măsurarea ratei de creștere a bacteriilor este o tehnică microbiologică fundamentală și are o utilizare pe scară largă în cercetarea de bază, precum și în aplicațiile agricole și industriale.bacteriile sunt printre cele mai abundente forme de viață de pe Pământ, fiind prezente în fiecare ecosistem, inclusiv în corpul uman. Anumite specii bacteriene sunt, de asemenea, genetic extrem de maleabil, și au fost identificate ca modele de cercetare sau pentru a produce natural sau sintetic, produse la scară industrială., Cu toate acestea, nu toate speciile bacteriene pot fi cultivate în laborator. Pentru cei care pot, o caracteristică importantă este rata de multiplicare sau”cinetica creșterii”.măsurarea ratei de creștere a unei culturi bacteriene poate informa oamenii de știință despre funcțiile lor fiziologice și metabolice și este, de asemenea, utilă pentru obținerea unui număr precis de celule ale bacteriilor pentru aplicații în aval.,acest videoclip va introduce principiile din spatele analizei ratei de creștere a bacteriilor, va demonstra un protocol pentru caracterizarea ratei de creștere cu o „curbă de creștere” și, în final, va explora mai multe aplicații științifice ale mediului pentru măsurarea cineticii creșterii bacteriene.
bacteriile se reproduc în general asexuat, înmulțind prin fisiune binară simplă în care o celulă parentală se împarte în două celule fiice identice., În condiții favorabile de creștere, în care nutrienții sunt disponibili din abundență, iar parametrii de mediu, cum ar fi temperatura, conduc la creștere, rata de înmulțire depășește cu mult rata mortalității. Aceasta are ca rezultat o creștere exponențială.prin măsurarea cantității de bacterii dintr-o cultură în funcție de timp, se poate obține o curbă de creștere. Cultivarea bacteriilor într-o cultură lichidă în condiții optime produce o curbă de creștere cu o formă caracteristică care poate fi împărțită în diferite faze., Curba începe cu o” fază de întârziere”, când creșterea este lentă, în timp ce bacteriile se aclimatizează la condițiile de cultură. Următorul este „jurnalul” sau „faza exponențială”, când bacteriile se confruntă cu o creștere exponențială. În cele din urmă, creșterea se oprește odată ce nutrienții se epuizează și se acumulează deșeuri, rezultând o „fază staționară”. În cele din urmă, odată ce rata de înmulțire este depășită de rata morții celulare, cultura intră în „faza morții”.,pentru a construi o curbă de creștere, numerele bacteriene dintr-un balon de cultură lichidă sunt numărate în diferite momente de timp într-o anumită perioadă de cultivare. Numărul de bacterii poate fi obținut printr-o serie de metode diferite. O abordare comună este măsurarea densității optice-sau” OD ” – 600, care este absorbția luminii soluției bacteriene la o lungime de undă de 600 nm.o altă metodă este de a determina „CFU”, sau unități care formează colonii, pe mililitru de cultură., Datorită naturii clonale a creșterii bacteriene, o bacterie dintr-o cultură se poate extinde teoretic într-o colonie observabilă pe o placă de agar. Prin placarea unei serii de diluții ale unei culturi bacteriene pentru a ajunge la o concentrație bacteriană în care pot fi observate colonii individuale, discrete, o metodă numită „placare de diluare în serie”, numărul de colonii poate fi utilizat pentru a calcula înapoi concentrația bacteriană în termeni de CFU pe mL.,acum că înțelegeți cum poate fi analizată creșterea bacteriană, să parcurgem un protocol pentru efectuarea analizei curbei de creștere pe culturi pure ale unui model bacterian bine stabilit, Escherichia coli, folosind metoda de placare cu diluare în serie.cu o zi înainte de colectarea punctului de timp, inoculați 20 mL de bulion de soia tripticază pre-sterilizat sau mediu TSB într-un balon de 50 mL cu o singură colonie de E. coli.se incubează cultura peste noapte la 37 °C cu agitare. Pentru E. coli, aceasta ar avea ca rezultat o populație staționară de fază de aproximativ 109 CFU/mL.,a doua zi, se inoculează 100 µL de cultură peste noapte în 250 mL de TSB într-un balon de 500 mL. A se amesteca bine. Aceasta produce o cultură diluată de aproximativ 4 x 105 CFU/mL. Depozitați 5 mL din această cultură diluată într-un tub de cultură. Aceasta este alicota de la punctul de timp 0, sau T0. Refrigerați imediat la 4 °C.
incubați volumul rămas al culturii la 37 °C cu agitare. La fiecare oră după aceea, timp de până la 8 ore, colectați alicote de 5 mL din cultură. Desemnați aceste probe de la T1 la T8 și păstrați-le pe toate la 4 °C până la utilizare.,în ziua experimentului, scoateți alicotele punctului de timp E. coli din frigider și păstrați-le pe gheață. Utilizați tuburi sterile de microfuge, fiecare cu 900 µL de soluție salină sterilă, pentru a stabili o serie de diluare pentru fiecare alicotă, conform tabelului următor.
Se amestecă bine cultura T0 prin vortexare ușoară, apoi se adaugă 100 µL în tubul A din seria sa de diluare, făcând o diluție 1-în-10 sau 10-1. Tubul Vortex A se amestecă și, folosind un vârf de pipetă proaspăt, se adaugă 100 µL de tub A în tubul B, făcând diluția 1-în-100 sau 10-2.,se repetă procedeul pentru fiecare alicotă de cultură și se realizează seriile de diluare corespunzătoare conform tabelului 2. Odată ce seria de diluare pentru toate probele punct de timp au fost făcute, au numărul corespunzător de plăci sterile de agar de soia tripticază pregătite pentru placare bacteriană.
