a baktériumok növekedési ütemének mérése alapvető mikrobiológiai módszer, és széles körben alkalmazható az alapkutatásban, valamint a mezőgazdasági és ipari alkalmazásokban.
a baktériumok a földön a legelterjedtebb életformák közé tartoznak, minden ökoszisztémában jelen vannak, beleértve az emberi testet is. Egyes baktériumfajok genetikailag erősen nyomon követhetők, kutatási modellként vagy természetes vagy szintetikus termékek ipari méretekben történő előállítására használják őket., Azonban nem minden baktériumfaj tenyészthető a laborban. Azok számára, akik képesek, fontos jellemző a szorzás sebessége vagy a”növekedési kinetika”.
a baktériumkultúra növekedési ütemének mérése a tudósokat fiziológiai és metabolikus funkcióikról tájékoztathatja, valamint hasznos lehet a baktériumok pontos sejtszámának meghatározásához a későbbi alkalmazásokhoz.,
Ez a videó bemutatja a bakteriális növekedési ráta elemzésének alapelveit, bemutatja a növekedési sebesség jellemzésére szolgáló protokollt egy “növekedési görbével”, végül pedig számos Környezettudományi alkalmazást fedez fel a bakteriális növekedési kinetika mérésére.
a baktériumok általában asexuálisan szaporodnak, megszorozva egyszerű bináris hasadással, ahol az egyik szülői sejt két azonos lánysejtre oszlik., Kedvező növekedési körülmények között, ahol a tápanyagok bőségesen rendelkezésre állnak, a környezeti paraméterek, például a hőmérséklet mind elősegítik a növekedést, a szaporodás mértéke messze meghaladja a halálozási arányt. Ez exponenciális növekedést eredményez.
a tenyészetben lévő baktériumok mennyiségének az idő függvényében történő mérésével növekedési görbe érhető el. A baktériumok optimális körülmények között folyékony tenyészetben történő termesztése olyan növekedési görbét eredményez, amelynek jellegzetes alakja különböző fázisokra osztható., A görbe “lag fázissal” kezdődik, amikor a növekedés lassú, miközben a baktériumok hozzászoknak a tenyésztési körülményekhez. Ezután a “napló” vagy “exponenciális fázis”, amikor a baktériumok exponenciális növekedést tapasztalnak. A növekedés végül leáll, ha a tápanyagok kimerülnek, és a hulladékok felhalmozódnak, ami “helyhez kötött fázist” eredményez. Végül, ha a szaporodás sebességét meghaladja a sejthalál aránya, a kultúra belép a “halálfázisba”.,
a növekedési görbe kialakításához a baktériumszámokat egy folyékony tenyészet lombikjában különböző időpontokban számolják egy bizonyos tenyésztési időszak alatt. A bakteriális számításokat számos különböző módszerrel lehet elérni. Az egyik közös megközelítés az optikai sűrűség – vagy az “OD” – 600 mérése, amely a bakteriális oldat 600 nm hullámhosszú fényfelszívódása.
egy másik módszer a kultúra milliliterenkénti “CFU” vagy kolóniaképző egységeinek meghatározása., A bakteriális növekedés klonális jellege miatt egy tenyészetben egy baktérium elméletileg egy megfigyelhető kolóniává bővülhet egy agar lemezen. A bakteriális kultúra hígításainak sorozatának bevonásával olyan bakteriális koncentrációt érhetünk el, ahol egyedi, diszkrét kolóniák figyelhetők meg, egy “soros hígítási bevonatnak” nevezett módszer, a kolónia száma felhasználható a bakteriális koncentráció kiszámításához CFU / mL-ben.,
most, hogy megérted, hogyan lehet elemezni a bakteriális növekedést, menjünk át egy protokollon a jól megalapozott bakteriális modell, az Escherichia coli tiszta kultúráinak növekedési görbe elemzésére, soros hígítási galvanizáló módszerrel.
