La mesure du taux de croissance des bactéries est une technique microbiologique fondamentale et est largement utilisée dans la recherche fondamentale ainsi que dans les applications agricoles et industrielles.
Les bactéries sont parmi les formes de vie les plus abondantes sur Terre, étant présentes dans tous les écosystèmes, y compris le corps humain. Certaines espèces bactériennes sont également génétiquement très traçables et ont été exploitées comme modèles de recherche ou pour produire des produits naturels ou synthétiques à l’échelle industrielle., Cependant, toutes les espèces bactériennes ne peuvent pas être cultivées en laboratoire. Pour ceux qui le peuvent, Une caractéristique importante est le taux de multiplication, ou « cinétique de croissance ».
mesurer le taux de croissance d’une culture bactérienne peut informer les scientifiques sur leurs fonctions physiologiques et métaboliques, et est également utile pour obtenir un nombre précis de cellules des bactéries pour des applications en aval.,
Cette vidéo présentera les principes de l’analyse du taux de croissance bactérienne, démontrera un protocole pour caractériser le taux de croissance avec une « courbe de croissance » et, enfin, explorera plusieurs applications des sciences environnementales pour mesurer la cinétique de croissance bactérienne.
Les bactéries se reproduisent généralement de manière asexuée, se multipliant par une simple fission binaire où une cellule parentale se divise en deux cellules filles identiques., Dans des conditions de croissance favorables où les nutriments sont disponibles en abondance et où les paramètres environnementaux tels que la température sont tous propices à la croissance, le taux de multiplication dépasse de loin le taux de mortalité. Cela se traduit par une croissance exponentielle.
en mesurant la quantité de bactéries dans une culture en fonction du temps, une courbe de croissance peut être obtenue. La croissance de bactéries dans une culture liquide dans des conditions optimales produit une courbe de croissance avec une forme caractéristique qui peut être divisée en différentes phases., La courbe commence par une » phase de retard », lorsque la croissance est lente tandis que les bactéries s’acclimatent aux conditions de culture. Vient ensuite le « log » ou « phase exponentielle », lorsque les bactéries connaissent une croissance exponentielle. La croissance finit par s’arrêter une fois que les nutriments sont épuisés et que les déchets s’accumulent, ce qui entraîne une « phase stationnaire ». Enfin, une fois que le taux de multiplication est dépassé par le taux de mort cellulaire, la culture entre dans la « phase de mort ».,
pour construire une courbe de croissance, les nombres bactériens dans un ballon de culture liquide sont comptés à différents moments au cours d’une certaine période de culture. Les dénombrements bactériens peuvent être obtenus par un certain nombre de méthodes différentes. Une approche courante consiste à mesurer la densité optique – ou « OD » – 600, qui est l’absorbance de la lumière de la solution bactérienne à une longueur d’onde de 600 nm.
Une autre méthode consiste à déterminer l ‘ « UFC », ou unités formant colonie, par millilitre de culture., En raison de la nature clonale de la croissance bactérienne, une bactérie dans une culture peut théoriquement se développer en une colonie observable sur une plaque de gélose. En plaquant une série de dilutions d’une culture bactérienne pour atteindre une concentration bactérienne où des colonies individuelles et discrètes peuvent être observées, une méthode appelée « placage de dilution en série », le nombre de colonies peut être utilisé pour rétrocalculer la concentration bactérienne en termes d’UFC par mL.,
maintenant que vous comprenez comment la croissance bactérienne peut être analysée, passons par un protocole pour effectuer une analyse de la courbe de croissance sur des cultures pures d’un modèle bactérien bien établi, Escherichia coli, en utilisant la méthode de dilution en série.
un jour avant le prélèvement ponctuel, inoculer 20 mL de bouillon de soja trypticase pré-stérilisé, ou BST, dans un flacon de 50 mL contenant une seule colonie d’E. coli.
incuber la culture pendant la nuit à 37 °C en secouant. Pour E. coli, il en résulterait une population en phase stationnaire d’environ 109 UFC/mL.,
le lendemain, inoculer 100 µL de la culture de nuit dans 250 mL DE BST dans un flacon de 500 mL. Mélanger soigneusement. Cela produit une culture diluée d’environ 4 x 105 UFC/mL. Conservez 5 mL de cette culture diluée dans un tube de culture. C’est l’aliquote du point de temps 0, ou T0. Réfrigérer immédiatement à 4 °c.
incuber le volume restant de la culture à 37 °C en agitant. Chaque heure après, pendant 8 h maximum, prélever des aliquotes de 5 mL dans la culture. Désignez ces échantillons T1 à T8 et conservez-les tous à 4 °C jusqu’à leur utilisation.,
le jour de l’expérience, retirez les aliquotes du point temporel D’E. coli du réfrigérateur et conservez-les sur de la glace. Utilisez des tubes à microfuge stériles, contenant chacun 900 µL de solution saline stérile, pour établir une série de dilution pour chaque aliquote conformément au tableau suivant.
bien mélanger la culture T0 en tourbillonnant doucement, puis Ajouter 100 µL au Tube A de sa série de dilution, pour obtenir une dilution 1 en 10 ou 10-1. Vortex Tube A à mélanger, et à l’aide d’une pointe de pipette fraîche, ajouter 100 µL de Tube A au Tube B, ce qui rend la dilution 1-en-100, ou 10-2.,
répétez le processus pour chaque aliquote de culture et faites la série de dilution appropriée conformément au Tableau 2. Une fois que la série de dilution pour tous les échantillons de point temporel a été faite, préparez le nombre approprié de plaques de gélose de soja trypticase stériles pour le placage bactérien.
