Měření růstu bakterií je základní mikrobiologické techniky, a má široké využití v základním výzkumu, stejně jako v zemědělských a průmyslových aplikací.
bakterie patří mezi nejhojnější formy života na Zemi, které jsou přítomny v každém ekosystému, včetně lidského těla. Některé bakteriální druhy jsou i geneticky velmi učenlivý, a byly využity jako modely výzkumu nebo k výrobě přírodních nebo syntetických výrobků v průmyslovém měřítku., Ne všechny bakteriální druhy však mohou být kultivovány v laboratoři. Pro ty, kteří mohou, důležitou vlastností je rychlost násobení nebo „růstová kinetika“.
Měření bakteriální kultury tempo růstu může informovat vědce o jejich fyziologické a metabolické funkce, a je také užitečné pro získání přesného počtu buněk bakterií pro následné aplikace.,
Toto video vám představí principy růstu bakterií, rychlost analýzy, doložit protokol pro charakterizující rychlost růstu s „růstovou křivku“, a konečně, prozkoumat několik vědy o životním prostředí aplikace pro měření kinetika bakteriálního růstu.
bakterie se obecně množí asexuálně, množí se jednoduchým binárním štěpením, kde se jedna rodičovská buňka rozdělí na dvě identické dceřiné buňky., Za příznivých podmínek růstu, kdy jsou živiny dostupné v hojnosti a parametry prostředí, jako je teplota, přispívají k růstu, míra násobení daleko přesahuje míru úmrtnosti. To má za následek exponenciální růst.
měřením množství bakterií v kultuře jako funkce času lze získat růstovou křivku. Pěstování bakterií v kapalné kultuře za optimálních podmínek vytváří růstovou křivku s charakteristickým tvarem, který lze rozdělit do různých fází., Křivka začíná „lagovou fází“, kdy je růst pomalý, zatímco bakterie se aklimatizují na podmínky kultury. Další je “ log „nebo“ exponenciální fáze“, kdy bakterie zažívají exponenciální růst. Růst se nakonec zastaví, jakmile se živiny vyčerpají a hromadí se odpadní produkty, což vede k „stacionární fázi“. Konečně, jakmile je míra násobení překonána rychlostí buněčné smrti, kultura vstupuje do „fáze smrti“.,
pro vytvoření růstové křivky se bakteriální čísla v baňce kapalné kultury počítají v různých časových bodech po určitou dobu kultivace. Počet bakterií lze získat řadou různých metod. Jedním společným přístupem je měření optické hustoty-nebo “ OD “ – 600, což je absorbance světla bakteriálního roztoku při vlnové délce 600 nm.
další metodou je stanovení“ CFU “ nebo jednotek tvořících kolonie na mililitr kultury., Vzhledem k klonální povaze bakteriálního růstu může jedna bakterie v kultuře teoreticky expandovat do jedné pozorovatelné kolonie na agarové desce. Nanesením sérii ředění bakteriální kultury do bakteriální koncentrace, kde individuální, diskrétní kolonie lze pozorovat, metoda zvaná „sériové ředění plating“, počet kolonií může být použit k zálohování-výpočet bakteriální koncentrace z hlediska CFU na mL.,
Nyní, když pochopíte, jak lze analyzovat růst bakterií, projdeme protokolem pro provádění analýzy růstové křivky na čistých kulturách dobře zavedeného bakteriálního modelu, Escherichia coli, pomocí metody sériového ředění.
Jeden den před časový bod odběru, naočkování 20 mL pre-sterilizovány tryptikázov vývar, nebo TSB, média v 50 mL baňce s jedním kolonie E. coli.
inkubujte kulturu přes noc při 37 ° C třepáním. U E. coli by to mělo za následek stacionární fázovou populaci přibližně 109 CFU / ml.,
následující den naočkujte 100 µL jednodenní kultury do 250 mL TSB v baňce o objemu 500 ml. Promíchat. To vytváří zředěnou kulturu přibližně 4 x 105 CFU / ml. Uchovávejte 5 mL této zředěné kultury do kultivační trubice. Toto je aliquot z časového bodu 0 nebo T0. Ihned chlazte při 4 °c.
inkubujte zbývající objem kultury při 37 ° C třepáním. Každou hodinu po dobu až 8 hodin sbírejte z kultury 5 mL alikvotů. Označte tyto vzorky T1 až T8 a všechny je uchovávejte při 4 ° C až do použití.,
v den experimentu odstraňte alikvoty časového bodu E. coli z chladničky a udržujte je na ledu. Používat sterilní zkumavky microfuge, každý s 900 µL sterilního fyziologického roztoku, nastavit ředicí řadu pro každé poměrné části podle následující tabulky.
Mix T0 kultury tak jemně míchání ve vortexové třepačce, pak přidat 100 µL do Zkumavky A jeho ředění série, takže 1-v-10, nebo ředění 10-1. Vírová trubice a se promíchá a pomocí čerstvého hrotu pipety přidá 100 µL zkumavky a do zkumavky B, čímž se zředí 1 v 100 nebo 10-2.,
opakujte postup pro každý kultivační alikvot a proveďte odpovídající ředicí sérii podle tabulky 2. Jakmile byla provedena řada ředění pro všechny vzorky časového bodu, připravte vhodný počet sterilních sójových agarových desek trypticase připravených pro bakteriální pokovování.