egy nappal az időpontgyűjtés előtt 20 mL előre sterilizált triptikáz szójalevest vagy TSB-t kell beoltani egy 50 mL-es lombikban, egyetlen E. coli kolóniával.
a tenyészetet 37 °C-on egy éjszakán át rázással inkubáljuk. Az E. coli esetében ez körülbelül 109 CFU/mL álló fázisú populációt eredményezne.,
másnap az egynapos tenyészet 100 µL-ét 250 mL TSB-be kell oltani egy 500 mL-es lombikba. Alaposan keverjük össze. Ez körülbelül 4 x 105 CFU/mL hígított tenyészetet eredményez. A hígított tenyészetből 5 mL-t tenyészetcsőbe kell tárolni. Ez az aliquot a 0. időpontból, vagy T0. Hűtőszekrényben azonnal 4 °C-on.
a tenyészet fennmaradó térfogatát 37 °C-on rázással inkubáljuk. Ezután minden órában legfeljebb 8 órán keresztül gyűjtsön össze 5 mL aliquotot a kultúrából. Jelölje ki ezeket a T1-T8 mintákat, és használatukig mindegyiket 4 °C-on tárolja.,
a kísérlet napján vegye ki a hűtőszekrényből az E. coli időpontot, és tartsa őket jégen. Használjon steril mikrovezérlő csöveket, amelyek mindegyike 900 µL steril sóoldattal rendelkezik, hogy minden egyes aliquothoz hígítási sorozatot állítson be az alábbi táblázat szerint.
a T0 tenyészetet óvatosan vortexálással jól keverjük össze, majd adjunk hozzá 100 µL-t a hígítási sorozat a csőjéhez, 1-in-10 vagy 10-1 hígítással. Vortex cső a keveréshez, majd egy friss pipettacsúcsot használva adjunk hozzá 100 µL a csövet a B csőhöz, így az 1-in-100 vagy 10-2 hígítást végezzük.,
ismételje meg az eljárást minden egyes tenyészet esetében, és a 2. táblázat szerint készítse el a megfelelő hígítási sorozatot. Miután a hígítási sorozat minden alkalommal pont minták készültek, a megfelelő számú steril triptikáz szója agar lemezek elő bakteriális borítás.
minden egyes időpontkultúra 3 hígítását három példányban kell bevonni az alábbi táblázat szerint. Ennek megfelelően címkézze meg a lemezeket. Ezután pipettázzunk 100 µL-t minden megfelelően hígított tenyészetből a megfelelő agarlemez közepére., Láng fertőtleníteni egy “L”-alakú üveg rudat, király megérintésével a rúd a agar távol az oltóanyag, azonnal elterjedt a folyadék, mint a agar felületén. Felhívjuk figyelmét, hogy a terjedés késleltetése bakteriális túlnövekedést eredményezhet az oltás helyén.
folytassa az egyes hígítási sorozatok bevonását mind a 9 időpontos tenyészethez, láng sterilizálva az üveg szórórudat az egyes hígítási sorozatok között.
miután a lemezeket néhány percig hagyjuk megszáradni, fordítsa meg és helyezze őket egy éjszakán át a 37 °C-os inkubátorba. Ezen növekedési időszak után a lemezeket 4 °C-on lehet tárolni.,
a hígítólemezek egynapos inkubálása után vizsgálja meg a telepek szennyeződését és egységességét. Minden egyes időpont-kultúrához válasszon olyan hígítást, amelyre lemezenként 30-300 kolónia van. Számolja meg a kolóniák számát az adott hígításhoz használt három példányban.
az egyes hígításokra és hígítási tényezőkre vonatkozó kolóniák átlagos száma alapján számítsa ki a baktériumok koncentrációját az eredeti tenyészetben minden egyes CFU/mL-es időpontban. Például, ha átlagosan 30 kolónia van a 0-tól kapott hármas lemezkészletből.,1 mL a 10-4, vagy 1-in-10,000, hígítás, akkor nem lenne 30 osztva 0,1 mL szorozva 10,000, vagy 3 millió CFU / mL.
