasvuanalyysillä voidaan myös tunnistaa bakteerilajeja, jotka voivat hajottaa teollisuusjätettä ja mahdollisesti tuottaa arvokkaita sivutuotteita. Tässä esimerkki, tutkijat tutki miten kasvu media täydentää mustalipeä, jäte puun, massan ja paperin tuotanto, vaikuttaa kasvu ympäristön mikrobien eristää.,
bakteerit ei vain osoittanut tehostetun kasvun kanssa mustalipeä, mutta osoitti myös ”diphasic” kasvu kuvio, joka osoittaa, että läsnä on enemmän kuin yksi hiilen lähteenä mustalipeä, että bakteerit voivat aineenvaihdunta. Yksittäisten komponenttien mustalipeä voitaisiin sitten saatu tarkempia kasvun analyysi.
Lopulta, kasvu mittaukset ovat hyödyllisiä myös kuvaavat bakteereja, jotka on suunniteltu erityisesti teollisiin tarkoituksiin, esimerkiksi kunnostamisen öljyn pilaantumista., Täällä, tutkijat luonut geneettisesti bakteerikantoja, jotka sisältävät entsyymejä hajottamaan hiilivety komponentit öljyä. Kasvun analyysi oli suoritettu, esimerkiksi tarkistaa, että suunniteltu bakteerit on lisääntynyt kasvu kuin normaali bakteerien läsnäolo myrkyllisiä hiilivetyjä, mikä osoittaa suurempaa suvaitsevaisuutta, jonka avulla suunniteltu bakteerit suorittaa niiden pilaantumisen uudelleenjärjestäminen-toiminto.
Olet juuri katsellut Jupiterin video analysointiin bakteerien kasvua hinnat kasvukäyrät., Sinun pitäisi nyt ymmärtää, että eri kasvun vaiheissa bakteeriviljelmät, miten suorittaa kokeilu, jotta saadaan kasvukäyrä käyttäen ajankohtana kokoelma ja sarja laimennus pinnoitus, ja miten kasvun analyysi voidaan soveltaa tutkimus-ja teollisuuskäyttöön. Kuten aina, kiitos katsella!
Leave a Reply