3 diluții din fiecare cultură punct de timp vor fi placate în trei exemplare conform tabelului următor. Etichetați plăcile în consecință. Apoi, pipetați 100 µL din fiecare cultură diluată corespunzător pe centrul plăcii de agar respective., Flacără-sterilizați o tijă de sticlă în formă de „L”, răciți atingând tija la agar departe de inocul și împrăștiați imediat lichidul pe suprafața agarului. Vă rugăm să rețineți că o întârziere în răspândirea ar putea duce la overgrowth bacteriene la locul de inoculare.continuați placarea fiecărei serii de diluare pentru toate cele 9 culturi punctuale, sterilizând cu flacără tija de împrăștiere a sticlei între fiecare serie de diluare.după ce plăcile au fost lăsate să se usuce timp de câteva minute, inversați-le și puneți-le în incubatorul de 37 °C peste noapte. După această perioadă de creștere, plăcile pot fi depozitate la 4 °C.,după incubarea peste noapte a plăcilor de diluare, examinați-le pentru contaminarea și uniformitatea coloniilor. Pentru fiecare cultură punct de timp, alegeți o diluție pentru care există între 30-300 colonii pe placă. Numărați numărul de colonii pe fiecare dintre plăcile triplicate pentru acea diluție.
folosind numărul mediu de colonii pentru fiecare diluție și factorul de diluare, se calculează concentrația bacteriilor din cultura inițială la fiecare punct de timp în CFU/mL. De exemplu, dacă există în medie 30 de colonii din setul de plăci triplicate obținut de la 0.,1 mL din diluția 10-4 sau 1-în-10.000, atunci ar fi 30 împărțit la 0,1 mL înmulțit cu 10.000 sau 3 milioane CFU/mL.folosind concentrația bacteriană calculată pentru fiecare punct de timp, trasați un grafic al Jurnalului de bază-10 al concentrațiilor bacteriene, în CFU/mL, în funcție de timp în ore. Din grafic, identificați faza log a creșterii culturii bacteriene originale și alegeți două dintre punctele de timp din faza log, desemnând primul dintre aceste puncte de timp ca t = 0., Calculați timpul mediu de generare folosind ecuația X este egal cu 2 la puterea lui n înmulțită cu X0 unde X este concentrația bacteriană la momentul t, X0 este concentrația inițială la t = 0 și n este numărul de generații care au trecut între cele două puncte de timp.de exemplu, să presupunem că X0 este de 1.000 CFU / mL, iar la T = 6 h, concentrația este de 16.000 CFU/mL. Folosind ecuația, obținem că 4 generații au avut loc în 6 h, ceea ce dă un timp de generație de 6 împărțit la 4 sau 1,5 h pe generație.,măsurarea cineticii creșterii bacteriene este fundamentală pentru multe aplicații în scopuri de Cercetare, Agricultură sau bioinginerie.o utilizare pentru cunoașterea ratei de creștere a bacteriilor este de a permite obținerea unei cantități exacte dintr-o cultură bacteriană pentru a inocula o altă cultură sau mediu. De exemplu, anumite culturi, cum ar fi leguminoasele, trebuie cultivate cu bacterii simbiotice cunoscute sub numele de rhizobia care colonizează rădăcinile plantelor pentru a forma noduli și a „fixa” azotul – transformând azotul atmosferic în amoniac care poate fi utilizat de plantă., Pentru aplicații agricole, o cantitate cunoscută de rizobie este adăugată la un mediu de carbon pe bază de turbă, care este apoi utilizat pentru inocularea semințelor de leguminoase pentru a stabili simbioza plantă-bacteriană.analiza creșterii poate fi, de asemenea, utilizată pentru a identifica speciile bacteriene care pot degrada deșeurile industriale și, eventual, pot genera produse secundare valoroase. În acest exemplu, cercetătorii au investigat modul în care mediile de creștere completate cu lichior negru, un produs rezidual din producția de lemn și hârtie, au afectat creșterea unui izolat microbian de mediu.,
bacteriile nu numai a demonstrat o creștere sporită cu lichior negru, dar, de asemenea, a arătat o „diphasic” model de creștere, indicând prezența a mai mult de o sursă de carbon în leșia neagră care bacteriile pot metaboliza. Componentele individuale ale lichiorului negru ar putea fi apoi extrase pentru o analiză mai detaliată a creșterii.în cele din urmă, măsurătorile ratei de creștere sunt, de asemenea, utile pentru caracterizarea bacteriilor care au fost proiectate pentru anumite scopuri industriale, de exemplu, pentru remedierea poluării cu petrol., Aici, oamenii de știință au creat tulpini bacteriene modificate genetic care conțin enzime pentru a degrada componentele hidrocarbonate ale uleiului. Analiza creșterii a fost efectuată, de exemplu, pentru a verifica dacă bacteriile proiectate au crescut rata de creștere decât bacteriile normale în prezența hidrocarburilor toxice, indicând o toleranță îmbunătățită care va permite bacteriilor proiectate să își îndeplinească funcția de curățare a poluării.
tocmai ați vizionat videoclipul lui JoVE despre analizarea ratelor de creștere a bacteriilor cu curbe de creștere., Acum ar trebui să înțelegeți diferitele faze de creștere ale culturilor bacteriene, cum să efectuați un experiment pentru a obține o curbă de creștere folosind colectarea punctului de timp și placarea diluării în serie și modul în care analiza creșterii poate fi aplicată în scopuri de cercetare și industriale. Ca întotdeauna, mulțumesc pentru vizionare!
Leave a Reply