az egyes időpontokra számított baktériumkoncentráció felhasználásával rajzoljon egy grafikont a baktériumkoncentrációk bázis-10 naplójáról CFU / mL-ben, órákon belüli idővel. A gráfból azonosítsa az eredeti baktériumkultúra növekedési fázisát, majd válasszon a log fázison belüli két időpontot, az első ilyen időpontot t = 0-ként jelölve., Számítsa ki az átlagos generációs időt az X egyenlet segítségével 2 az N teljesítményével szorozva X0-rel, ahol X a bakteriális koncentráció a T időpontban, X0 a kezdeti koncentráció t = 0-nál, n pedig a két időpont között eltelt Generációk száma.
például tegyük fel, hogy az X0 1000 CFU/mL, t = 6 óra esetén a koncentráció 16 000 CFU/mL. Az egyenlet segítségével azt kapjuk, hogy 4 generáció történt 6 órán belül, ami 6 generációs időt ad, osztva 4 vagy 1, 5 h-val generációnként.,
a bakteriális növekedési kinetika mérése alapvető fontosságú számos kutatási, mezőgazdasági vagy bioengineering célú alkalmazás számára.
a bakteriális növekedési ütem megismerésének egyik célja, hogy lehetővé tegye egy baktériumkultúra pontos mennyiségének megszerzését egy másik kultúra vagy közeg beoltására. Például bizonyos növényeket, például hüvelyeseket, szimbiotikus baktériumokkal, rizobia néven kell termeszteni, amelyek kolonizálják a növények gyökereit, hogy csomókat képezzenek, és” rögzítsék ” a nitrogén – átalakító légköri nitrogént ammóniává, amelyet a növény felhasználhat., Mezőgazdasági alkalmazásokhoz ismert mennyiségű rizóbiát adnak a tőzeg alapú szénközeghez, amelyet ezután a hüvelyes magvak beoltására használnak a növény-bakteriális szimbiózis létrehozására.
Növekedésanalízis használható olyan baktériumfajok azonosítására is, amelyek lebonthatják az ipari hulladékot, és értékes melléktermékeket hozhatnak létre. Ebben a példában a kutatók azt vizsgálták, hogy a fekete likőrrel kiegészített növekedési közeg, a facsiszolásból és papírgyártásból származó hulladék hogyan befolyásolta a környezeti mikrobiális izolátum növekedését.,
a baktériumok nemcsak fokozott növekedést mutattak a fekete likőrrel, hanem “difázisos” növekedési mintát is mutattak, jelezve egynél több szénforrás jelenlétét a fekete folyadékban, amelyet a baktériumok metabolizálhatnak. A fekete likőr egyes összetevőit ezután részletesebb növekedési elemzésre lehetett kivonni.
végül a növekedési sebesség mérése hasznos a baktériumok jellemzésére is, amelyeket bizonyos ipari célokra terveztek, például az olajszennyezés kármentesítésére., Itt a tudósok genetikailag módosított baktériumtörzseket hoztak létre, amelyek enzimeket tartalmaznak az olaj szénhidrogén komponenseinek lebontására. A növekedés elemzést végezni, például, hogy ellenőrizze, hogy a módosított baktériumok nőtt, a növekedés aránya, mint a normál baktérium jelenlétében a mérgező szénhidrogének, jelezve, javult a tolerancia, amely lehetővé teszi a módosított baktériumok végzik a szennyezés tisztítás funkció.
épp most nézted meg JoVE videóját a baktériumok növekedési ütemének elemzéséről növekedési görbékkel., Most meg kell értened a baktériumkultúrák különböző növekedési fázisait, hogyan kell kísérletet végezni a növekedési görbe elérésére az időpont-gyűjtés és a Soros hígítás felhasználásával, valamint hogyan alkalmazható a növekedési elemzés kutatási és ipari célokra. Mint mindig, köszönöm, hogy figyelte!
Leave a Reply