3 ředění každé kultury časového bodu bude pokoveno ve trojím vyhotovení podle následující tabulky. Podle toho označte desky. Poté pipetujte 100 µL každé vhodně zředěné kultury na střed příslušné agarové desky., Plamen-sterilizujte skleněnou tyč ve tvaru „L“, ochlaďte dotykem tyče na agar od inokula a okamžitě roztáhněte kapalinu na povrch agaru. Vezměte prosím na vědomí, že zpoždění šíření by mohlo vést k přerůstání bakterií v místě očkování.
pokračujte v pokovování každé ředicí řady pro všechny kultury s časovým bodem 9 a sterilizujte tyč šíření skla mezi každou ředicí sérií.
jakmile se destičky nechají několik minut uschnout, převraťte je a přes noc vložte do inkubátoru o teplotě 37 °C. Po tomto období růstu mohou být desky skladovány při 4 °C.,
po noční inkubaci ředicích destiček je zkontrolujte, zda nedošlo ke kontaminaci a jednotnosti kolonií. Pro každou kulturu časového bodu vyberte ředění, pro které je mezi 30-300 koloniemi na desku. Spočítejte počet kolonií na každé z trojitých desek pro toto ředění.
pomocí průměrného počtu kolonií pro každé ředění a ředicího faktoru Vypočítejte koncentraci bakterií v původní kultuře v každém časovém bodě v CFU / ml. Například, pokud jsou v průměru 30 kolonie z trojitého desky sady získané z 0.,1 mL ředění 10-4 nebo 1 v 10 000, pak by bylo 30 děleno 0,1 mL vynásobeno 10 000 nebo 3 miliony CFU / ml.
Pomocí bakteriální koncentrace vypočtená pro každý časový bod, do grafu základu 10 log bakteriální koncentrace, v CFU/mL, proti čas v hodinách. Z grafu určete log fáze růstu původní bakteriální kultury a vybrat dva časové body do log fáze, s vyznačením první z těchto časových bodů, jak je t = 0., Vypočítejte střední generace čase pomocí rovnice X = 2 k síle n násobí X0, kde X je bakteriální koncentrace v čase t, X0 je počáteční koncentrace v čase t = 0, a n je počet generací, které uplynulo mezi dvěma časovými body.
například předpokládejme, že x0 je 1 000 CFU/mL a při T = 6 h je koncentrace 16 000 CFU / ml. Pomocí rovnice získáme, že během 6 h došlo ke 4 generacím, což dává generační čas 6 dělený 4 nebo 1, 5 h na generaci.,
měření kinetiky bakteriálního růstu je zásadní pro mnoho aplikací pro výzkumné, zemědělské nebo bioinženýrské účely.
jedním z použití pro poznání rychlosti růstu bakterií je umožnit získání přesného množství bakteriální kultury k očkování jiné kultury nebo média. Například některé plodiny, jako jsou luštěniny, musí být pěstovány s symbiotické bakterie, známé jako rhizobia, které kolonizují rostliny kořeny tvořit uzlíky a „fix“ dusíku – konverze atmosférického dusíku na amoniak, který může být využit rostlinou., Pro zemědělské aplikace, známého množství rhizobia je přidán do rašeliny na bázi uhlíku médium, které je pak použijí pro naočkování semena luskovin k navázání rostliny-bakteriální symbiózy.
analýza růstu může být také použita k identifikaci bakteriálních druhů, které mohou degradovat průmyslový odpad a případně vytvářet cenné vedlejší produkty. V tomto příkladu vědci zkoumali, jak růstová média doplněná černým likérem, odpadním produktem ze dřeva a výroby papíru, ovlivnila růst environmentálního mikrobiálního izolátu.,
bakterie nejen prokázaly zvýšení růstu s černým alkoholem, ale také ukázal „diphasic“ struktury růstu, což ukazuje na přítomnost více než jednoho zdroje uhlíku v černý louh, že bakterie dokáží metabolizovat. Jednotlivé složky černého likéru by pak mohly být extrahovány pro podrobnější analýzu růstu.
konečně, měření rychlosti růstu jsou také užitečné pro charakterizaci bakterií, které byly navrženy pro konkrétní průmyslové účely, například pro sanaci znečištění ropou., Zde vědci vytvořili geneticky upravené bakteriální kmeny, které obsahují enzymy, které degradují uhlovodíkové složky oleje. Růst analýza byla provedena, například ověřit, že modifikovaných bakterií zvýšil tempo růstu, než je obvyklé bakterie v přítomnosti toxických uhlovodíků, což naznačuje větší toleranci, která umožní inženýrství bakterií provést jejich znečištění funkce vyčištění.
právě jste sledovali Joveho video o analýze rychlosti růstu bakterií s růstovými křivkami., Nyní byste měli pochopit různé fáze růstu bakteriální kultury, jak provést experiment pro získání růstové křivky pomocí časového bodu sběr a sériové ředění, oplechování, a jak růst analýzy mohou být použity pro výzkumné a průmyslové účely. Jako vždy, díky za sledování!
Leave a Reply