3 dilutions de chaque culture ponctuelle seront plaquées en trois exemplaires selon le tableau suivant. Étiquetez les plaques en conséquence. Ensuite, pipeter 100 µL de chaque culture diluée de manière appropriée sur le centre de la plaque de gélose respective., Stérilisez à la flamme une tige de verre en forme de « L », refroidissez en touchant la tige à la gélose loin de l’inoculum et étalez immédiatement le liquide sur la surface de la gélose. Veuillez noter qu’un retard dans la diffusion pourrait entraîner une prolifération bactérienne à l’endroit de l’inoculation.
continuer à plaquer chaque série de dilution pour les 9 cultures temporelles, en stérilisant à la flamme la tige d’épandage de verre entre chaque série de dilution.
Une fois que les plaques ont été laissées sécher pendant quelques minutes, retournez-les et placez-les dans l’incubateur à 37 °C pendant la nuit. Après cette période de croissance, les plaques peuvent être conservées à 4 °c.,
Après une nuit d’incubation des plaques de dilution, examiner la contamination et l’uniformité des colonies. Pour chaque culture ponctuelle, choisissez une dilution pour laquelle il y a entre 30 et 300 colonies par plaque. Comptez le nombre de colonies sur chacune des plaques en trois exemplaires pour cette dilution.
en utilisant le nombre moyen de colonies pour chaque dilution et le facteur de dilution, calculer la concentration de bactéries dans la culture originale à chaque point temporel en UFC / mL. Par exemple, s’il y a en moyenne 30 colonies de l’ensemble de plaques en trois exemplaires obtenu à partir de 0.,1 mL de la dilution 10-4, ou 1 sur 10 000, alors il y aurait 30 divisé par 0,1 mL multiplié par 10 000, ou 3 millions D’UFC/mL.
en utilisant la concentration bactérienne calculée pour chaque point temporel, tracer un graphique du log de base 10 des concentrations bactériennes, en UFC / mL, contre le temps en heures. À partir du graphique, identifiez la phase logarithmique de croissance de la culture bactérienne d’origine et choisissez deux des points temporels dans la phase logarithmique, en désignant le premier de ces points temporels comme t = 0., Calculer le temps de génération moyen en utilisant L’équation X est égal à 2 à la puissance de n multipliée par X0 où X est la concentration bactérienne au temps t, X0 est la concentration initiale à t = 0 et n est le nombre de générations qui se sont écoulées entre les deux points temporels.
par exemple, supposons que X0 soit de 1 000 UFC/mL et qu’à t = 6 h, la concentration soit de 16 000 UFC / mL. En utilisant l’équation, nous obtenons que 4 générations se sont produites en 6 h, ce qui donne un temps de génération de 6 divisé par 4 ou 1,5 h par génération.,
la mesure de la cinétique de croissance bactérienne est fondamentale pour de nombreuses applications à des fins de recherche, d’agriculture ou de bio-ingénierie.
une utilisation pour connaître le taux de croissance bactérienne est de permettre d’obtenir une quantité précise d’une culture bactérienne pour inoculer une autre culture ou un autre milieu. Par exemple, certaines cultures, telles que les légumineuses, doivent être cultivées avec des bactéries symbiotiques connues sous le nom de rhizobia qui colonisent les racines des plantes pour former des nodules et « fixer » l’azote – convertissant l’azote atmosphérique en ammoniac qui peut être utilisé par la plante., Pour les applications agricoles, une quantité connue de rhizobia est ajoutée à un milieu carboné à base de tourbe, qui est ensuite utilisé pour inoculer des graines de légumineuses afin d’établir la symbiose plante-bactérie.
l’analyse de croissance peut également être utilisée pour identifier les espèces bactériennes qui peuvent dégrader les déchets industriels et éventuellement générer des sous-produits précieux. Dans cet exemple, les chercheurs ont étudié comment les milieux de croissance additionnés de liqueur noire, un déchet provenant de la réduction en pâte de bois et de la production de papier, affectaient la croissance d’un isolat microbien environnemental.,
Les bactéries ont non seulement montré une croissance améliorée avec la liqueur noire, mais ont également montré un modèle de croissance « diphasique », indiquant la présence de plus d’une source de carbone dans la liqueur noire que les bactéries peuvent métaboliser. Des composants individuels de la liqueur noire ont ensuite pu être extraits pour une analyse de croissance plus détaillée.
enfin, les mesures du taux de croissance sont également utiles pour caractériser les bactéries qui ont été conçues à des fins industrielles particulières, par exemple pour remédier à la pollution par les hydrocarbures., Ici, les scientifiques ont créé des souches bactériennes génétiquement modifiées qui contiennent des enzymes pour dégrader les composants hydrocarbonés du pétrole. Une analyse de croissance a été effectuée, par exemple, pour vérifier que les bactéries modifiées ont un taux de croissance plus élevé que les bactéries normales en présence des hydrocarbures toxiques, indiquant une tolérance améliorée qui permettra aux bactéries modifiées d’effectuer leur fonction de nettoyage de la pollution.
vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’analyse des taux de croissance bactérienne avec des courbes de croissance., Vous devez maintenant comprendre les différentes phases de croissance des cultures bactériennes, comment effectuer une expérience pour obtenir une courbe de croissance en utilisant la collecte de points de temps et le placage de dilution en série, et comment l’analyse de croissance peut être appliquée à la recherche et à des fins industrielles. Comme toujours, merci pour regarder!
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